干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)PtWOX11/12a基因河北楊生長(zhǎng)及生理特性的影響

常宇璇，閆 盟，張 騏，李佳琪，燕 興，淑 芳，王亞萍，白玉娥

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2. 通遼市林業(yè)和草原科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

干旱問(wèn)題已經(jīng)引起社會(huì)高度重視，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人口膨脹、水資源短缺等原因，導(dǎo)致植被減少、河流斷流、干旱地區(qū)面積擴(kuò)大、生物多樣性下降、干旱程度加重[1-2]，生態(tài)環(huán)境安全和發(fā)展受到嚴(yán)重影響[3]。水資源匱乏制約了我國(guó)北方地區(qū)生態(tài)環(huán)境改善和發(fā)展[4]，未來(lái)生態(tài)建設(shè)應(yīng)把選育抗旱物種作為育種工作的中心任務(wù)[1]。

楊樹(shù)是楊柳科(Salicaceae)楊屬(PopulusL.)樹(shù)種的統(tǒng)稱(chēng)，楊屬包括5個(gè)派：白楊派、青楊派、黑楊派、胡楊派和大葉楊派，在我國(guó)南北方部分地區(qū)均有分布。目前，我國(guó)楊樹(shù)人工林栽培面積世界第一，超過(guò)700萬(wàn)hm2[5]。楊樹(shù)作為我國(guó)重要的造林樹(shù)種，被廣泛引種栽培，在經(jīng)濟(jì)、生態(tài)等方面發(fā)揮著重要的作用[6-8]。楊樹(shù)有較為完善的遺傳圖譜，是基因工程研究的模式植物，具有基因組小、易操作的特點(diǎn)，可利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[9-12]。1986年，Parsons等[11]證實(shí)了楊樹(shù)可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)目的基因，自此，利用基因工程進(jìn)行楊樹(shù)育種迅速發(fā)展起來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑、抗逆等方面均獲得了不同程度的研究進(jìn)展[13]。

本文以轉(zhuǎn)PtWOX11/12a基因河北楊(Populushopeiensis)為試驗(yàn)材料，通過(guò)不同程度的干旱脅迫，研究轉(zhuǎn)PtWOX11/12a基因河北楊表型及各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，為后期轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)品種的選育及抗旱育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的野生型(非轉(zhuǎn)基因河北楊)(CK)及轉(zhuǎn)PtWOX11/12a基因河北楊(轉(zhuǎn)基因植株)無(wú)菌苗，移栽至草炭土∶蛭石∶珍珠巖=6∶3∶1的基質(zhì)中，每4 d澆一次水，定植30 d后進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)。試驗(yàn)材料由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

將轉(zhuǎn)基因植株及CK移栽至大小相同、不透水盆中，盆中放置相同重量的干燥土壤。土壤相對(duì)含水量一般是指土壤含水量占田間持水量的百分?jǐn)?shù)，土壤相對(duì)含水量 80% 以上為正常水平，50%～70% 為輕度干旱，30%～50% 為中度干旱，低于 30% 為重度干旱[14-17]。本試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)梯度，土壤相對(duì)含水量分別為：90%(充足水分，T1)、55%(輕度干旱脅迫，T2)、45%(中度干旱脅迫，T3)、30%(重度干旱脅迫，T4)。根據(jù)土壤重量計(jì)算出所需水的重量，澆入土壤中。每天稱(chēng)重，補(bǔ)充散失的水分至相應(yīng)的土壤相對(duì)含水量，每組3個(gè)重復(fù)。

干旱脅迫20 d后，分別測(cè)量轉(zhuǎn)基因植株及CK的株高、地徑生長(zhǎng)量，取葉片測(cè)量葉綠素、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)。葉綠素采用比色法，SOD采用氮藍(lán)四唑法，POD采用愈創(chuàng)木酚法，MDA采用硫代巴比妥酸法[18]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Excel 2010進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)株高生長(zhǎng)量的影響

由圖1可知，轉(zhuǎn)基因植株及CK的株高生長(zhǎng)量隨干旱程度的增加，均呈降低-升高-降低的趨勢(shì)。同等干旱程度下，轉(zhuǎn)基因植株株高生長(zhǎng)量明顯高于CK。充足水分條件下(T1)，轉(zhuǎn)基因植株和CK的株高生長(zhǎng)量均達(dá)到最大值，分別為 4.27 cm和 1.27 cm。隨著干旱程度的增加，轉(zhuǎn)基因植株及CK的株高生長(zhǎng)量均受到不同程度的抑制。T2處理與T1相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的株高生長(zhǎng)量分別下降 46.14% 和 37.01%。T3處理與T2處理相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的株高生長(zhǎng)量分別上升 37.83% 和 8.75%，此時(shí)株高生長(zhǎng)量分別為 3.17 cm和 0.87 cm。T4處理與T3處理相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的株高生長(zhǎng)量分別下降 65.30% 和 80.46%，并達(dá)到最小值 1.10 cm和 0.17 cm。

圖1 干旱脅迫下各株系株高生長(zhǎng)量Fig.1 Plant height growth of each strain under drought stress

2.2 干旱脅迫對(duì)地徑生長(zhǎng)量的影響

由圖2可知，轉(zhuǎn)基因植株及CK的地徑生長(zhǎng)量隨干旱程度的增加，均呈降低-升高-降低的趨勢(shì)。同等干旱程度下，轉(zhuǎn)基因植株地徑生長(zhǎng)量明顯高于CK。充足水分條件下(T1)，轉(zhuǎn)基因植株及CK的地徑生長(zhǎng)量均達(dá)到最大值，分別為 0.37 mm和 0.23 mm。T2處理與T1處理相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的地徑生長(zhǎng)均受到抑制，地徑生長(zhǎng)量分別下降 32.43% 和 21.74%。T3處理與T2處理相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的地徑生長(zhǎng)量分別升高 28.00% 和 11.11%。T4處理與T3處理相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的地徑生長(zhǎng)量分別下降 53.13% 和 40.00%，并達(dá)到最小值 0.15 mm和 0.12 mm。

圖2 干旱脅迫下各株系地徑生長(zhǎng)量Fig.2 Ground diameter growth of each strain under drought stress

2.3 干旱脅迫對(duì)葉片葉綠素含量的影響

由圖3和圖4可知，隨著干旱程度的增加，轉(zhuǎn)基因植株葉綠素a含量和葉綠素b含量均呈先升高再降低的趨勢(shì)，CK的葉綠素a含量和葉綠素b含量均呈升高-降低-升高的趨勢(shì)。同等干旱程度下，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素a含量和葉綠素b含量均明顯高于CK。充足水分條件下(T1)，轉(zhuǎn)基因植株及CK的葉綠素a含量分別為 1.92 mg·L-1和 1.55 mg·L-1，葉綠素b含量分別為 0.81 mg·L-1和 0.68 mg·L-1。T2處理與T1處理相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素a含量和葉綠素b含量分別上升 26.57% 和 27.16%。T3處理與T2處理相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素a含量和葉綠素b含量均達(dá)到最大值，分別為 2.49 mg·L-1和 1.10 mg·L-1，CK的葉綠素a含量和葉綠素b含量分別下降 59.63% 和 56.52%，達(dá)到最小值 0.65 mg·L-1和 0.30 mg·L-1。T4處理與T3處理相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素a含量和葉綠素b含量分別下降 42.57% 和 41.82%，達(dá)到最小值 1.43 mg·L-1和 0.64 mg·L-1，CK的葉綠素a含量和葉綠素b含量均升高，分別達(dá)到 1.20 mg·L-1和 0.62 mg·L-1。

圖3 干旱脅迫下各株系葉綠素a含量Fig.3 Chlorophyll a content of each strain under drought stress

圖4 干旱脅迫下各株系葉綠素b含量Fig.4 Chlorophyll b content of each strain under drought stress

2.4 干旱脅迫對(duì)葉片SOD活性的影響

由圖5可知，隨著干旱程度的增加，轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性呈先升高再降低的趨勢(shì)，CK的SOD活性呈先降低再升高的趨勢(shì)。同等干旱程度下，轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性明顯高于CK。充足水分條件下(T1)，轉(zhuǎn)基因植株及CK的SOD活性分別為 372.26 U·mg-1和 147.19 U·mg-1。T2處理與T1處理相比，轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性升高 62.70%，達(dá)到最大值 605.67 U·mg-1，CK的SOD活性下降 35.34%，達(dá)到最小值 95.17 U·mg-1。T3處理與T2處理相比，轉(zhuǎn)基因植株SOD活性下降 56.47%，CK的SOD活性上升 28.63%。T4處理與T3處理相比，轉(zhuǎn)基因植株SOD活性下降 40.53%，達(dá)到最小值 156.78 U·mg-1，CK的SOD活性上升 11.17%，達(dá)到 136.09 U·mg-1。

圖5 干旱脅迫下各株系SOD活性Fig.5 SOD activity of each strain under drought stress

2.5 干旱脅迫對(duì)葉片POD活性的影響

由圖6可知，隨著干旱程度的增加，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD活性呈降低-升高-降低的趨勢(shì)，CK的POD活性呈先下降再升高的趨勢(shì)。同等干旱程度下，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD活性明顯高于CK。充足水分條件下(T1)，轉(zhuǎn)基因植株及CK的POD活性分別為 170.00 U·g-1·min-1和 101.67 U·g-1·min-1。T2處理與T1處理相比，POD活性分別下降 40.69% 和 3.29%，達(dá)到最小值 100.83 U·g-1·min-1和 98.33 U·g-1·min-1。T3處理與T2處理相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的POD活性分別升高 75.30% 和 11.87%，此時(shí)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD活性達(dá)到最大值 176.76 U·g-1·min-1。T4處理與T3處理相比，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD活性下降了 6.65%，CK的POD活性升高了 22.73%，達(dá)到最大值 135.00 U·g-1·min-1。

圖6 干旱脅迫下各株系POD活性Fig.6 POD activity of each strain under drought stress

2.6 干旱脅迫對(duì)葉片MDA含量的影響

由圖7可知，隨著干旱程度的增加，轉(zhuǎn)基因植株及CK的MDA含量均呈先降低再升高的趨勢(shì)。同等干旱程度下，轉(zhuǎn)基因植株MDA含量明顯低于CK。充足水分條件下(T1)，轉(zhuǎn)基因植株及CK的MDA含量分別為 0.006 μmol·L-1和 0.009 μmol·L-1。T2處理與T1處理相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的MDA含量分別下降 5.00% 和 3.33%。T3處理與T2處理相比，轉(zhuǎn)基因植株MDA含量下降 12.28%，達(dá)到最小值 0.005 μmol·L-1，CK的MDA含量上升 6.90%。T4處理與T3處理相比，轉(zhuǎn)基因植株及CK的MDA含量分別上升 26.00% 和 7.53%，此時(shí)，CK的MDA含量達(dá)到最大值 0.010 μmol·L-1。

圖7 干旱脅迫下各株系MDA含量Fig.7 MDA content of each strain under drought stress

3 結(jié)論與討論

根據(jù)不同程度干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株及CK的株高生長(zhǎng)量、地徑生長(zhǎng)量、葉綠素含量、SOD活性、POD活性、MDA含量等指標(biāo)的綜合分析得出，轉(zhuǎn)PtWOX11/12a基因河北楊在干旱脅迫下，表現(xiàn)出良好的抗旱性和適應(yīng)性。

雖然干旱脅迫會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)育，但是一定程度的干旱脅迫能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株株高、地徑的生長(zhǎng)，使其在逆境中表現(xiàn)出更好的適應(yīng)性。干旱脅迫會(huì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，植物可通過(guò)調(diào)節(jié)自身體內(nèi)酶活性等生理指標(biāo)，對(duì)脅迫作出反應(yīng)。葉綠素是光合作用中最重要的色素，隨著干旱程度的增加，葉綠素a的穩(wěn)定性遭到破壞，SOD和POD是植物體內(nèi)膜系統(tǒng)的重要抗氧化酶，能夠清除植物體內(nèi)的自由基，MDA可作為植物受脅迫損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)[19]。本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量、SOD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，POD活性呈升高-降低-升高的趨勢(shì)，MDA含量呈先降低再升高的趨勢(shì)，以上試驗(yàn)結(jié)果與潘昕等[14]對(duì)尾巨桉和竹柳的研究、張雕等[20]對(duì)‘菊花桃’幼苗葉綠素a含量、葉綠素b含量、SOD活性、POD活性、MDA含量等指標(biāo)的研究結(jié)果相似。干旱脅迫使轉(zhuǎn)PtWOX11/12a基因河北楊通過(guò)調(diào)節(jié)自身生理特性適應(yīng)干旱環(huán)境，表現(xiàn)出了良好的抗旱性，同時(shí)為日后轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)抗旱育種提供參考。