響應(yīng)面優(yōu)化水解黑豆7S球蛋白制備抗氧化肽的研究

張茂迎，趙淼，劉暢，厲煜偉，李躍輝，楊鳳旭，鄒險(xiǎn)峰

(長(zhǎng)春大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130022)

黑豆(black bean)是一種豆科大豆屬植物大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)的黑色種子。黑豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，黑豆中含有高達(dá)36%～40%的蛋白質(zhì)，大約是肉類(lèi)含量的2倍、雞蛋的3倍、牛奶的12倍；黑豆的賴(lài)氨酸高于其他顏色的大豆，因此有“植物蛋白之王”的美譽(yù)[1]。

黑豆蛋白中的有些序列處于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，沒(méi)有展現(xiàn)活性，經(jīng)過(guò)酶解后，將這些序列釋放出來(lái)，才表現(xiàn)出生理活性。黑豆多肽一般是用酶水解法或發(fā)酵法來(lái)制備的一種混合肽，通常由2～20個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量<10000 Da，而且不同的肽具有不同的氨基酸序列[2]。黑豆多肽含有人體所需的8種必需氨基酸，且含量較高[3]。

有研究表明，黑豆多肽具有抗氧化性，能夠清除體內(nèi)的自由基[4]，而且除抗氧化性外，黑豆多肽還有降血脂、降血壓[5]、降低膽固醇[6]、抗疲勞[7]等功效。目前一般用酶解法、化學(xué)法以及輔助提取法等方式來(lái)制備黑豆多肽[8-9]。許慶鵬等通過(guò)堿性蛋白酶水解豌豆蛋白制備水解肽，水解肽的分子質(zhì)量越小，抗氧化能力越強(qiáng)[10]。高嘉唯等通過(guò)對(duì)英國(guó)紅蕓豆蛋白進(jìn)行酶解，酶解肽的總抗氧化能力高達(dá)186.97 U/mg[11]。張浩玉等采用堿性蛋白酶水解法酶解綠豆蛋白，制備出的綠豆蛋白水解肽具有羥自由基消除能力，在25 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值61.3%[12]。同時(shí)，通過(guò)生物酶法制備的水解肽有一些是呈味肽和生物活性肽[13]。范海茹等以高溫豆粕為原料，通過(guò)探究不同的酶組合連續(xù)水解制備鮮味肽[14]。

本試驗(yàn)以黑豆7S球蛋白為原料，采用堿性蛋白酶水解黑豆7S球蛋白制備抗氧化肽，以羥自由基清除率為指標(biāo)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化黑豆7S球蛋白酶解制備抗氧化肽清除羥自由基的工藝條件，為研究7S球蛋白水解肽的抗氧化活性、分離純化及生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黑豆：市售；堿性蛋白酶(酶活力200000 U/g)：北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司。氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、氯化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；UV-1900型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；XIANOU-12型冷凍干燥機(jī) 吉林省華業(yè)科教儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器有限公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；GDE酶消解池 意大利VELP公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑豆7S球蛋白的提取工藝

黑豆7S球蛋白的提取工藝參照Nagano等的方法[15-16]并稍加修改：黑豆→粉碎→過(guò)篩→石油醚脫脂過(guò)夜重復(fù)3次→脫脂黑豆粉→加水混合→調(diào)節(jié)pH至7.5(1 mol/L NaOH)→提取2 h→離心(9000 r/min，15 min)→上清液→添加亞硫酸鈉(0.98 g/L)→調(diào)節(jié)pH至6.4→4 ℃過(guò)夜→離心(9000 r/min，15 min)→上清液→添加NaCl(0.25 mol/L)→調(diào)節(jié)pH至5.0(1 mol/L HCl)→提取1 h→離心(8500 r/min，30 min)→上清液冰水稀釋2倍→調(diào)節(jié)pH至4.8(1 mol/L HCl)→離心(8500 r/min，15 min)→沉淀→凍干→黑豆7S球蛋白。

1.3.2 黑豆7S球蛋白的酶解工藝

黑豆7S球蛋白→加超純水?dāng)嚢枞芙狻?5 ℃水浴加熱→冷卻至25 ℃→調(diào)節(jié)pH值→加酶水解一定時(shí)間→95 ℃加熱10 min滅酶→離心(5000 r/min，15 min)取上清液→測(cè)定羥自由基清除率。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)以黑豆7S球蛋白為原料，研究堿性蛋白酶水解制備抗氧化肽的工藝，以羥自由基清除率作為指標(biāo)。以黑豆7S球蛋白質(zhì)量作為基準(zhǔn)，以酶解溫度、pH、酶解時(shí)間以及酶添加量單因素進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3.1 酶解溫度對(duì)羥自由基清除率的影響

酶解時(shí)間90 min、pH 9.0、酶添加量8000 U/g作為固定條件，測(cè)定當(dāng)酶解溫度為40，45，50，55，60 ℃條件下制備的水解肽對(duì)羥自由基清除率的影響。

1.3.3.2 pH對(duì)羥自由基清除率的影響

酶添加量8000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間90 min作為固定條件，測(cè)定當(dāng)pH為8.0，8.5，9.0，9.5，10.0條件下制備的水解肽對(duì)羥自由基清除率的影響。

1.3.3.3 酶解時(shí)間對(duì)羥自由基清除率的影響

酶解溫度50 ℃、pH 9.0、酶添加量8000 U/g作為固定條件，測(cè)定當(dāng)酶解時(shí)間為30，60，90，120，150 min條件下制備的水解肽對(duì)羥自由基清除率的影響。

1.3.3.4 酶添加量對(duì)羥自由基清除率的影響

pH 9.0、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度50 ℃作為固定條件，測(cè)定當(dāng)酶添加量為4000，6000，8000，10000，12000 U/g條件下制備的水解肽對(duì)羥自由基清除率的影響。

1.3.4 羥自由基清除率的測(cè)定

羥自由基的測(cè)定參照羅丹明B-Fenton體系光度法[17]。

1.3.4.1 空白體系光密度值的測(cè)定

在2 mL Tris-HCl緩沖液中加入6.6 mL H2O和1.4 mL羅丹明B混勻，放置5 min后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處的吸光度，記錄為A。

1.3.4.2 羥自由基的測(cè)定

在2 mL Tris-HCl緩沖液中加入4.6 mL H2O、1.4 mL羅丹明B、1 mL Fe2+和1 mL H2O2混勻，放置5 min后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處的吸光度，記錄為A1。

1.3.4.3 樣品對(duì)羥自由基的清除作用

在2 mL Tris-HCl緩沖液中加入3.6 mL H2O、1.4 mL羅丹明B、1 mL不同濃度的肽溶液、1 mL Fe2+和1 mL H2O2混勻，放置5 min后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處的吸光度，記錄為A2。

式中：Y為羥自由基清除率，%；A為空白吸光度；A1為羥自由基吸光度；A2為樣品清除自由基吸光度。

1.3.5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的原理，選取酶解溫度(X1)、pH(X2)、酶解時(shí)間(X3)和酶添加量(X4)4個(gè)因素作為自變量，以羥自由基清除率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，并用 Origin 2019 軟件作圖。使用Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)式回歸擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆7S球蛋白酶解單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度對(duì)羥自由基清除率的影響

圖1 酶解溫度對(duì)羥自由基清除率的影響Fig.1 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖1可知，在酶解溫度40～50 ℃區(qū)間內(nèi)，羥自由基清除率的變化隨著溫度的提高而逐漸增大，在50 ℃以后，羥自由基清除率開(kāi)始降低。在溫度50 ℃時(shí)，羥自由基清除率最高，推測(cè)出堿性蛋白酶在50 ℃時(shí)發(fā)揮出較強(qiáng)的酶活性，水解產(chǎn)生更多的肽段，使羥自由基清除率增強(qiáng)。繼續(xù)升高溫度，酶可能部分失活，使酶不能充分水解7S球蛋白，因此羥自由基清除率比較低。因?yàn)槊钢挥性诤线m的溫度下才能發(fā)揮出最佳活性，高于最適溫度或者過(guò)低的酶解溫度都會(huì)影響酶的活性，所以最適酶解溫度為50 ℃。

2.1.2 pH對(duì)羥自由基清除率的影響

圖2 pH對(duì)羥自由基清除率的影響Fig.2 The effect of pH on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖2可知，隨著pH值的不斷增大，羥自由基的清除率也在不斷增大，在pH 9.0時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)pH大于9繼續(xù)提高時(shí)，羥自由基的清除率會(huì)不斷降低，這是因?yàn)閴A性蛋白酶只在pH 9.0下表現(xiàn)出較高的活性，當(dāng)堿性蛋白酶在pH過(guò)高時(shí)結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，或者不是適宜的pH條件下堿性蛋白酶不能發(fā)揮出應(yīng)有的酶活性，導(dǎo)致黑豆7S球蛋白無(wú)法完全水解，因此羥自由基清除率不斷下降[18]，所以最適酶解pH為9.0。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)羥自由基清除率的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)羥自由基清除率的影響Fig.3 The effect of enzymatic hydrolysis time on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖3可知，隨著酶解的進(jìn)行，時(shí)間在30～90 min的過(guò)程中，羥自由基清除率逐漸增大，在90 min時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加堿性蛋白酶的酶解時(shí)間，羥自由基清除率開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)?？赡苁请S著反應(yīng)的進(jìn)行，酶解時(shí)間延長(zhǎng)，一方面，酶活性逐漸喪失；另一方面，少量肽被酶解成氨基酸，使得抗氧化肽活性下降，所以，最適酶解時(shí)間為90 min。

2.1.4 酶添加量對(duì)羥自由基清除率的影響

圖4 酶添加量對(duì)羥自由基清除率的影響Fig.4 The effect of additive amount of enzyme on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖4可知，隨著堿性蛋白酶添加量的不斷增加，羥自由基的清除率同樣呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。在4000 U/g時(shí)羥自由基清除率最低，這可能是因?yàn)槊概c底物反應(yīng)不完全，產(chǎn)生較少的抗氧化肽，進(jìn)而影響了羥自由基的清除率。在8000 U/g時(shí)羥自由基清除率達(dá)到最大，這可能是酶與底物結(jié)合較完全，水解產(chǎn)生較多的抗氧化肽。隨著酶添加量的不斷增加，清除率降低，一方面，酶與底物結(jié)合，酶過(guò)量會(huì)抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行；另一方面，可能是酶過(guò)量使抗氧化肽水解成小分子肽段，抗氧化活性降低[19]，所以最佳酶添加量為8000 U/g。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

進(jìn)一步采用響應(yīng)面法對(duì)酶解黑豆7S球蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。以酶解溫度(X1)、pH(X2)、酶解時(shí)間(X3)、酶添加量(X4)作為自變量，羥自由基清除率作為響應(yīng)值的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得響應(yīng)面回歸方程：Y=55.37-2.00X1+1.14X2-0.17X3+1.32X4-0.26X1X2+1.58X1X3-1.27X1X4+2.34X2X3-0.51X2X4-0.19X3X4-4.88X12-3.49X22-3.70X32-2.81X42。

羥自由基清除率的回歸方程模型的方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸方程模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation model

由表3可知，對(duì)所建立的回歸模型進(jìn)行分析，模型的P<0.0001，表明該回歸模型極顯著；模型的失擬項(xiàng)不顯著，P為0.748，大于0.05。模型的決定系數(shù)(R2)為0.9603，調(diào)整決定系數(shù)(RAdj2)為0.9207，說(shuō)明此模型的實(shí)際測(cè)量結(jié)果與預(yù)測(cè)的結(jié)果擬合較好，誤差小。該模型中一次項(xiàng)X2、X4和交互項(xiàng)X1X3、X2X3均差異較顯著，一次項(xiàng)X1和二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42均差異極顯著。由F值可看出，4個(gè)因素對(duì)羥自由基清除率的影響順序依次為X1(酶解溫度)>X4(酶添加量)>X2(pH)>X3(酶解時(shí)間)。

圖5 酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)羥自由基清除率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface diagram and contour plot of the interaction of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on the scavenging rate of hydroxyl radicals

圖6 pH和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)羥自由基清除率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface diagram and contour plot of the interaction of pH and enzymatic hydrolysis time on the scavenging rate of hydroxyl radicals

交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可以由等高線的形狀反映出來(lái)，由圖5和圖6可知，交互作用等高線顏色變化明顯，而且呈橢圓形，說(shuō)明酶解溫度和酶解時(shí)間以及pH和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)羥自由基清除率的影響明顯。3D圖中，交互作用曲線較陡峭，隨著水平的增加，羥自由基清除率先增大后減小。

2.3 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design Expert 8.0.6軟件分析，得到羥自由基清除率最大的酶解條件：酶解溫度48.74 ℃、pH 9.07、酶解時(shí)間 88.79 min、酶添加量8559.67 U/g，預(yù)測(cè)羥自由基清除率為55.893%。為進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面的結(jié)果是否可靠，在實(shí)際操作過(guò)程中，將最佳條件調(diào)整為：酶解溫度49 ℃、pH 9.07、酶解時(shí)間88.79 min、酶添加量8560 U/g，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。最終試驗(yàn)結(jié)果得到的羥自由基清除率的平均值是56.03%±0.18，與分析值相差0.25%，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的結(jié)果比較吻合，說(shuō)明響應(yīng)面得出的最優(yōu)參數(shù)具有可行性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用單因素結(jié)合響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了堿性蛋白酶水解黑豆7S球蛋白對(duì)羥自由基清除率的影響，并根據(jù)實(shí)際操作得到最優(yōu)酶解參數(shù)：酶解溫度為49 ℃，pH為9.07，酶解時(shí)間為88.79 min，酶添加量為8560 U/g，在此條件下得到的羥自由基清除率為56.03%±0.18。為黑豆7S球蛋白水解肽進(jìn)一步應(yīng)用在食品加工以及調(diào)味品領(lǐng)域提供了依據(jù)。