基于HS-GC-IMS分析櫻桃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

劉寶祥，蘇政波 *，馬 闖，劉建軍

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院 山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

櫻桃的營(yíng)養(yǎng)非常豐富、味道鮮美，富含糖、維生素、氨基酸、有機(jī)酸和礦物質(zhì)等成分[1-2]。此外，櫻桃中還含有類黃酮、抗壞血酸、酚類、花青素等營(yíng)養(yǎng)健康成分[3-4]。我國(guó)種植櫻桃品種主要為甜櫻桃（Prunus aviumL.）、酸櫻桃（Prunus cerasusL.）、中國(guó)櫻桃（Prunus pseudocerasusL.）和毛櫻桃（Prunus tomentosaThunb），主要櫻桃產(chǎn)地為山東省、江蘇省和四川省[5]。由于櫻桃水分含量高，皮薄、肉軟，組織嬌嫩，采摘后不易儲(chǔ)存，導(dǎo)致櫻桃極易變味、變質(zhì)而失去價(jià)值[6]。隨著櫻桃產(chǎn)量的增加、人們對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求的提高，開發(fā)櫻桃酒等高附加值、易儲(chǔ)存的產(chǎn)品成為一種趨勢(shì)。

風(fēng)味是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是櫻桃酒最重要的特征和品質(zhì)之一。櫻桃中的主要風(fēng)味物質(zhì)為己烯醛、2-己烯-1-醇、乙醇、2-丙酮、乙醛、己醛、苯甲醛和苯甲醇[1]。經(jīng)過(guò)酵母菌發(fā)酵后，櫻桃酒的風(fēng)味成分變得更為復(fù)雜。在櫻桃酒中，可以檢測(cè)到許多成分：如氨基酸、微量元素、有機(jī)酸、酚類和風(fēng)味物質(zhì)等。風(fēng)味物質(zhì)是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的基本感官指標(biāo)之一，影響著最終產(chǎn)品的質(zhì)量。酒的風(fēng)味受到原料、菌種、發(fā)酵工藝、熟化過(guò)程等多種因素的影響[5，7-9]。在過(guò)去的研究中，數(shù)千種風(fēng)味物質(zhì)可以在果酒中被檢測(cè)到，但只有很少能夠達(dá)到氣味閾值并被聞到。NIU Y W等[10]通過(guò)固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，從櫻桃酒中檢出24種成分；結(jié)合氣相色譜-嗅聞技術(shù)（gas chromatography olfactometry，GC-O），確定了7種主要揮發(fā)性成分。SUN S Y等[11]利用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用，從櫻桃酒中檢出21種揮發(fā)性成分，包括6種酯類、2種醇類、6種萜類和1種酚類等。通過(guò)應(yīng)用頂空固相微萃?。╤eadspacesolid phase microextraction，HS-SPME）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、頂空-氣相色譜或氫火焰離子化檢測(cè)器（headspace-gas chromatography/flame ionization detector，HS-GC/FID）等技術(shù)手段，根據(jù)其所含的風(fēng)味物質(zhì)成分，分析原料、菌種、發(fā)酵方式和熟化過(guò)程等對(duì)櫻桃酒品質(zhì)的影響，并評(píng)價(jià)其質(zhì)量[12-15]。

離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）是一種能夠單獨(dú)檢測(cè)氣體混合物的分析儀器，具有小巧、輕便、靈敏、所需樣品少的特點(diǎn)[16-17]。通過(guò)與氣相色譜聯(lián)用后，經(jīng)過(guò)氣相色譜柱的初次分離，隨后進(jìn)入離子遷移管，待測(cè)分子在電離區(qū)帶電后，在電場(chǎng)和逆向漂移氣的作用下遷移到達(dá)檢測(cè)器檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)二次分離。它結(jié)合了二者優(yōu)勢(shì)，無(wú)需預(yù)處理、分辨率較高，僅需3～5 min就可以完成樣品的檢測(cè)[18]。在食品分類和摻假檢測(cè)、食品新鮮度和腐壞度評(píng)價(jià)、異味檢測(cè)、食品加工過(guò)程監(jiān)測(cè)、食品貯藏等過(guò)程中香氣變化評(píng)價(jià)具有極大的優(yōu)勢(shì)[19]。本實(shí)驗(yàn)以山東日照產(chǎn)新鮮櫻桃發(fā)酵而成櫻桃酒，通過(guò)頂空氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）研究櫻桃酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分，為理論研究和相關(guān)企業(yè)開發(fā)櫻桃產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃：山東省日照市五蓮山“紅燈”櫻桃；白砂糖：市售。

果膠酶（酶活力1 000 U/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司；果酒酵母：湖北安琪酵母有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）；產(chǎn)品用水為純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

CTC CombiPAL自動(dòng)頂空進(jìn)樣器：瑞士CTC Analytics AG公司；FlavourSpec氣相離子遷移譜、食品風(fēng)味分析與質(zhì)量控制系統(tǒng)（Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及GC×IMS Library Search Software定性軟件）：德國(guó)G.A.S公司；MJ-BL1052A料理機(jī)：廣東美的生活電器制造有限公司；L550低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HPX-200生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：北京醫(yī)療設(shè)備廠；AE 200電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 櫻桃酒制作基本工藝與操作要點(diǎn)

新鮮櫻桃→揀選→清洗→除?！ズ恕驖{→酶解→加糖→接種酵母菌→發(fā)酵→去渣→澄清→櫻桃酒

操作要點(diǎn)：

取適量新鮮櫻桃，去除其中的壞果、腐爛果和其他雜物，選擇成熟度良好、顏色深的新鮮櫻桃；手工摘除櫻桃的果梗，再去掉櫻桃核，將處理好的櫻桃加入料理機(jī)，直接將櫻桃進(jìn)行破碎、打漿；打漿好的櫻桃，加熱至50 ℃，加入一定量果膠酶，保溫并保持?jǐn)嚢? h；酶解過(guò)的櫻桃漿，加入15%白砂糖并溶解[20]，加入0.03%焦亞硫酸鈉，攪拌均勻，接種0.05%果酒酵母，于23 ℃條件下，保持靜置發(fā)酵7 d，至酒精度不再升高；發(fā)酵結(jié)束后使用離心機(jī)于4 000 r/min離心10 min，得到上層清液；經(jīng)檢測(cè)，酒精度為12.51%vol，還原糖含量9.7 g/L。

1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

殘?zhí)橇康臏y(cè)定：按照GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》執(zhí)行[21]；酒精度的測(cè)定：按照GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》執(zhí)行[22]。

1.3.3 HS-GC-IMS分析條件

頂空孵育溫度：35 ℃；孵育時(shí)間：10 min；孵育轉(zhuǎn)速500 r/min；頂空進(jìn)樣針溫度：40 ℃；進(jìn)樣體積：100.0 μL；色譜柱：FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm）；柱溫：60 ℃；IMS溫度：45 ℃；載氣：高純氮?dú)猓∟2）（純度≥99.999%）。

1.3.4 櫻桃酒中風(fēng)味物質(zhì)的特征化合物的香氣特征測(cè)定

基于LAV軟件的GalleryPlot插件，確定櫻桃酒中揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds，VOCs）圖譜，經(jīng)過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物質(zhì)定性分析，得到揮發(fā)性化合物的定性數(shù)據(jù)和峰面積數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)化合物的描述[23-24]，確定櫻桃酒中風(fēng)味物質(zhì)的特征化合物的香氣特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃酒風(fēng)味物質(zhì)圖譜分析

櫻桃酒揮發(fā)性物質(zhì)的GC-IMS三維圖譜見(jiàn)圖1，坐標(biāo)分別代表保留時(shí)間，遷移時(shí)間和峰強(qiáng)度，每個(gè)峰信號(hào)代表一種揮發(fā)性化合物，三維圖中可以直觀看出揮發(fā)性有機(jī)物。根據(jù)保留時(shí)間和遷移時(shí)間可以鑒定出揮發(fā)性化合物的種類，峰強(qiáng)度則可以比較化合物濃度的差別。

圖1 櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)三維離子遷移譜Fig.1 Three-dimensional (3D)-ion mobility spectrometry of volatile compounds in cherry wine

櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)二維圖譜見(jiàn)圖2，由圖2可以看出：櫻桃酒中的主要揮發(fā)性物質(zhì)在遷移時(shí)間0.8～1.8 ms，保留時(shí)間200～800 s的范圍內(nèi)。通過(guò)HS-GC-IMS在櫻桃酒中檢出38種物質(zhì)，對(duì)應(yīng)鑒定出23種揮發(fā)性有機(jī)物。

圖2 櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)二維離子遷移譜Fig.2 Two-dimensional (2D)-ion mobility spectrometry of volatile compounds in cherry wine

2.2 櫻桃酒中的風(fēng)味物質(zhì)分析

通過(guò)HS-GC-IMS檢出的物質(zhì)和相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1，結(jié)果表明，櫻桃酒中共檢出23種揮發(fā)性化合物，其中酯類9種，分別為辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸乙酯；醛類4種，分別為苯甲醛、糠醛、丙醛和戊醛；醇類5種，分別為己醇、3-甲基丁醇、丁醇、2-甲基丙醇和丙醇；酮類3種，分別為3-羥基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮和丙酮；此外，還有部分2,6-二甲基吡嗪和乙酸存在。

表1 GC-IMS檢測(cè)櫻桃酒中的揮發(fā)物參數(shù)Table 1 GC-IMS integration parameters of volatile compounds in cherry wine

續(xù)表

櫻桃酒的酯類成分尤為豐富，之前的報(bào)道中[12-14，25]，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸異丁酯為櫻桃酒中的主要揮發(fā)性化合物，異丁酸乙酯和乙酸丙酯的相對(duì)含量較低，其中丙酸乙酯和乙酸異丁酯未有在櫻桃酒檢測(cè)到的報(bào)道。醇類成分中，不考慮乙醇的存在，3-甲基丁醇、2-甲基丙醇和丙醇是櫻桃酒中的主要醇類風(fēng)味物質(zhì)，主要在酒精發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生，與先前的報(bào)道一致[13]，丁醇和己醇的相對(duì)含量較低。高級(jí)醇（包括丙醇、異丁醇、異戊醇和戊醇等）對(duì)酒類產(chǎn)品的風(fēng)味有很大的影響，主要由釀酒酵母通過(guò)Ehrlich循環(huán)或糖酵解途徑水解支鏈氨基酸產(chǎn)生[26]。高級(jí)醇的產(chǎn)生和含量的高低受到很多因素的影響，包括發(fā)酵溫度、氨基酸濃度、發(fā)酵罐尺寸和陳釀條件等[27-28]。苯甲醛主要來(lái)自于櫻桃果實(shí)中[29]，糠醛和戊醛主要產(chǎn)生于酵母菌發(fā)酵過(guò)程中。此外，4-甲基-2-戊酮、2,6-二甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮和丙酮作為櫻桃酒中重要的風(fēng)味成分，也有著重要的作用，同時(shí)風(fēng)味物質(zhì)中還有少量乙酸的存在。

2.3 櫻桃酒揮發(fā)性成分離子峰圖譜分析

基于LAV軟件的Gallery Plot插件，櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)的VOCs圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)Gallery Plot圖譜Fig.3 Gallery Plot of volatile compounds in cherry wine

由圖3可知，櫻桃酒中的揮發(fā)性成分含量較高主要為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁醇、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、丙醇、3-羥基-2-丁酮、丙酮、4-甲基-2-戊酮和戊醛，這些成分為櫻桃酒的主要揮發(fā)性風(fēng)味成分。從揮發(fā)性圖譜來(lái)看，2,6-二甲基吡嗪、異丁酸乙酯、乙酸、苯甲醛、糠醛、丙醛、丙醇和己醇的相對(duì)含量可能較低。

2.4 櫻桃酒風(fēng)味物質(zhì)的香氣特征分析

櫻桃中香氣成分十分復(fù)雜，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后帶來(lái)更為豐富的風(fēng)味。櫻桃酒中風(fēng)味物質(zhì)的特征化合物和香氣特征見(jiàn)表2，香氣類型分析圖見(jiàn)圖4。由表2和圖4可知，櫻桃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)的香氣類型主要為水果香氣，包括7種果香（fruity）：己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯和苯甲醛；3種柔和果香（ethereal）：乙酸丙酯、乙酸乙酯和2-甲基丙醇；此外，其他物質(zhì)也帶來(lái)青草（green）、白蘭地（waxy）、發(fā)酵（fermented）、烤面包（bready）、草本（herbal）、咖啡（coffee）、酒精（alcoholic）、黃油（buttery）、芳香氣味（solvent）、巧克力（chocolate）、酸味（acidic）等香氣，這些揮發(fā)性成分共同組成了櫻桃酒香氣的風(fēng)味和特征。

表2 櫻桃酒中風(fēng)味物質(zhì)的香氣成分及特征Table 2 Aroma components and characteristics of volatile compounds in cherry wine

圖4 櫻桃酒香氣類型分析圖Fig.4 Analysis diagram of aroma types of cherry wine

構(gòu)成櫻桃酒風(fēng)味成分的主要成分為酯類和醇類，酯類主要賦予櫻桃酒新鮮的水果香氣，乙醇和高級(jí)醇類賦予了櫻桃酒的酒精味道和其他復(fù)雜風(fēng)味。香氣特征為水果香的物質(zhì)除了苯甲醛外，其他全部為酯類。苯甲醛主要來(lái)自于櫻桃果實(shí)中，酯類主要為乙酸酯和脂肪酸乙酯，主要產(chǎn)生于發(fā)酵中期，來(lái)自醇類和?；o酶A的縮合反應(yīng)[30]。其他揮發(fā)性成分作為釀酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)物，為櫻桃酒帶來(lái)青香、蠟香、咖啡味、巧克力和酸味等其他風(fēng)味，使酒體的風(fēng)味構(gòu)成更為豐富。

3 結(jié)論

以新鮮櫻桃發(fā)酵生產(chǎn)櫻桃酒，通過(guò)HS-GC-IMS分析櫻桃酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分，獲得櫻桃酒的揮發(fā)性物質(zhì)圖譜。櫻桃酒中共檢出23種揮發(fā)性化合物，其中，酯類9種，醇類5種，醛類4種，酮類3種，吡嗪類1種和有機(jī)酸1種。結(jié)合櫻桃酒揮發(fā)性物質(zhì)圖譜和軟件分析，確定為辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、苯甲醛、糠醛、丙醛、戊醛、己醇、3-甲基丁醇、丁醇、2-甲基丙醇、丙醇、3-羥基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮、丙酮、2,6-二甲基吡嗪和乙酸為櫻桃酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)。其中，僅有苯甲醛和丙醛在櫻桃中存在，其他大部分由釀酒酵母在櫻桃酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生。經(jīng)過(guò)櫻桃酒的香氣特征分析，櫻桃酒的香氣特征主要為果香和柔和果香，其他物質(zhì)也帶來(lái)青香、蠟香、發(fā)酵香、烤面包香氣、咖啡、酒精、黃油、芳香氣味、巧克力、酸味等香氣，這些揮發(fā)性成分共同組成了櫻桃酒的風(fēng)味和特征。