復(fù)合益生菌和纖維素酶聯(lián)合發(fā)酵對小麥秸稈營養(yǎng)品質(zhì)的影響

謝全喜，侯楠楠，陳 靜，崔海英，孫明杰，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東 泰安 271000）

我國作為傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，小麥總產(chǎn)量位居世界第一位，其副產(chǎn)物小麥秸稈產(chǎn)量巨大[1]。前人對小麥秸稈多采用遺棄甚至焚燒等處理方式，造成資源浪費及嚴(yán)重的環(huán)境污染[2-3]，應(yīng)因地制宜發(fā)展不同的秸稈資源化利用模式[4]。近年來，隨著我國草食畜牧業(yè)如肉牛和肉羊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，生長所需的粗飼料量日益增加，缺口嚴(yán)重，開發(fā)本地粗飼料資源成為必然，小麥秸稈因資源豐富和價格低廉等優(yōu)勢成為必然選擇[5]。但小麥秸稈質(zhì)感粗硬，纖維含量較高（在30%左右），纖維素、半纖維素和木質(zhì)素以復(fù)合體形式存在，難以分解[6]，且細(xì)胞壁約占秸稈組成成分的80%，動物對細(xì)胞壁的主要成分木質(zhì)纖維素的利用率較低[7]。因此，需要對小麥秸稈進(jìn)行特殊處理，秸稈微貯飼料是一種新型的秸稈加工處理技術(shù)，應(yīng)用微生物代謝或額外添加纖維素酶降解纖維素等成分，同時將細(xì)胞內(nèi)碳水化合物等物質(zhì)釋放出來，提高粗蛋白和維生素含量，提升小麥秸稈利用價值[8-9]。索江華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶對小麥秸稈具有很好的降解效率，且對最適降解條件進(jìn)行了優(yōu)化。楊世帆等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼用復(fù)合菌劑黃貯玉米秸稈降低中性洗滌纖維含量，提高飼料中活菌數(shù)和乳酸含量。王婷[9]研究發(fā)現(xiàn)，對小麥秸稈經(jīng)益生菌發(fā)酵后40%代替普通麥秸飼喂綿羊，提高了干物質(zhì)、中性和酸性洗滌纖維的表觀消化率，提高了綿羊的生長性能。因此，本研究擬使用復(fù)合益生菌（植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）∶戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）∶釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）=3∶1∶1）和纖維素酶聯(lián)合對小麥秸稈進(jìn)行固體發(fā)酵，研究其對小麥秸稈營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質(zhì)的影響，以期為提高小麥秸稈的飼用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 小麥秸稈和復(fù)合益生菌

小麥秸稈（在自然條件下風(fēng)干，用粉碎機(jī)切至1～2 cm）、玉米面：泰安市周邊農(nóng)戶提供；復(fù)合益生菌（植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）∶戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）∶釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）=3∶1∶1，活菌總數(shù)≥1.0×109CFU/g）：山東寶來利來生物工程股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

氫氧化鈉（分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；檸檬酸銨（分析純）：上海撫生實業(yè)有限公司；硫酸（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；乙酸鈉（分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖（分析純）：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；纖維素酶（酶活≥10 000 U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、硫酸鎂0.05%、硫酸錳0.02%、檸檬酸銨0.2%、乙酸鈉0.5%、吐溫-80 0.1%、瓊脂1.5%、pH 6.0。121 ℃滅菌30 min。

孟加拉紅選擇性培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C雷磁精密pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DHP-9082數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：常州諾基儀器有限公司；KDN-103F自動定氮儀、HYP308消化爐：上海纖檢儀器有限公司；SD120D超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；SX2-4-10箱式電阻爐：龍口市電爐制造廠；LD5-2A低速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵小麥秸稈的制作

準(zhǔn)確稱取700 g小麥秸稈和50 g玉米面進(jìn)行充分混勻。試驗1組：添加2.0‰復(fù)合益生菌和5%的纖維素酶；試驗2組：添加2.0‰復(fù)合益生菌；以不接種益生菌或纖維素酶為對照組（CK）。將水分含量調(diào)節(jié)至60%～65%，裝入聚乙烯發(fā)酵袋中，用真空包裝機(jī)抽真空并封口，放置32 ℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵72 h。每組設(shè)3個重復(fù)，發(fā)酵結(jié)束后取樣進(jìn)行感官評定、含水率、pH值、微生物、營養(yǎng)成分、有機(jī)酸和揮發(fā)性鹽基氮含量檢測。

1.3.2 分析檢測

（1）發(fā)酵小麥秸稈含水率測定及感官評定

參照GB/T 6435—2014《飼料中水分的測定》對發(fā)酵小麥秸稈含水率進(jìn)行測定；參照地方標(biāo)準(zhǔn)DB50/T 669—2016《青貯飼料品質(zhì)鑒定》的方法從氣味、色澤、質(zhì)地和含水率方面對發(fā)酵小麥秸稈進(jìn)行感官評定。

（2）發(fā)酵小麥秸稈pH值和微生物數(shù)量測定

發(fā)酵結(jié)束后立即稱取發(fā)酵樣品10 g，加入90 mL蒸餾水中，用均質(zhì)器拍打使其充分混勻，再進(jìn)行過濾，濾液直接用pH計測定其pH值；

采用平板菌落計數(shù)法，分別檢測發(fā)酵小麥秸稈中乳酸菌、大腸桿菌和霉菌數(shù)量。乳酸菌參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》；霉菌參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》；大腸桿菌參照GB 4789.38—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)》。計數(shù)結(jié)果均以每克樣品中的菌落數(shù)（CFU/g）表示。

（3）營養(yǎng)成分含量的測定

粗蛋白含量（以干物質(zhì)計）參照國標(biāo)GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定》中的凱氏定氮法進(jìn)行測定；粗纖維（crude fiber，CF）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量參考范氏洗滌纖維分析法[12]測定。

（4）有機(jī)酸和揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

有機(jī)酸含量測定采用GB 5009.157—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中有機(jī)酸的測定》中的HPLC法，其色譜條件為：InertSustain AQ-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫箱溫度28 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動相為20 mmol/L的磷酸鹽溶液，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm。

揮發(fā)性鹽基氮含量：參照國標(biāo)GB/T 32141—2015《飼料中揮發(fā)性鹽基氮》中的方法進(jìn)行測定。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2013軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，最小顯著差（least significant difference，LSD）法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌和纖維素酶對發(fā)酵小麥秸稈感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵飼料成功的關(guān)鍵在于提供適宜的條件，為創(chuàng)造厭氧環(huán)境要把原料壓實，一般將發(fā)酵飼料適宜的水分含量調(diào)整為65%～70%[13]。由表1可知，與未發(fā)酵秸稈相比，含水量無顯著性差異（P＞0.05），菌酶發(fā)酵后秸稈均具有酸香味、松散不黏手且呈淡黃色。與孫貴賓等[14]研究結(jié)果一致。

表1 復(fù)合益生菌和纖維素酶對發(fā)酵小麥秸稈含水量及感官品質(zhì)的影響Table 1 Effects of compound probiotics and cellulase on moisture and sensory evaluation of fermented wheat straw

2.2 復(fù)合益生菌和纖維素酶對發(fā)酵小麥秸稈pH值及微生物數(shù)量的影響

pH值是衡量發(fā)酵飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[15]。由表2可知，試驗1組和試驗2組乳酸菌活菌數(shù)均顯著高于對照組（P＜0.05），且試驗1組復(fù)合益生菌和纖維素酶聯(lián)用，大腸桿菌未檢出，pH值最低，降至3.89，霉菌活菌數(shù)低于對照2.27個數(shù)量級，說明乳酸菌是小麥秸稈發(fā)酵的關(guān)鍵微生物，發(fā)酵前期乳酸菌快速繁殖產(chǎn)生大量乳酸，使pH值迅速降低，有效抑制有害菌（大腸桿菌和霉菌）的繁殖。酵母菌發(fā)酵后可增加小麥秸稈的營養(yǎng)價值，改善其適口性。這與郭萌萌[16]的研究結(jié)果一致，通過添加乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌等發(fā)酵玉米秸稈，降低pH值，有效控制有害菌增長。纖維素酶可降解植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性多糖為單糖，并為微生物發(fā)酵提供充分的底物，改善發(fā)酵小麥秸稈品質(zhì)[17]。本試驗中試驗1組菌酶聯(lián)合使用時乳酸菌活菌數(shù)最高，顯著高于其余各組（P＜0.05），原因可能是由于纖維素酶把小麥秸稈中多糖分解成寡糖或單糖的蛋白質(zhì)，為乳酸菌生長繁殖提供營養(yǎng)。

表2 復(fù)合益生菌和纖維素酶對發(fā)酵小麥秸稈pH值微生物數(shù)量的影響Table 2 Effects of compound probiotics and cellulase on pH value and microbial number of fermented wheat straw

2.3 復(fù)合益生菌和纖維素酶對發(fā)酵小麥秸稈營養(yǎng)品質(zhì)的影響

纖維素酶可降解植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性多糖為單糖，為微生物生長提供充分的底物，改善飼料品質(zhì)[17]。CHILSON J M等[18]研究表明，添加纖維素酶和乳酸菌可提高青貯品質(zhì)，促進(jìn)纖維素降解。本試驗中，與對照組相比，試驗1組和試驗2組由于益生菌的添加，顯著提高發(fā)酵小麥秸稈的粗蛋白含量（P＜0.05），其中以試驗1組最高，高出對照9.56%，這可能與小麥秸稈中纖維成分的降解促進(jìn)了微生物的生長，增加菌體蛋白相關(guān)，這與殷術(shù)鑫等[19]報道的添加劑的使用可以提高青貯的粗蛋白含量結(jié)果相同。與對照組相比，試驗2組只使用復(fù)合益生菌發(fā)酵，顯著降低粗纖維和酸性洗滌纖維含量（P＜0.05），中性洗滌纖維含量差異不顯著（P＞0.05）；與對照組相比，試驗1組菌酶聯(lián)合發(fā)酵粗纖維、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維分別顯著降低22.16%、16.42%和14.90%（P＜0.05）；與試驗2組相比，試驗1組使用纖維素酶和復(fù)合益生菌聯(lián)合發(fā)酵，顯著降低粗纖維、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量（P＜0.05）。纖維素酶對纖維成分的降解作用已被許多試驗證明，由于纖維素酶的添加對小麥秸稈纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了降解作用，造成纖維素酶和復(fù)合益生菌聯(lián)合使用中粗纖維、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量的降低所致。本試驗結(jié)果與毛建紅[20]研究結(jié)果相一致。

表3 復(fù)合益生菌和纖維素酶對發(fā)酵小麥秸稈營養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 3 Effects of compound probiotics and cellulase on nutritional quality of fermented wheat straw

2.4 復(fù)合益生菌和纖維素酶對發(fā)酵小麥秸稈有機(jī)酸和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

表4 復(fù)合益生菌和纖維素酶對發(fā)酵小麥秸稈有機(jī)酸和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Table 4 Effects of compound probiotics and cellulase on organic acid and total volatile base nitrogen contents of fermented wheat straw

乳酸是乳酸菌代謝的產(chǎn)物，乳酸含量的高低在一定程度上反映發(fā)酵飼料好壞[21]，乳酸的產(chǎn)量直接影響發(fā)酵飼料品質(zhì)，也是影響pH值的最主要因素，乳酸的產(chǎn)生可引起發(fā)酵飼料pH值下降，有效抑制腐敗菌的生長[22]。同時乳酸具有維持腸道菌群平衡，減少腹瀉，促進(jìn)鈣質(zhì)吸收的功能[23]。本試驗中試驗1組和試驗2組乳酸含量分別顯著高于對照組5.07倍和3.12倍（P＜0.05），其中以試驗1組菌酶聯(lián)合發(fā)酵最高，顯著高于其余各組（P＜0.05）。分析原因是由于纖維素酶降解纖維成分，為乳酸菌生長提供底物，促進(jìn)乳酸菌等益生菌生長繁殖，將小麥秸稈中碳水化合物進(jìn)行生物降解，轉(zhuǎn)化成乳酸等有機(jī)酸。乙酸會使發(fā)酵飼料產(chǎn)生酸味，降低適口性，并產(chǎn)生刺鼻的氣味。本試驗中，試驗1組菌酶聯(lián)合發(fā)酵小麥秸稈72 h時乙酸含量與對照組差異不顯著（P＞0.05）。與對照組相比，試驗1組菌酶聯(lián)合發(fā)酵顯著提高了酒石酸、蘋果酸和檸檬酸含量（P＜0.05）。

揮發(fā)性鹽基氮主要由植物酶對蛋白質(zhì)的降解和微生物分解利用蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生，反映蛋白質(zhì)的降解程度，優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵飼料應(yīng)該具有較低含量的揮發(fā)性鹽基氮[24]。本試驗中，與對照組相比，試驗1組和試驗2組揮發(fā)性鹽基氮含量分別顯著降低57.48%和30.67%（P＜0.05），這與興麗等[25]利用乳酸菌和纖維素酶同時添加顯著降低玉米青貯的氨態(tài)氮含量結(jié)果一致，分析原因可能是乳酸菌通過降低小麥秸稈在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的降解作用或抑制腐敗微生物的分解作用，從而降低揮發(fā)性鹽基氮含量。

3 結(jié)論

復(fù)合益生菌和纖維素酶聯(lián)合發(fā)酵小麥秸稈具有酸香味、松散不黏手且呈淡黃色；固體發(fā)酵72 h后pH值最低，為3.89，霉菌活菌數(shù)低于對照2.27個數(shù)量級，大腸桿菌未檢出；與未發(fā)酵小麥秸稈相比，菌酶聯(lián)合發(fā)酵粗纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維和揮發(fā)性鹽基氮分別降低22.16%、16.42%、14.90%和57.48%，乳酸含量提高了5.07倍。在本試驗條件下，該菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵小麥秸稈可顯著提高其發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值，為黃貯小麥秸稈添加劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。