沙地云杉菌根真菌的鑒定及其促生作用

張勝男，楊制國(guó)，袁立敏，胡小龍

(1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)沙地(沙漠)生態(tài)系統(tǒng)與生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

菌根是菌根真菌菌絲與高等植物營(yíng)養(yǎng)根系形成的聯(lián)合共生體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約97% 的陸生維管植物都能形成菌根結(jié)構(gòu)。有研究表明，菌根真菌能夠增強(qiáng)植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收、促進(jìn)光合作用、提高植物的抗旱能力[1-3]、改善和增加植株的生物量[4]。Smits等[5]研究認(rèn)為，樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)幼苗接種外生菌根真菌，能夠顯著提高根際土壤有效磷的含量并促進(jìn)植株生長(zhǎng)。Zhang等[6]研究表明，油松(Pinustabuliformis)幼苗接種外生菌根真菌Handkeautriformis、Suilluslactifluus和Suillustomentosus能夠顯著提高幼苗根干重及根系活力。溫祝桂等[7]研究表明，將外生菌根真菌接種至黑松(Pinusthunbergii)根部，顯著提高了針葉葉綠素a、葉綠素b的含量，增加了黑松體內(nèi)脯氨酸含量，同時(shí)顯著降低幼苗根Na+/K+比值，從而促進(jìn)了幼苗的生長(zhǎng)。因此，菌根真菌在植物生長(zhǎng)和土壤肥力改善中具有非常重要的作用。

沙地云杉(Piceamongolica)是內(nèi)蒙古渾善達(dá)克沙地特有鄉(xiāng)土樹(shù)種之一，天然林集中分布在克什克騰旗的白音敖包自然保護(hù)區(qū)。森林火災(zāi)、病蟲(chóng)害使沙地云杉林的面積不斷縮減，種群恢復(fù)工作刻不容緩。目前，關(guān)于沙地云杉菌根的相關(guān)研究大多集中于系統(tǒng)分類方面[8-9]，而對(duì)菌根促進(jìn)生長(zhǎng)等方面研究較少。基于以上原因，開(kāi)展了分離鑒定沙地云杉菌根真菌的工作，并分析其促生作用，該研究對(duì)沙地云杉育苗以及種群恢復(fù)具有重要意義。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于內(nèi)蒙古自治區(qū)克什克騰旗的白音敖包自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，地理坐標(biāo)為43°31′03′′—43°31′29′′N，117°11′02′′—117°11′28′′E，平均海拔 1 338.43 m，屬溫帶草原氣候，年平均氣溫 -1.4 ℃，無(wú)霜期131 d，年降水量360～440 mm，集中于6—8月，年平均蒸發(fā)量1 036 mm。土壤為沙質(zhì)灰色森林土。沙地云杉天然林長(zhǎng)勢(shì)良好，林下主要野生植物有蒙古黃芪(Astragalusmongholicus)、防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata)、山刺玫(Rosadavurica)、扁蓿豆(Medicagoruthenica)和披堿草(Elymusdahuricus)等。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

沙地云杉根段樣品于2017年7月采集。選擇5～10 a生的沙地云杉幼苗20株，選擇一側(cè)挖出沙地云杉根部，取直徑1～5 mm的根段若干，放入無(wú)菌自封袋中，置于4 ℃車載冰箱保存，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離。沙地云杉種子采自白音敖包自然保護(hù)區(qū)沙地云杉天然林。盆栽育苗土壤為沙地云杉天然林土壤和蛭石以體積比1∶1混合。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1菌根真菌分離

將采集的沙地云杉根段進(jìn)行鏡檢，對(duì)具有菌絲團(tuán)的根段在流動(dòng)自來(lái)水下沖洗干凈。將根段轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)中，用 75% 乙醇浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用 2% 次氯酸鈉溶液浸泡12 min，充分消毒后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次。消毒后的根段置于無(wú)菌操作臺(tái)中自然風(fēng)干，根段兩端用滅菌的剪刀剪斷棄除，根段中間部分置于PDA培養(yǎng)基上，兩端緊貼培養(yǎng)基表面，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置4段根段。吸取500 μL最后一次消毒的無(wú)菌水洗滌液涂布于PDA培養(yǎng)基上檢測(cè)是否徹底消毒。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，待菌落長(zhǎng)出后采用菌絲尖端切割分離法進(jìn)行菌落純化，直至獲得純菌。

2.2.2菌根真菌鑒定

采用分子生物學(xué)手段對(duì)沙地云杉菌根真菌進(jìn)行鑒定。在培養(yǎng)過(guò)程中觀察菌落的大小、質(zhì)地、顏色、邊緣等形態(tài)特征。同時(shí)，在培養(yǎng)皿上刮取足量的活化后菌絲，加液氮研磨成粉末后采用CTAB法提取真菌基因組DNA。以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物擴(kuò)增其ITS序列。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2.0 μL 10 × Ex Taq buffer，1.6 μL 2.5 mM dNTP Mix，0.8 μL ITS1，0.8 μL ITS4，0.5 μL模版DNA，0.2 μL 5u Ex Taq和 14.1 μL ddH2O。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)校對(duì)后通過(guò)GenBank的Blast進(jìn)行在線同源性比對(duì)，明確沙地云杉菌根真菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

2.2.3促生作用分析

將分離獲得的純菌分別接種于硅酸鹽和難溶性磷酸三鈣固體PKO培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10 d，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。

將收集的沙地云杉天然林土壤除去植物根，與蛭石按體積比1∶1混合均勻，分別裝入紙杯中，121 ℃高溫高壓滅菌20 min，晾涼后在杯中放入6粒經(jīng)次氯酸鈉消毒的種子，澆入無(wú)菌水，待其發(fā)芽并持續(xù)培養(yǎng)4個(gè)月。

將篩選獲得的純菌在PDA培養(yǎng)基上重新活化，25 ℃培養(yǎng)7 d備用。將生長(zhǎng)4個(gè)月的沙地云杉幼苗拔出，切斷少量根部，刮取約2 g培養(yǎng)好的菌根真菌菌絲接種至根部并將幼苗移栽至育苗缽中，育苗缽?fù)寥罏樯车卦粕继烊涣滞寥琅c蛭石按體積比1∶1混合的滅菌土壤。每個(gè)育苗缽中移栽1株沙地云杉幼苗，接種菌根真菌的沙地云杉分別以菌種編號(hào)表示，分別為YSF1、YSF2、YSF3、YSF5、YSF6、YSF7、YSF8、YSF9；以不接種的沙地云杉幼苗為空白對(duì)照，并以YSCK標(biāo)識(shí)。每個(gè)處理10次重復(fù)，共9種處理，合計(jì)90株。將沙地云杉幼苗置于光照充足的試驗(yàn)大棚中，培養(yǎng)溫度約為25 ℃，光照12 h·d-1，定時(shí)觀測(cè)并澆無(wú)菌水保持土壤濕潤(rùn)。

2.2.4測(cè)定項(xiàng)目及指標(biāo)

菌根真菌接種沙地云杉幼苗6個(gè)月后，全部拔出，將根際及根圍土壤風(fēng)干待用。自來(lái)水清洗根部并用吸水紙吸干水分，從根基處測(cè)量沙地云杉株高；用剪刀從根基處剪斷，將幼苗地上部分和根放入烘箱，80 ℃烘干24 h測(cè)定干物質(zhì)量。土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用重鉻酸鉀法，全氮和全磷測(cè)定采用高氯酸-硫酸消化法，全鉀測(cè)定采用氫氟酸-高氯酸消化法，速效氮測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法，速效磷測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提-分光光度法，速效鉀測(cè)定采用醋酸銨溶液浸提-原子吸收法。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，繪圖由Origin 8.6軟件完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌根真菌的鑒定和種類組成

將沙地云杉的根段貼在培養(yǎng)基上進(jìn)行菌根真菌的分離培養(yǎng)，共獲得8株菌根真菌。依據(jù)菌落形態(tài)觀察(圖1)。其中，YSF1為淡紅色菌落，菌落邊緣不規(guī)則；YSF2、YSF3和YSF9菌落為白色-淺棕相間，且有同心輪紋，邊緣整齊；YSF5菌落為淺棕-深棕相間，有同心輪紋，邊緣整齊；YSF6菌落為褐色，不規(guī)則邊緣；YSF7和YSF8菌落顏色不同，培養(yǎng)7 d均能平鋪整板，生長(zhǎng)迅速，菌落邊緣不規(guī)則。

圖1 沙地云杉菌根真菌的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of mycorrhizal fungi from Picea mongolica

將獲得的菌根真菌ITS序列與GenBank中公布的親緣關(guān)系相近的菌種進(jìn)行Blast在線比對(duì)，此8株菌分別為FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF2、Mycetinissp. YSF3、MarasmiusscorodoniusYSF5、Podosporasp. YSF6、AmbomucorsenatoinflatusYSF7、AmbomucorsenatoinflatusYSF8和Mycetinissp. YSF9。其中，2株歸于子囊菌門(mén)，4株歸于擔(dān)子菌門(mén)，2株歸于毛霉菌門(mén)；在目水平上，1株歸于肉座菌目，1株歸于糞殼菌目，4株歸于傘菌目，2株歸于毛霉目，傘菌目為優(yōu)勢(shì)目，占比50%。

3.2 促生作用分析

將分離獲得的純菌接種在PKO和硅酸鹽選擇性培養(yǎng)基上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出，初步分析其溶磷和溶鉀能力。結(jié)果表明(圖2、圖3)，菌株FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF3、Podosporasp. YSF6和AmbomucorsenatoinflatusYSF8能夠在PKO固體平板上長(zhǎng)出，透明圈直徑與菌落直徑之比在 1.04～1.33 之間，其中Mycetinissp. YSF3具有最大圈徑比。Podosporasp. YSF6還能夠在硅酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但并未產(chǎn)生透明圈。

圖2 菌根真菌溶磷情況Fig.2 Phosphorus solubilization of mycorrhizal fungi

將8株菌根真菌接種至沙地云杉幼苗根部進(jìn)行促生作用分析，結(jié)果表明(圖4)，接種Mycetinissp. YSF2和Mycetinissp. YSF9的沙地云杉幼苗株高分別比空白對(duì)照提高 5.15% 和 3.61%，但未達(dá)到顯著性差異，其他菌株在6個(gè)月生長(zhǎng)期內(nèi)對(duì)沙地云杉幼苗株高沒(méi)有明顯促進(jìn)作用。由圖4可見(jiàn)，MarasmiusscorodoniusYSF5處理的沙地云杉地上部分干重比空白對(duì)照提高 20.44%，其他菌株均無(wú)顯著促進(jìn)效果；而多數(shù)菌株能夠明顯促進(jìn)根的生長(zhǎng)，其中FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF2、MarasmiusscorodoniusYSF5、AmbomucorsenatoinflatusYSF7和Mycetinissp. YSF9分別比空白對(duì)照提高 53.68%、60.00%、67.37%、41.05% 和 32.11%，且YSF5達(dá)到顯著提高水平。由此說(shuō)明，接種菌根真菌在6個(gè)月生長(zhǎng)期內(nèi)明顯提高了沙地云杉幼苗根的干物質(zhì)量。

將沙地云杉幼苗連根拔出，收集根際及根圍土壤并測(cè)定養(yǎng)分含量。由表1可知，接種菌根真菌可明顯提高土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和速效氮的含量。與空白對(duì)照相比，接種菌根真菌后土壤有機(jī)質(zhì)含量提高 23.99%～101.34%，全氮含量提高 27.27%～212.12%，速效氮含量提高 15.07%～52.48%。但接種菌根真菌對(duì)土壤全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量無(wú)明顯影響。

注：不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

表1 不同處理沙地云杉根圍土壤養(yǎng)分含量Tab.1 Nutrient content of rhizosphere soil of Picea mongolica with different treatments

4 討論

菌根與沙地云杉長(zhǎng)期共生，目前對(duì)沙地云杉外生菌根的研究主要集中于調(diào)查分類方面。尹彬[9]對(duì)沙地云杉外生菌根的宏觀形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并描述了Conococum、Cortinarius和Tomentella的外部形態(tài)特征。田慧敏[10]在白音敖包自然保護(hù)區(qū)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)8種沙地云杉外生菌根真菌，分別為毒粘滑菇(Hebelomacrustiliniforme)、大孢滑銹傘(H.sacchriolens)、紅褐絲蓋傘(Inocybefriesii)、灰鎖瑚菌(Clavulinacinerea)、花形地星(Geastrumfloriforme)、小地星(G.minimum)、矮小地星(G.namum)和尖頂?shù)匦?G.triplex)。木蘭[11]進(jìn)一步調(diào)查了白音敖包自然保護(hù)區(qū)沙地云杉外生菌根真菌，包括辣牛肝菌(Chalciporuspiperatus)、花形地星、橙黃疣柄牛肝菌(Leccinumaurantiacum)、褐疣柄牛肝菌(L.scabrum)、銅綠紅菇(Russulaaeruginea)、平滑紅菇(R.aquosa)、葡紫紅菇(R.azurea)、美味紅菇(R.delica)、異褶紅菇(R.heterophylla)、全緣紅菇(R.integra)、較小紅菇(R.minutula)、毒粘滑菇和草黃口蘑(Tricholomalascivum)13種。前人報(bào)道的沙地云杉外生菌根主要集中于滑菇屬(Hebeloma)、地星屬(Geastrum)和紅菇屬(Russula)。本研究中，共獲得皮傘屬(Mycetinis)3株，Ambomucor屬2株，鐮刀菌屬(Fusarium)、Podospora屬和小皮傘屬(Marasmius)各1株，皮傘屬為優(yōu)勢(shì)菌，這可能與采集的沙地云杉樹(shù)齡不同有關(guān)。有研究表明，植物在不同生長(zhǎng)階段對(duì)養(yǎng)分的需求逐漸改變，通常隨著植物成年光合作用增強(qiáng)，對(duì)菌根真菌的依賴減弱，菌根真菌類群也隨之發(fā)生變化[12]。

本研究中，接種菌根真菌對(duì)沙地云杉的株高沒(méi)有顯著促進(jìn)作用。沙地云杉自然生長(zhǎng)緩慢，試驗(yàn)時(shí)間短可能沒(méi)有明顯變化，后期將增加長(zhǎng)期觀測(cè)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確菌根真菌對(duì)沙地云杉株高的促進(jìn)作用。此外，本研究中接種菌根真菌對(duì)土壤全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量無(wú)明顯促進(jìn)作用，僅對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和速效氮含量明顯提升。Rillig[13]研究表明，外生菌根真菌不僅能夠從寄主植物根系獲取大量碳源，同時(shí)也能夠釋放更多的碳源到土壤中，菌根真菌更高的分泌速率導(dǎo)致輸入土壤中的碳通量更大。此外，還有研究表明，菌根有助于植物對(duì)土壤氮素的積累[14]。外生菌根真菌可通過(guò)產(chǎn)生氮降解酶來(lái)獲得更豐富的有機(jī)氮源[15]。Jargeat等[16]研究表明，宿主植物根系全氮的 75% 均來(lái)自于與其共生的根外菌絲吸收的氮素。張哲超等[17]在小果白刺(Nitrariasibirica)根部接種叢枝菌根，與對(duì)照組相比，接種處理顯著增加了土壤有機(jī)碳含量，還使得土壤全氮含量顯著提高了 152.54%。因此，接種菌根真菌對(duì)于土壤有機(jī)質(zhì)和氮素提升發(fā)揮了重要作用。土壤全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量提升不明顯可能與取樣以及試驗(yàn)短期效應(yīng)有關(guān)，本研究中將沙地云杉根際和根圍土壤混合后測(cè)定土壤養(yǎng)分，根圍土壤對(duì)于根際效應(yīng)響應(yīng)不強(qiáng)烈，可能是導(dǎo)致土壤養(yǎng)分提升不明顯的重要因素[18]，而試驗(yàn)周期較短也會(huì)對(duì)土壤養(yǎng)分的改善效果不明顯。

5 結(jié)論

沙地云杉根段多數(shù)會(huì)定殖菌根真菌，其中皮傘屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。接種菌根真菌明顯提高了沙地云杉幼苗根的干物質(zhì)量、土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和速效氮含量，分別提高 14.74%～67.37%、23.99%～101.34%、27.27%～212.12% 和 15.07%～52.48%?？傮w而言，MarasmiusscorodoniusYSF5具有更強(qiáng)的促生能力，Mycetinissp. YSF2、AmbomucorsenatoinflatusYSF7和Mycetinissp. YSF9次之。這些菌株可作為沙地云杉育苗和造林的菌種資源儲(chǔ)備。