黃色鏈霉菌TRM45540遺傳轉化系統(tǒng)的構建

夏影影，張巧燕，邢利，陳乙煌，黃建軍，羅曉霞*

（1塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾843300）

（2塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

（3新疆阿拉爾市十三團農業(yè)發(fā)展服務中心，新疆 阿拉爾 843300）

黃色鏈霉菌TRM45540是一株分離自新疆羅布泊土壤的高產放線菌素D的鏈霉菌新物種[1]，因其能夠在ISP系列培養(yǎng)基和高氏培養(yǎng)基上生長并產生黃色色素，故命名為黃色鏈霉菌[2]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)該菌株具有良好的抗逆性，并且對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、棉花枯、黃萎病菌和核桃腐霉菌等多種動、植物病原菌都具有較好的抑制活性，同時，基于基因組學研究發(fā)現(xiàn)其基因組上蘊藏著豐富的次級代謝產物生物合成基因簇[3-5]。由此可見，黃色鏈霉菌TRM45540具有較強的代謝潛力，值得深入研究。

在研究鏈霉菌抗生素生物合成機制及抗逆機制并對其進行分子遺傳學和基因工程操作時，通常要對抗生素基因簇及抗逆基因簇中的單個基因功能分別進行分析和驗證，在此過程中需要將被研究的基因在天然宿主中進行突變，并使其返回到天然的宿主中去回補表達，這就要求建立所研究菌株自身的遺傳操作系統(tǒng)。就鏈霉菌而言，科研人員多采用轉化、轉導和接合轉移等方法研究菌株的遺傳操作系統(tǒng)[6]。其中接合轉移法由于受宿主限制修飾系統(tǒng)的干擾較少，能夠高效轉移外源DNA，并且該方法還具備簡單、高效、宿主范圍廣等特點，因此在鏈霉菌遺傳操作中應用十分廣泛[7]。為了深入研究黃色鏈霉菌TRM45540的功能活性，本研究以整合型載體pSET152和自殺型載體pKC1139為出發(fā)質粒，ET12567(pUZ8002)為供體菌，TRM45540為受體菌，通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉移方法建立了TRM45540遺傳轉化系統(tǒng)。該體系的建立為進一步研究TRM45540菌株的功能基因簇和其他遺傳操作提供必不可少的平臺，也為研究其抗生素合成代謝途徑、調控機理、遺傳改良等奠定重要的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

受體菌黃色鏈霉菌（Streptomyces lutues）TRM45540由本實驗室分離鑒定。供體菌大腸桿菌E.colipUZ8002/ET12567和pKC1139/DH5α由本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基以LB液體和固體培養(yǎng)基，鏈霉菌固體培養(yǎng)基為高氏一號、2CM、Modified-ISP-4、MS、Oatmeal、PDA、GYM、MM、GSY和YD培養(yǎng)基；鏈霉菌液體培養(yǎng)基為TSB和2*YT培養(yǎng)基，上述培養(yǎng)基的配制參照鏈霉菌遺傳操作手冊[13]。

1.1.3 主要儀器和試劑

凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD；高速離心機：德國Eppendorf；電泳儀：DYCZ-26C；安普霉素、卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素和硫鏈絲菌素等多種抗生素購自Sigama公司，基礎生化試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 黃色鏈霉菌TRM45540最適產孢培養(yǎng)基的篩選

收集黃色鏈霉菌TRM45540孢子，溶于20%甘油中制成孢子懸液，然后分別取100 μL孢子懸液涂布在不同固體培養(yǎng)基(高氏一號、2CM、Modified-ISP-4、MS、Oatmeal、PDA、GYM、MM、GSY、YD培養(yǎng)基)并置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基設置三個平行，觀察其生長情況并計數(shù)。

1.2.2 黃色鏈霉菌TRM45540抗生素敏感性測定

將安普霉素(apramycin,APR)、卡那霉素(kanamycin,KAN)、氯霉素(chloramphenicol,CHL)、氨芐青霉素 (ampicillin,AMP)和硫鏈絲菌素 (thiostrepton,THIO)等多種抗生素分別配成實驗室常用濃度，即50、100、50、25和 100 mg/L；取一定量加入到篩選到的黃色鏈霉菌TRM45540最適產孢培養(yǎng)平板上。取100 μL新鮮孢子涂布于各個抗生素的固體平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察其生長狀況并記錄。

1.2.3 黃色鏈霉菌TRM45540最適孢子萌發(fā)培養(yǎng)基及最適萌發(fā)時間的確定

分別取100 μL的孢子懸液置于50℃水浴鍋中熱激處理10 min后接種于2×YT與TSB液體培養(yǎng)基中進行預萌發(fā)，每隔半小時對未熱激孢子與熱激之后的孢子分別進行取樣在相差顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況。

1.2.4 大腸桿菌-黃色鏈霉菌TRM45540接合轉移培養(yǎng)基的篩選

吸取已經萌發(fā)的黃色鏈霉菌孢子懸液與大腸桿菌pUZ8002/ET12567以1:2的比例混合后分別涂布至MS、Modified-ISP4、2CM營養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h后，涂布合適的抗生素及萘啶酮酸，培養(yǎng)5 d后觀察菌株生長情況。

1.2.5 接合轉移子的PCR驗證

以接合轉移子的總DNA為模板，以APR抗性篩選基因為目標序列設計引物，通過PCR驗證接合子。引物序列為：Apr-F：5’-ATGTCATCAGCGGTGGAGTGCAAT-3’；Apr-R：5’-TGGCGAGCGGCATCGCATTCTT-3’。

2 結果與分析

2.1 黃色鏈霉菌TRM45540菌株的最適產孢培養(yǎng)基篩選

作為接合轉移的受體菌，鏈霉菌的孢子的質量直接決定接合轉移是否能夠成功。為了獲得足量的新鮮鏈霉菌孢子，本實驗將100 μL黃色鏈霉菌孢子懸液分別涂布至高氏一號、2CM、Modified-ISP-4、MS、Oatmeal、PDA、GYM、MM、GSY和YD培養(yǎng)基后，在37℃培養(yǎng)，每隔12小時記錄平板上生長菌落的個數(shù)，結果表明TRM45540菌株的在培養(yǎng)基上菌落數(shù)最多，其次是MS培養(yǎng)基、GYM培養(yǎng)基、GSY培養(yǎng)基、Gause’培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上的菌落數(shù)也較多，（圖1）為不同培養(yǎng)基上菌株的生長量狀況，但根據菌體生長速度及產孢量來看，MS培養(yǎng)基的生長速度最快，因此以MS培養(yǎng)基為最適產孢培養(yǎng)基。

圖1 黃色鏈霉菌TRM45540在不同培養(yǎng)基上的生長狀況

2.2 黃色鏈霉菌TRM45540抗生素敏感性測定結果

遺傳操作系統(tǒng)的建立需要適當?shù)暮Y選標記，為此本研究檢測了黃色鏈霉菌(Streptomyces lutues)TRM45540對各種抗生素的耐藥性實驗，結果表明：黃色鏈霉菌TRM45540對APR、THIO和KAN抗生素敏感，對AMP和CHL抗生素具有一定的耐藥性（表1），后期在進行遺傳轉化時可以選用APR、THIO和KAN作為抗性篩選標記。

表1 黃色鏈霉菌TRM45540不同抗生素的敏感性

2.3 大腸桿菌-黃色鏈霉菌屬間接合轉移最適萌發(fā)培養(yǎng)基與最適萌發(fā)時間篩選

接合轉移在放線菌孢子萌發(fā)的早期發(fā)生，因此在進行大腸桿菌-放線菌屬間接合轉移實驗中，有必要探索菌株孢子萌發(fā)適宜的狀態(tài)。本實驗將孢子懸液經50℃熱處理后接種至2×YT與TSB液體培養(yǎng)基中進行預萌發(fā)，每隔半小時取樣通過相差顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，以未經熱激處理的孢子懸液作對照。發(fā)現(xiàn)在TSB液體培養(yǎng)基中的孢子在2小時可以觀察到孢子萌發(fā)，而2×YT培養(yǎng)基在2小時僅觀察到少量孢子萌發(fā)。在2×YT培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時后，均可以觀察到菌體萌發(fā)形成菌絲體小團，TSB培養(yǎng)基形成的菌絲體小團多于2×YT培養(yǎng)基（圖2中第4行，5列）。結果表明TSB培養(yǎng)基為大腸桿菌-黃色鏈霉菌屬間接合轉移最適培養(yǎng)基，最適萌發(fā)時間為4 h。

圖2 黃色鏈霉菌TRM45540孢子萌發(fā)狀態(tài)

2.4 大腸桿菌-黃色鏈霉菌屬間接合轉移最適培養(yǎng)基篩選

進行屬間接合轉移時，培養(yǎng)基是否合適對于實驗的成功與否有著決定性的影響。本實驗以大腸桿菌 ET12567(pUZ8002+pKC1139)和 ET12567(pUZ8002+pSET152)作為供體菌，以黃色鏈霉菌TRM45540(Streptomyces lutues)作為受體菌，采用MS、Modified-ISP4和2CM培養(yǎng)基檢測大腸桿菌-黃色鏈霉菌菌株屬間接合轉移陽性率（表2），結果發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基生長的接合子陽性率達80.2%，明顯高于另外兩種培養(yǎng)基，因此更適合作為接合子生長培養(yǎng)基。

表2 接合轉移培養(yǎng)基的確定

2.5 接合轉移子檢測

將接合轉移子接種到含APR抗生素的TSB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3天后挑取一個單菌落進行培養(yǎng)。接下來，以接合子的總DNA為模板，以APR抗性篩選基因為目標序列設計引物，通過PCR驗證接合子。在相同條件下，以pKC1139和pSET152質粒DNA為陽性對照模板，以TRM45540總DNA為陰性對照模板，同時進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)接合子中能擴增出與質粒pKC1139和pSET152大小一致的條帶（圖3（a），Lane 1，2；圖3（b），Lane 1，2），說明該質粒已被成功轉入到黃色鏈霉菌TRM45540中。

圖3 接合轉移子的PCR驗證

3 討論與結論

鏈霉菌是一類極其重要的資源，能產生多種次級代謝產物，這些產物大都具有良好的生物活性，除了發(fā)揮常規(guī)的殺菌、抑菌、抗感染等作用外還具有抗高血壓、高膽固醇性及免疫抑制性等，在人類的社會生活中扮演著十分重要的角色，因而挖掘鏈霉菌中的次級代謝產物具有十分重要的意義[8-12]。黃色鏈霉菌TRM45540是一株分離自羅布泊土壤的嗜鹽鏈霉菌，具有很強的生物活性及代謝潛力[3]，要想充分研究TRM45540菌株的功能基因簇的活性，通常要采用基因中斷、基因敲除、異源表達和超量表達等方法從基因角度對其活性代謝產物進行充分挖掘，因此構建一個高效率的遺傳操作系統(tǒng)對其目標產物生物合成基因簇及其基因簇上的功能基因的研究非常重要。本研究為了能夠更全面地建立菌株TRM45540天然產物生物合成基因簇的基因操作方法，選用自殺型載體pKC1139和整合型載體pSET152分別構建了應用于基因的突變和回補的接合轉移質粒，優(yōu)化了影響黃色鏈霉素TRM45540接合轉移的主要因素，通過分析菌株TRM45540的最適產孢培養(yǎng)基、抗生素敏感性、孢子的最適萌發(fā)培養(yǎng)基、萌發(fā)時間以及接合轉移培養(yǎng)基，建立了大腸桿菌ET12567(pUZ8002)黃色鏈霉菌TRM45540屬間接合轉移體系：通過MS培養(yǎng)基培養(yǎng)收集孢子，將收集的孢子50℃熱激10 min后，37℃萌發(fā)4 h后，與供體菌ET12567(pUZ8002)在MS培養(yǎng)基上進行接合轉移，接合轉移的抗性篩選標記可以采用APR抗性、THIO抗性和KAN抗性。在此條件下，成功將質粒pKC1139和pSET152接合轉移進TRM45540菌株中。這為驗證TRM45540活性代謝產物基因簇的合成機制及功能奠定了遺傳基礎，也為接下來在此基礎上對該菌株進行基因工程操作和深入研究提供了良好的技術支撐。