桑葉通過(guò)影響瘤胃微生物區(qū)系調(diào)控湖羊脂肪沉積

侯啟瑞, 謝 輝, 戎世芳, 吳 萍, 沈曼曼, 任永利， 趙衛(wèi)國(guó)

(1.江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212100) (2.河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，南陽(yáng) 411321) (3.海安市蠶桑技術(shù)推廣站，海安 226600)

自1993年衛(wèi)生部確定桑葉既是食品又是藥品以來(lái)，桑葉在食用、藥用、飼用等方面得到進(jìn)一步研究．桑葉在中藥學(xué)上有降糖減脂的功效[1]，在動(dòng)物生產(chǎn)上也表現(xiàn)出調(diào)控脂代謝的功能．研究發(fā)現(xiàn)，桑葉通過(guò)調(diào)控育肥豬蔗糖酶、脂肪酶及肝臟糖代謝酶活性調(diào)控脂肪代謝，降低板油率和背膘厚度，提高肌肉脂肪沉積量，增加肌肉不飽和脂肪酸含量[2]；以桑葉飼喂獺兔，可以降低獺兔的血脂含量，增強(qiáng)肝臟的抗氧化能力[3]；飼喂青貯桑葉能顯著影響陜北白絨山羊脂肪代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)脂肪沉積、改善肉品質(zhì)的作用[4]．

近年來(lái)，桑葉作為反芻動(dòng)物的蛋白飼料來(lái)源越來(lái)越受到重視[5]．反芻動(dòng)物依靠瘤胃微生物轉(zhuǎn)化利用粗飼料中的碳水化合物和蛋白質(zhì)得到能量．桑葉含有黃酮類(lèi)化合物、多糖、植物甾醇、γ-氨基丁酸和酚類(lèi)等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)瘤胃微生物的生長(zhǎng)和繁殖有促進(jìn)作用，可改善瘤胃功能，降低糞能和總氮排出量，提高飼糧的代謝能和氮的生物學(xué)價(jià)值[5-6]．瘤胃微生物還可以通過(guò)不完全氫化作用或內(nèi)源合成途徑把日糧中的不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)為共軛亞油酸，而該物質(zhì)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低膽固醇和抑制脂肪沉積等作用[7]．但桑葉對(duì)反芻動(dòng)物機(jī)體的脂肪代謝及其調(diào)控途徑的研究還較缺乏．

羊草(Leymuschinensis)又叫堿草，葉較多，含有較豐富的粗蛋白，是肉羊養(yǎng)殖中的主要飼料[8]．湖羊是太湖平原重要家畜之一，也是我國(guó)一級(jí)保護(hù)地方畜禽品種，在2000年和2006年先后兩次被農(nóng)業(yè)部列入《國(guó)家畜禽遺傳資源保護(hù)目錄》．實(shí)驗(yàn)以桑葉代替部分羊草飼喂湖羊，研究不同比例桑葉對(duì)湖羊瘤胃微生物區(qū)系、生長(zhǎng)性能和脂肪沉積的影響，為桑葉在反芻動(dòng)物飼料中的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)．

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

風(fēng)干桑葉(MorusalbaL.，豐馳桑)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，經(jīng)檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)水平為：水分10.25%、粗蛋白20.97%、粗脂肪8.20%、粗灰分7.66%、中性洗滌纖維33.46%、酸性洗滌纖維15.42%、鈣1.47%、磷0.11%．

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物管理

采取完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)．選取32只6月齡體重相近、健康狀況良好的湖羊公羊，隨機(jī)分為4組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只，單欄飼養(yǎng)．舍飼前對(duì)羊舍徹底清理，消毒，統(tǒng)一驅(qū)蟲(chóng)和免疫．試驗(yàn)期間每日飼喂2次(07 ∶00和17 ∶00)，自由飲水，自然光照．

1.3 試驗(yàn)日糧

對(duì)照組(Control)飼喂以羊草為唯一粗飼料的基礎(chǔ)飼糧，羊草占飼糧總重量的40%．試驗(yàn)組以桑葉代替部分羊草，桑葉與羊草的比例分別為20 ∶80(T20)、60 ∶40(T60)、80 ∶20(T80)．各組飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1．飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參照NRC(2007)建議的肉綿羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，按照日增重200 g/d配置．預(yù)試期10 d，正試期55 d．

表1 各組飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)稱(chēng)量試驗(yàn)羊空腹體重，每日記錄飼料量和剩余料量．計(jì)算平均日增重、日采食量和料重比．

1.4.2 體脂肪沉積

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組選取3只羊絕食24 h后稱(chēng)量體重，頸靜脈放血屠宰．測(cè)量眼肌面積、皮下脂肪重、腹脂重、心周脂肪、腎周脂肪重、尾脂重、肋肉厚和背膘厚[9]．其中，皮下脂肪重是指對(duì)覆蓋于胴體外的背部和腹部的脂肪組織重量．腹脂重是指胴體腹部腸系膜和大網(wǎng)膜脂肪重的總和．腎周脂肪重是指從胴體完整摘取雙腎及周邊脂肪組織后剝離腎臟后的脂肪組織重．背膘厚是指位于胴體第12和13肋骨之間眼肌中部上方的脂肪厚度，肋肉厚為第12和13肋骨之間距背脊中線11 cm處的組織厚度，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)定．

1.4.3 瘤胃微生物基因組DNA提取

取T0和T80組羊瘤胃液，四層紗布過(guò)濾，立即將瘤胃固態(tài)內(nèi)容物樣品放入液氮保存．樣品用珠磨破碎，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取總DNA．

取均質(zhì)后的樣品500 μL，加920 μL CTAB抽提液、75 μL 10%十二烷基磺酸鈉(SDS)、5 μL蛋白酶K，37 ℃溫浴1 h．液氮中快速冷凍3 min，迅速置于65 ℃水槽中溫浴2 min，反復(fù)凍融2次，在珠磨儀上破碎5 min．3 000×g離心5 min，取上清液，加入260 μL 10 mol/L乙酸銨，混勻，置冰上冷凍5 min．16 000×g離心10 min，取上清液到離心管中加等體積酚 ∶氯仿 ∶異戊醇(25 ∶24 ∶1)，12 000×g離心10 min．將上清液放到離心管中加入等體積異丙醇，混合均勻，置冰上冷凍30～60 min．16 000×g離心10 min，棄上清液．加入70%乙醇，混合均勻，16 000×g離心10 min，棄上清液，待乙醇全部揮發(fā)后，加入100 μL TE緩沖液溶解沉淀．

采用RS-232型核酸蛋白測(cè)定儀(伯樂(lè)SmartSpec Plus，美國(guó))測(cè)定DNA溶液純度與濃度，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為100 V，電泳時(shí)間為40 min，檢測(cè)DNA片段的完整性．

參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V4+V5可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增．PCR引物序列(5′-3′)為515F: GTGCCAGCMGCCGCGGTAA; 907R: CCGTCAATTCCTTTGAGTTT．?dāng)U增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)，對(duì)目的條帶使用Qiagen公司凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，純化PCR產(chǎn)物，使用TruSeq? DNA PCR-Free SamplePreparation Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后送天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為IIIumina MiSeq PE300(Illumina，美國(guó))．

1.5 16S rRNA高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

測(cè)序平臺(tái)得到的raw reads先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾．序列過(guò)濾后，將具有高度相似性(97%)的序列歸為一個(gè)操作分類(lèi)單位(OTU)，運(yùn)用Blast比對(duì)程序在Ribosomal Database Project數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類(lèi)學(xué)分析．基于OTU分析結(jié)果，對(duì)樣品在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行分類(lèi)學(xué)Alpha多樣性及Beta多樣性分析．包括利用Qiime軟件繪制稀釋性曲線IIII,應(yīng)用軟件Mothur中的summary．single命令和metastats命令，分別計(jì)算Chaol、ACE、Shannon、Simpson參數(shù)和兩組之間的差異顯著性分析．此外，將所有細(xì)菌按分類(lèi)學(xué)統(tǒng)計(jì)并利用Unifrae算法通過(guò)R語(yǔ)言工具繪制樣品間主坐標(biāo)分析圖(PCoA)，以及組間多樣性分析．

采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，以Duncan 氏法進(jìn)行多重比較．P>0.05為差異不顯著判定標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05為差異顯著判定標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著判定標(biāo)準(zhǔn)．

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉對(duì)羊生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，以桑葉代替部分羊草飼喂湖羊，湖羊采食量和日增重有所增加，T60組采食量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但日增重差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)．

表2 桑葉與羊草不同比例組合對(duì)羊生長(zhǎng)性能的影響

2.2 桑葉對(duì)羊體脂肪分布的影響

桑葉對(duì)湖羊的眼肌面積、皮下脂肪、心周脂肪和尾脂重量無(wú)顯著作用，腹脂和腎周脂肪重量略有增加，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)．隨著桑葉添加量的增加，肋肉厚和背膘厚顯著升高，T80組肋肉厚顯著大于對(duì)照組，背膘厚顯著大于對(duì)照組和T20組(P<0.05)，如表3．

表3 桑葉與羊草不同比例組合對(duì)羊體脂肪分布的影響

2.3 桑葉對(duì)羊瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 OTU聚類(lèi)分析

經(jīng)過(guò)16S rRNA V4+V5可變區(qū)的IIIumina MiSeq雙端測(cè)序，反映97%相似度下樣品取樣深度的稀釋曲線如圖1．

圖1 對(duì)照組和T80組羊瘤胃微生物樣品稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of rumen microbiological samples of sheep in the control and the T80 group

當(dāng)抽取測(cè)序數(shù)據(jù)量在15 000以上時(shí)，對(duì)照組(Control)和T80組各樣品稀釋曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序深度和數(shù)據(jù)量足夠，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種(OTU)．

2.3.2 微生物α多樣性

對(duì)照組和T80組羊瘤胃微生物α多樣性如表4．兩組樣品中所含OTU數(shù)目和種類(lèi)相近，Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明桑葉與羊草營(yíng)養(yǎng)成分含量相近，飼糧中80%的羊草被桑葉替代不會(huì)引起瘤胃微生物顯著變化．

表4 對(duì)照組和T80組樣品在97%一致性閾值下多樣性指數(shù)分析

2.3.3 微生物β多樣性

β多樣性是對(duì)不同樣品的微生物菌落構(gòu)成進(jìn)行比較分析，是物種組成沿環(huán)境梯度或在菌落間的變化率．由基于Unifrac的加權(quán)主坐標(biāo)分析圖(圖2、3)可知，基于Unifrac的加權(quán)(Weighted Unifrac)和非加權(quán)(Unweighted Unifrac)的主坐標(biāo)分析其第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為35.94%和27.35%、29.13%和24.97%，對(duì)照組主成分投射位置比較分散，T80組比較分散．說(shuō)明桑葉能夠使瘤胃菌落的β多樣性差異增加．

圖2 基于Weighted Unifrac距離PCoA分析Fig.2 Analysis of PCoA based on Weighted Unifrac distance

圖3 基于Unweighted Unifrac距離PCoA分析Fig.3 Analysis of PCoA based on Unweighted Unifrac distance

2.4 桑葉對(duì)羊瘤胃細(xì)菌物種相對(duì)豐度的影響

門(mén)水平上，相對(duì)豐度排名前10的物種見(jiàn)圖4．?dāng)M桿菌(Bacteroides)、厚壁菌(Firmictes)和變形菌(Proteobacteria)是羊瘤胃的主要菌屬，細(xì)菌數(shù)量總和占各組樣品中細(xì)菌總量的90%以上(圖4(a))．與對(duì)照組相比，T80組厚壁菌和放線菌(Actinobacteria)增加，擬桿菌和變形菌減少，但均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)和黏膠球形菌(Lentisphaerae)顯著減少(P<0.05，圖4(b))．

圖4 瘤胃微生物門(mén)水平上物種相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of rumen microbe at phylum level of the sheep

由物種豐度聚類(lèi)圖5可知，對(duì)照組和T80組共同擁有35種菌，被聚為4類(lèi)，對(duì)照組1(4種)和對(duì)照組2(5種)菌屬首先聚到一起，再與對(duì)照組3(2種)、T80組3(11種)聚到一起，最后與T80組1(7種)和T80組2(6種)相聚．從中可以看出，兩組瘤胃微生物物種豐度聚類(lèi)明顯分開(kāi)，T80組物種豐度多樣性比對(duì)照組豐富．

圖5 對(duì)照組和T80組羊瘤胃細(xì)菌物種豐度聚類(lèi)圖Fig.5 Heat map of rumen species abundance in Control and T80 group

3 討論

近年來(lái)，桑葉作為反芻動(dòng)物飼料來(lái)源的研究從不同方面進(jìn)行了闡述．日糧中添加10%～20%的青貯桑葉或10%～15%的干桑葉可提高生長(zhǎng)育肥羊的生產(chǎn)性能，改善羊肉品質(zhì)[11]．飼喂青貯桑葉能顯著影響山羊皮下脂肪、尾部脂肪、腎周脂肪、肝臟和背最長(zhǎng)肌脂肪代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪沉積[4]．本研究與前人研究結(jié)果一致．日糧中添加風(fēng)干桑葉能提高脂肪在湖羊腹部、腎周、肋骨和脊背處的沉積，促進(jìn)生長(zhǎng)．通過(guò)對(duì)瘤胃微生物的分析，本研究還發(fā)現(xiàn)桑葉對(duì)湖羊脂肪沉積的調(diào)控與瘤胃微生物區(qū)系的改變有關(guān)．

瘤胃是反芻動(dòng)物消化粗飼料的主要場(chǎng)所．本研究對(duì)瘤胃微生物16S rRNA基因擴(kuò)增子文庫(kù)的分析顯示，擬桿菌、厚壁菌和變形菌是羊瘤胃的主要菌群，與前人研究結(jié)果一致[12]．文獻(xiàn)[13]發(fā)現(xiàn)，添飼木質(zhì)素后，牛瘤胃的主導(dǎo)菌群從擬桿菌向厚壁菌轉(zhuǎn)移．本研究中擬桿菌和厚壁菌之間豐度的變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)[13]的發(fā)現(xiàn)一致，說(shuō)明桑葉替代羊草可能增加了飼糧中木質(zhì)素的含量．而隨著桑葉含量的增加，飼糧中中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維均降低(表1)，分析中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的組成，桑葉替代羊草后，飼糧中的纖維素和半纖維素含量可能減少了．腸道中的厚壁菌有利于抑制肥胖和胰島素抵抗，這與中藥學(xué)上桑葉的抗肥胖和治療二型糖尿病的作用一致[14-15]，桑葉可能通過(guò)增加病患腸道厚壁菌的豐度進(jìn)而調(diào)解糖脂代謝．

變形菌在生物膜的形成和發(fā)酵、可溶性碳水化合物與淀粉的消化等方面具有高度多樣化的代謝功能[16]．本研究中變形菌是湖羊瘤胃微生物中的第三大菌屬，添飼桑葉后瘤胃變形菌相對(duì)豐度略有減少，說(shuō)明桑葉替代羊草可能降低了飼糧中可溶性碳水化合物和淀粉的含量．

放線菌是瘤胃微生物的常規(guī)成員，約占瘤胃細(xì)菌總數(shù)的3%．瘤胃放線菌生態(tài)學(xué)和生物學(xué)方面的研究資料相當(dāng)缺乏[17]．自然界中，放線菌是天然藥物的重要來(lái)源之一，能產(chǎn)生多種具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤的活性物質(zhì)[18]．T80組湖羊瘤胃放線菌的增加可能有助于動(dòng)物保持健康的機(jī)體狀態(tài)，與桑葉的保健功能相符．另外，藍(lán)細(xì)菌能夠產(chǎn)生毒素[19]，T80組湖羊瘤胃藍(lán)細(xì)菌豐度顯著降低也有利于動(dòng)物健康．據(jù)報(bào)道，黏膠球形菌門(mén)與纖維二糖的降解有關(guān)．T80組瘤胃黏膠球形菌風(fēng)度降低，可能是由于桑葉中中性洗滌纖維等纖維類(lèi)物質(zhì)低于羊草[20]．

綜上所述，在羊飼糧中添加一定量的桑葉(≤32%)能夠減少瘤胃中擬桿菌和變形菌的比例，提高厚壁菌在瘤胃微生物中的相對(duì)豐度；同時(shí)，桑葉增加了瘤胃中放線菌的數(shù)量，減少了藍(lán)細(xì)菌的數(shù)量，有利于動(dòng)物健康，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)和局部脂肪沉積有促進(jìn)作用．