玉米赤霉烯酮吸附劑對后備母豬子宮中LC3、PCNA分布和表達的影響

黃麗波，王金全，高文博，陳紅菊，侯衍猛，袁學軍，王春陽?

1山東農業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271000；2中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081； 3山東農業(yè)大學生命科學學院，山東泰安 271000

0 引言

【研究意義】由鐮刀菌產生的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）在霉變糧食中最為常見[1]，已有研究證實ZEA在動物體內產生的生物學反應與雌二醇類似[2-4]，影響子宮內膜細胞的生長[5]、卵母細胞的成熟及卵泡顆粒細胞的增殖[6]。盡管ZEA與雌激素受體的親和力較低，但是ZEA可通過與雌激素受體的作用而激活雌激素敏感基因，產生生殖毒性?！厩叭搜芯窟M展】大量研究證實攝入一定量的ZEA污染食物可導致生殖器官發(fā)生病變或功能障礙[7]，母豬不發(fā)情的比率升高，ZEA增加青春期的母豬假孕的發(fā)病率，繁殖率大大降低[8]，而且以仔豬表現(xiàn)更為明顯[9-12,13]，而RAINEY等[14-15]認為ZEA對于青春期前的母豬不會引起其青春期發(fā)情時間的推遲，而母豬隨后的繁殖能力并沒有受到損害。ZEA對生殖細胞毒性作用的研究結果表明，ZEA能引起牛卵母細胞的染色體結構異常[7]，也可以造成精子染色體結構異常[16]，ZEA導致細胞凋亡、DNA片段化以及產生微核等病理變化，并具有濃度依賴性[17]?！颈狙芯壳腥朦c】自噬是細胞維持自身的穩(wěn)態(tài)保護機制[18-19]，但關于ZEA對子宮內自噬蛋白LC3的影響還未見相關報道。在飼料中添加霉菌毒素吸附劑是目前普遍采用的解決霉菌毒素污染問題的方法。通過減少消化系統(tǒng)對霉菌毒素的吸收率，進而減弱霉菌毒素對動物機體的影響。目前，已經有大量關于吸附劑的研究[10,20-22]，雖然天然和合成的吸附劑都可以吸附霉菌毒素，降低其在動物機體內的毒性，但吸附效率不同，其主要取決于每種吸附劑的特性和相應毒素的特性?！緮M解決的關鍵問題】本文通過觀察母豬采食不同濃度由沸石+蒙脫石及生物制劑等組成的復合ZEA吸附劑處理的飼料后子宮中LC3與PCNA表達變化，從組織化學角度探討該ZEA新型吸附劑的脫毒效果。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

選擇體重為30±2.11 kg左右的健康三元雜交（杜×長×大）雜交后備母豬48頭作為試驗動物。將后備母豬隨機分為6組，每組 8頭，對照組（control）飼喂基礎飼糧（含有 ZEA 0.195 mg·kg-1，嘔吐毒素（DON） 1.27 mg·kg-1，煙曲霉毒素（FUM）5.29 mg·kg-1）、玉米赤霉烯酮組（ZEA）飼喂含有 1.0 mg·kg-1ZEA（ZEA 1.008 mg·kg-1，DON 1.43 mg·kg-1，F(xiàn)UM 5.85 mg·kg-1）的飼糧、0.1%新型吸附劑組（ZEA0.1）飼喂含有1.0 g·kg-1新型吸附劑（沸石+蒙脫石及生物制劑等復合制劑）的玉米赤霉烯酮組日糧、0.25%新型吸附劑組（ZEA0.25）飼喂含有 2.5 g·kg-1新型吸附劑的玉米赤霉烯酮組日糧、0.5%新型吸附劑組（ZEA0.5）飼喂含有5.0 g·kg-1新型吸附劑的玉米赤霉烯酮組日糧、蒙脫石組（ZEA+M）飼喂含有2.5 g·kg-1蒙脫石的玉米赤霉烯酮組日糧。預試期7d，正試期 21 d。本試驗是2018年完成于山東農業(yè)大學創(chuàng)新科技園區(qū)動科試驗站。

后備母豬飼養(yǎng)標準參考NRC（2012）推薦的飼糧配制量。同時先進行飼糧中黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）、ZEA、DON和FUM含量的檢測，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）Table 1 Ingredients and nutrient levels of basal diet (air dry basis)

1.2 試驗日糧的配制

ZEA日糧[9]：ZEA色譜純度達98%，購自以色列Fermentek 公司。先將30 g的 ZEA粉溶解在3.0 L乙酸乙酯中制成溶液，再將該乙酸乙酯溶液噴灑到30 kg滑石粉載體上，放置過夜，使乙酸乙酯完全揮發(fā)，制成ZEA預混劑，然后再用玉米粉（制備基礎日糧）進一步稀釋成含量為10 mg·kg-1的 ZEA 玉米粉預混劑，最后按照試驗日糧中 ZEA的設計水平，用 ZEA 玉米粉預混劑替代配方中的玉米和載體配制成添加量為1.0 mg·kg-1ZEA組試驗日糧。

吸附劑日糧：在ZEA組試驗日糧基礎上按照相應的設計比例進行添加試驗用的吸附劑進行日糧配制。新型吸附劑成分由沸石、蒙脫石及生物制劑等按照一定比例制成的復合制劑（前期體外吸附試驗結果已經確定了沸石、蒙脫石及生物制劑等的合適配比，新型吸附劑由王金全實驗室研制）。

所有的試驗飼料需要在試驗開始前一周一次性配制完成，并進行養(yǎng)分含量分析及毒素水平檢測（采用HPLC高壓液相法）工作，日糧毒素含量檢測結果：基礎日糧 ZEA 水平為 0.195 mg·kg-1、DON 為 1.27 mg·kg-1、FUM 為 5.29 mg·kg-1，ZEA 組日糧的 ZEA 含量為 1.008 mg·kg-1、DON 為 1.43 mg·kg-1、FUM 為5.85 mg·kg-1。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 樣本采集 試驗結束后，將豬電擊放血致死，迅速取出子宮，稱重并采集兩份樣品，一份液氮中速凍后-80℃冰箱保存，用于進行檢測 LC3 、PCNA的mRNA 及蛋白相對表達量。另一份樣品置于Bouin’s液中固定，用于免疫組化分析。

1.3.2 免疫組化（超敏二步法） 取 Bouin’s 液中固定好的子宮組織進行流水沖洗，經常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后，制成石蠟組織塊，用切片機（LEICA RM2135，德國）制成5 μm厚的連續(xù)切片。

免疫組化程序：將子宮組織進行石蠟切片經常規(guī)脫蠟、脫苯至水后，置于 0.01 mol·L-1，pH 6.0 的檸檬酸緩沖液中進行抗原熱修復（微波修復）3次，5 min/次，而后經 PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.2）洗 3 次，5 min/次（PBS洗，下同）；再用10 % H2O2進行阻斷內源性過氧化物酶，37 ℃恒溫箱內孵育 30 min，PBS洗3次；第四步加5% 胎牛血清在37℃恒溫箱內孵育1 h，以封閉組織和試劑中的游離電荷；第五步：甩去組織上的血清，加兔抗LC3多克隆抗體（1﹕200，bs-8878R，北京博奧森生物技術有限公司）和鼠抗PCNA單克隆抗體（1﹕200，ZM-0213，北京中杉金橋生物技術有限公司），4 ℃冰箱內孵育過夜，次日用PBS 洗3次后滴加二抗，按照抗兔/抗鼠 Polink-2 plus? 超敏二步法免疫組化檢測試劑盒說明進行操作（PV-9001/9002，北京中杉金橋生物技術有限公司）。顯色：用 DAB在顯微鏡下進行顯色（RA110，TIANGEN），最后用蘇木精復染，經過上行脫水、透明、封片處理，觀察結果。陰性對照的一抗采用 PBS 代替，其他步驟相同。

1.3.3 子宮LC3、PCNA的mRNA相對表達量檢測 根據GenBank報道的豬的LC3、PCNA和GAPDH基因序列，設計相應的特異性引物，送至華大公司進行引物合成（表2）。

在高粱種植過程當中，種植人員要做好田間管理工作，促進高粱根系的發(fā)育成長，確保高粱茁壯成長，為后期高粱成長提供重要的保障基礎。當苗長出3片葉時，此時需要做好除草與間苗工作，確保其密度合理，提升整齊度。間苗時，需要除去若苗，留住壯苗與健壯苗。當高粱苗長出4片葉時，按照每穴一株的標準進行定苗操作。如若出現(xiàn)缺株的情況下，需要對其進行及時補株，在進行間苗與定苗時，需要確保該工作在晴天下午進行。主要是為了降低養(yǎng)分與水分的消耗，為幼苗成長提供重要的條件基礎。

表2 RT-PCR反應的引物序列Table 2 primer sequences of RT-PCR reaction

子宮總 RNA的提取用 Trizol 法，分析RNA濃度和純度，根據PrimeScript RT Master Mix 反轉錄試劑盒（RR036A，TaKaRa）說明進行試驗操作，反轉錄的反應體系總體積是20 μL。

qRT-PCR 試驗按照 SYBR Premix? Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（DRR420A，TaKaRa）試劑盒說明進行。反應體系總體積為 20 μL，體系組成：dH2O 6.8 μL；SYBR Primerx Ex Taq 10 μL；上游引物 0.4μL；下游引物 0.4 μL；cDNA 2 μL（＜100 ng）；ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL。每個子宮樣品進行3個重復。擴增反應使用儀器為 ABI 7500 Real-time PCR 儀，反應條件：預變性 30s、95 ℃，變性 5s、95 ℃，退火延伸 34s、60 ℃，15s、95 ℃，60s、60 ℃，15 s、95 ℃，40個循環(huán)。

1.3.4 LC3與PCNA的Western blot分析 將 -80℃冰箱保存的50—70 mg子宮組織經液氮研磨后提取總蛋白質，BCA法測子宮總蛋白濃度。電泳的上樣體積為20 μL，蛋白含量50 μg，經電泳分離蛋白、轉膜后，將PVDF膜置于5% 脫脂奶粉中，在室溫封閉孵育2 h后，分別添加一抗（兔抗 LC3多克隆抗體，1﹕300，北京博奧森生物技術有限公司；鼠抗PCNA單克隆抗體，1﹕350，ZM-0213，北京中杉金橋生物技術有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，1﹕300，碧云天生物技術有限公司），并在4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗 3次，10min/次；再加二抗（山羊抗鼠IgG，1﹕2 000，康為世紀，山羊抗兔 IgG，1﹕2 000，康為世紀），37℃恒溫箱孵育 2 h，TBST 洗 3次； ECL法顯色（BeyoECL Plus P0081，碧云天生物技術有限公司），圖像采集用Fusion FX7高端多功能成像系統(tǒng)（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）。

1.4 數據分析

采用 Image pro-Plus 6.0 軟件分析子宮腔上皮和腺上皮的免疫陽性反應物質的累積光密度（Integrated optic density, IOD）。運用 2-△△CT方法分析 mRNA 的相對表達量。Western blot統(tǒng)計結果是以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示。采用SPSS17.0 軟件統(tǒng)計分析試驗數據，以平均值±標準誤（mean±SEM）表示。

2 結果

2.1 子宮器官指數

ZEA引起后備母豬子宮器官指數（子宮重g/體重kg）顯著增加，在添加新型吸附劑后，子宮器官指數均明顯降低，與ZEA組差異顯著（P＜0.05），ZEA0.25組與對照組相近。提示添加一定劑量的新型吸附劑能夠減弱子宮的異常增殖情況的發(fā)生，添加蒙脫石吸附劑（ZEA-M）組的子宮器官指數降低效果也較好（P＜0.05）。

表3 子宮器官指數Table 3 The organ index of uterus

2.2 子宮 LC3 分布

免疫組化結果顯示在后備母豬的子宮細胞胞質內LC3 陽性反應物質呈黃色和棕黃色。子宮中的 LC3陽性細胞主要分布在子宮腺上皮，而腔上皮次之，組間 LC3的分布與陽性反應強弱差別明顯（圖 1-A1、B1、C1、D1、E1、F1）。而固有層的基質細胞與肌層的平滑肌細胞胞質內未見有 LC3免疫陽性物質存在。

對照組的子宮腺上皮LC3陽性細胞的胞質呈棕褐色，強陽性表達。在腔上皮細胞內（圖1-A3）的LC3免疫陽性反應弱于腺上皮細胞（圖1-A2、A4）。

ZEA組LC3陽性反應明顯弱于對照組，在子宮腺上皮中可見少量 LC3陽性反應細胞分布（圖 1-B2、B4），胞質呈弱陽性反應，染成黃色；在子宮腔上皮細胞偶見呈淡黃色的LC3弱陽性物質分布（圖1-B3）。

ZEA0.1（圖 1-C2、C3、C4）、ZEA0.25（圖 1-D2、D3、D4）和ZEA0.5組（圖1-E2、E3、E4）的LC3陽性細胞分布的觀察結果顯示均較ZEA組增強，腺上皮細胞的免疫陽性反應及陽性細胞數量明顯增加，呈棕黃色（圖 1-C2、D2、E2、C4、D4、E4）：腔上皮細胞內偶見呈淡黃色的陽性物質（圖1-C3、D3、E3）。LC3免疫陽性反應及陽性細胞數量存在吸附劑劑量依賴趨勢。但ZEA0.5組LC3免疫陽性反應仍弱于對照組（圖1-A3、A4）。

ZEA-M組的LC3免疫陽性細胞分布特點及陽性反應強度（圖1- F2、F3、F4）與ZEA組相似（圖1-B3、B4），主要分布在子宮腺上皮（圖1-F2、F3、F4），呈黃色，但陽性細胞數量較ZEA組增多。

2.3 子宮的 PCNA 的分布

后備母豬子宮內PCNA為細胞核著色，免疫陽性反應物質呈深棕色、棕黃色或黃色，子宮內膜腔上皮和腺上皮細胞陽性反應強度相近（圖2-A1、B1、C1、D1、E1、F1），基質細胞與肌層平滑肌細胞胞核內可見有PCNA弱免疫陽性物質分布。

對照組的子宮腺上皮PCNA陽性細胞的胞質呈黃色，弱陽性表達（圖2-A2）。在腔上皮內（圖2-A3）的PCNA免疫陽性細胞比例少于腺上皮（圖2-A4）。

ZEA組PCNA陽性反應明顯強于對照組，呈深棕色，在子宮腔上皮和腺上皮中可見大量PCNA陽性反應細胞分布（圖 2-B3、B4）。肌層內呈現(xiàn)的 PCNA陽性反應的平滑肌細胞明顯增多。

ZEA 0.1（圖2-C3、C4）、ZEA0.25（圖2-D3、D4）和 ZEA0.5組（圖 2-E3、B2、E4）的 PCNA 陽性細胞分布的觀察結果顯示均較ZEA組減弱，腔上皮（圖 2-C3、D3、E3）和腺上皮細胞的陽性反應及陽性細胞數量明顯減少，呈棕黃色（圖2-C2、D2、E2、C4、D4、E4）：PCNA陽性反應及陽性細胞數量存在吸附劑劑量依賴趨勢。但ZEA0.5組（圖2-E3、E4）PCNA陽性反應仍強于對照組（圖2-A3、A4）。

ZEA-M組的PCNA陽性細胞分布特點及陽性反應強度（圖2-F3、F2、F4）與ZEA組相似（圖2-B3、B2、B4），呈棕黃色，但陽性細胞數量較ZEA組減少。

2.4 子宮內LC3及PCNA的陽性反應IOD、蛋白和mRNA相對表達量分析

通過分析子宮腔上皮中的LC3陽性反應的 IOD的結果表明：對照組顯著高于 3個新型吸附劑組及ZEA-M組（P＜0.01，圖3），ZEA0.25組高于ZEA組（P＜0.05，圖3），ZEA-M組最低，但與ZEA組和ZEA0.1差異不顯著（P＞0.05，圖3）；而腺上皮的 IOD結果明顯高于腔上皮，且新型吸附劑組的變化趨勢與腔上皮一致，除ZEA0.1與ZEA-M兩組之間無明顯差異外（P＞0.05，圖 3），其他各組間均呈顯著性差異（P＜0.01，圖 3），ZEA組腺上皮的IOD值最低，對照組腺上皮的 IOD值最高。LC3 mRNA和蛋白相對表達量結果顯示，ZEA組較對照組顯著下降（P＜0.05，圖 3），添加新型吸附劑后LC3蛋白相對表達量增加，ZEA 0.1組、ZEA0.25組較ZEA組LC3升高，mRNA水平上呈顯著性差異（P＜0.05，圖3），但蛋白表達量結果是差異不顯著；ZEA組及 ZEA-M 組相比較差異不顯著（P＞0.05，圖3），ZEA0.5組LC3蛋白表達量最高，但仍低于對照組，無顯著性差異。

子宮腔上皮和腺上皮中 PCNA陽性反應的 IOD的結果與LC3變化趨勢相反（圖4），對照組最低，ZEA組最高，ZEA-M組與ZEA組相近，新型吸附劑3組的PCNA陽性反應的 IOD呈現(xiàn)遞減趨勢，ZEA0.5組顯著低于ZEA0.1、0.25組（P＜0.01，圖4），PCNA mRNA和蛋白相對表達量結果也與 LC3變化趨勢相反，ZEA組表達量最高（P＜0.05，圖4），而ZEA0.5組最低（P＜0.05，圖4）。

3 討論

玉米、小麥、大豆、油菜等各種作物均可以被鐮刀菌侵染，豬對鐮刀菌毒素的毒性作用最易感[8-11]。有關鐮刀菌毒素對人和畜禽影響的研究結果很多，ZEA 不僅影響家畜的飼料轉化效率[10]，增加子宮的體積、重量及器官指數[9，11]，而且可促進卵巢內原始卵泡的提前發(fā)育[11]，而本研究結果發(fā)現(xiàn)飼喂1.0 mg·kg-1ZEA同樣使后備母豬子宮體積增大，器官指數增加，與筆者前期在仔豬上的研究添加 ZEA 的增加效果相一致[11]。

研究顯示ZEA可抑制DNA和蛋白質的合成、干擾細胞分裂周期、抑制細胞活性進而導致細胞凋亡，這是ZEA細胞毒性作用的典型體現(xiàn)，并具有濃度依賴性[17-19]。1962年，ASHFORD 和 PORTER 首次在肝細胞內發(fā)現(xiàn)存在自噬現(xiàn)象。隨后研究顯示細胞自噬是另一種形式的程序性細胞死亡，當細胞處于營養(yǎng)缺乏和壓力等條件下，細胞通過自噬用來補償和維持機體動態(tài)平衡[23]。意味著自噬實際上是機體細胞的一種保護機制，正常狀態(tài)下自噬維持著細胞內的穩(wěn)態(tài)，如果抑制自噬，細胞的生存能力可能會降低，自噬水平的異常（升高或降低）會直接影響生物體及細胞正常生理功能的發(fā)揮，進而導致許多疾病如：腫瘤、阿爾茲海默病的發(fā)生發(fā)展[20]。已經證實LC3是自噬體完成后試驗監(jiān)測的卓越標記[24-25]。近年來，越來越多的證據表明在子宮內膜基質細胞和上皮細胞內發(fā)現(xiàn)存在自噬現(xiàn)象，自噬在與子宮內膜相關的生理和病理生理過程中也起著至關重要的作用，包括周期性月經、正常妊娠期間子宮內膜的蛻膜化或重構等與子宮內膜相關的疾病[26]。ZHOU研究表明，卵巢切除大鼠和圍絕經期女性的子宮內膜發(fā)生萎縮，自噬被激活，使得子宮上皮細胞中 LC3蛋白表達上調[27]。本試驗中添加 1.0 mg·kg-1的ZEA促進豬子宮壁增厚，與子宮萎縮相反，LC3蛋白表達下降的結果與上述試驗結果相一致，本結果也間接提示ZEA抑制了LC3的表達，破壞子宮內膜細胞和腺上皮細胞的穩(wěn)態(tài)，進一步可能引起病理變化。但新型吸附劑使 LC3蛋白表達上調，抵抗由ZEA引起的子宮內膜細胞異常增殖（PCNA表達增加），對細胞起到一定程度的保護作用。這與文獻證實的人子宮內膜細胞中發(fā)生自噬具有促進凋亡作用的結果相一致[28]。DAI等報道[11]，斷奶仔豬飼喂含1.04 mg·kg-1ZEA飼料，導致仔豬生長卵泡異常增殖，PCNA的IOD、蛋白質和mRNA相對表達量均大于對照組。本試驗結果也證實ZEA的添加，誘導后備母豬子宮內PCNA免疫陽性細胞增多，蛋白表達升高。

霉菌毒素吸附劑是目前解決霉菌毒素污染最可行的方法，目前國內市場上有多種霉菌毒素吸附劑產品，但吸附效率和產品質量參差不齊。吸附劑與霉菌毒素結合或者生物降解 ZEA是一個可靠且很有應用前景的策略，但由于成本等現(xiàn)實問題，對于吸附劑的研究一直是當今的研究重點[29-30]。沸石在動物營養(yǎng)中廣泛應用。其能夠使動物更有效地利用飼糧的營養(yǎng)，改善腸道內微生物群落及消化機制，減少動物機體被霉菌毒素損害的影響。沸石和蒙脫石的四面體晶體結構特點十分相似，巨大的表面積使其有較強的離子交換性和吸水膨脹性能；JIANG的試驗結果顯示改性蒙脫石對 ZEA有明顯的脫毒效果[31]。本試驗結果顯示由沸石、蒙脫石及生物制劑等組成的新型吸附劑能夠降低子宮體積和器官指數，緩解子宮的異常增殖，對子宮有保護作用，并且以 0.25%劑量效果較好，較蒙脫石的脫毒效果更佳。而此新型吸附劑使得LC3表達上調、PCNA表達降低也提示新型吸附劑的正向作用效果，對ZEA致子宮增殖肥大毒性的保護作用明顯。本試驗研究結果顯示，在添加新型吸附劑后，隨著吸附劑劑量提高，子宮腔上皮細胞 LC3免疫陽性反應升高，PCNA降低，基本恢復了子宮的正常生理。以0.5%添加劑量效果較好。這與 LIU等證實藏紅花素抑制PCNA的表達對小鼠的子宮內膜異位癥有保護作用的研究結果相一致[32]。

4 結論

后備母豬因為攝入一定量的玉米赤霉烯酮出現(xiàn)子宮的異常增殖，引起LC3和PCNA表達的改變，進而改變子宮的微環(huán)境，而添加0.25%—0.5%劑量的新型吸附劑可以恢復子宮器官指數及LC3和PCNA的表達，這對于維持對子宮的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)十分有利。