不依賴IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)木糖醇大腸桿菌工程菌的構(gòu)建

唐 梅，蔡 松，楊東成，付聲亮，王金華，王永澤*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

木糖醇為五元醇，是木糖代謝的中間產(chǎn)物之一，與常見的糖醇如山梨醇、麥芽糖醇和甘露醇相比，具有明顯的優(yōu)越性[1]，不僅防齲齒發(fā)生，也能作為糖尿病人的食品，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[2-3]。近年來，木糖醇市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，國內(nèi)木糖醇的年產(chǎn)值己超過13億元，今后3年，國際市場(chǎng)上木糖醇總需求量將達(dá)10萬t以上[4-5]，因此，增加木糖醇的產(chǎn)量具有現(xiàn)實(shí)意義[6]。

以往的研究主要以酵母菌作為發(fā)酵菌株產(chǎn)木糖醇[7-9]。由于大腸桿菌（Escherichia coli）具有營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，關(guān)于大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的報(bào)道日益增多。然而，基于大腸桿菌BL21（DE3）[10-12]和大腸桿菌W3110[13]產(chǎn)木糖醇的過程中均需要添加誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)。盡管其誘導(dǎo)條件簡(jiǎn)單，只需要極少量就能穩(wěn)定地誘導(dǎo)乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄[14]，但I(xiàn)PTG不僅具有潛在的毒性而且價(jià)格昂貴，只作為實(shí)驗(yàn)室用于少量蛋白表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)劑，而且在大規(guī)模發(fā)酵中不占優(yōu)勢(shì)，不被各國藥典提倡使用。

為了避免大腸桿菌發(fā)酵或催化時(shí)添加IPTG，目前主要采用如下方式：以不同濃度的異乳糖和乳糖作為誘導(dǎo)劑，通過調(diào)節(jié)乳糖濃度，達(dá)到與IPTG誘導(dǎo)相當(dāng)?shù)男Ч鸞15-17]。但是乳糖可以被細(xì)胞代謝，不穩(wěn)定，且誘導(dǎo)條件不易掌握；添加乳糖醇[14，18]或者對(duì)苯甲酸異丙酯[19-20]來降低成本和毒性，但使用范圍不可預(yù)知；應(yīng)用非化學(xué)添加劑的啟動(dòng)子，如組成型啟動(dòng)子，但它完全不受到阻遏蛋白調(diào)控，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過慢。此外，溫敏型操縱子和厭氧型啟動(dòng)子，具有類似誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)的功能。lacI基因的溫度敏感突變體可在30 ℃條件下抑制轉(zhuǎn)錄，42 ℃開始發(fā)揮作用，熱誘導(dǎo)成本低，但在大型發(fā)酵罐中很難溫度轉(zhuǎn)換，其本身會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會(huì)影響產(chǎn)物的穩(wěn)定[21]。pflB-p6厭氧啟動(dòng)子可在厭氧條件下實(shí)現(xiàn)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的倍增，高還原力的產(chǎn)物有利于木糖醇的產(chǎn)生，但需要厭氧條件相關(guān)基因才能啟動(dòng)表達(dá)，這可能影響最終產(chǎn)量[22]。

在不添加IPTG的條件下，滲漏表達(dá)也可在一定程度上實(shí)現(xiàn)大腸桿菌發(fā)酵或者催化。張宏志等[23]通過控制lacI數(shù)量，研究了高滲漏條件下蛋白表達(dá)情況，雖然沒有完全去除誘導(dǎo)劑IPTG，但為實(shí)現(xiàn)無添加IPTG產(chǎn)木糖醇提供了一條新的思路。本研究通過構(gòu)建含有博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）的編碼醛糖還原酶xylI基因的重組質(zhì)粒（pWYZ-1與pWYZ-2），研究啟動(dòng)子、質(zhì)粒拷貝數(shù)、誘導(dǎo)劑IPTG的添加、基因xylA和xylB敲除、木糖濃度對(duì)工程菌發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響，以期實(shí)現(xiàn)大腸桿菌產(chǎn)木糖醇時(shí)無需添加IPTG。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒及其來源見表1。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒及其來源Table 1 Strains,plasmids and their origin used in this study

1.1.2 引物

本研究所用的引物序列見表2。

表2 本研究所用的引物和序列Table 2 Primers and sequences used in this study

1.1.3 試劑

木糖醇（純度＞99.9%）：上海麥克林生物有限公司；Primer STAR Max Premix（2×）：日本TaKaRa公司；IPTG（純度＞99.9%）：美國Sigma公司；T5核酸外切酶（10 U/μL）：中國新?；驒z測(cè)有限公司；膠回收試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：英國OXOID公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7。固體培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂粉。

種子培養(yǎng)基[22]：葡萄糖20 g/L、木糖10 g/L、酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl5g/L，滅菌后添加終質(zhì)量濃度為50mg/L的氨芐青霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基[22]：葡萄糖5 g/L、木糖20 g/L、酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，滅菌后添加終質(zhì)量濃度為100 mg/L的氨芐青霉素。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MicroPulserTM電穿孔儀、2 mm 1652082電擊杯、HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）：美國Bio-Rad公司；Waters e2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有示差檢測(cè)器）：美國Waters公司；5417R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；UV/VIS-2802PC可見光分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌AI05中xylA和xylB基因的敲除

為阻斷木糖的代謝利用，敲除E.coliAI05菌株自身代謝木糖的木糖A異構(gòu)酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB。具體步驟如下：

（1）xylA基因的敲除：以質(zhì)粒pKD4為模板，ΔxylA P1和ΔxylA P2為引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增打靶片段。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，43 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。xylB基因的敲除：以質(zhì)粒pKD4為模版，ΔxylB P1和ΔxylB P2為引物PCR擴(kuò)增打靶片段。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。所有打靶片段擴(kuò)增后切膠回收。

（2）采用CaCl2法將質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)入E.coliAI05感受態(tài)細(xì)胞中[24]，得到E.coliAI05/pKD46。

（3）將打靶片段電轉(zhuǎn)化到E.coliAI05/pKD46細(xì)胞中。挑選E.coliAI05/pKD46單菌落于LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.2～0.3時(shí)添加1.6%的L-阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm值為0.6左右，于4 ℃條件下6 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用超純水清洗菌體3～5次，最終菌體體積為200 μL，即得E.coliAI05/pKD46的感受態(tài)細(xì)胞。取80 μL感受態(tài)細(xì)胞加入8 μL打靶片段后，放入電擊杯，采用EC2程序（2 500 V）進(jìn)行電擊。電擊結(jié)束后迅速加入1 mL LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，30 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)2 h，再取100 μL涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24h，待平板上長(zhǎng)出單菌落后，以L-xylA-P1、L-xylA-P2或者L-xylB-P1、L-xylB-P2為鑒定引物，進(jìn)行菌落PCR，分別驗(yàn)證xylA和xylB基因敲除的結(jié)果。

（4）采用質(zhì)粒pFT-A消除大腸桿菌染色體上的卡那抗性基因[24]，將成功敲除xylA基因的菌株E.coliAI05命名為E.coliAI06；將成功敲除xylB基因的菌株E.coliAI06命名為E.coliAI07。

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在固定lacP啟動(dòng)子條件下，分別基于質(zhì)粒pUC19（高拷貝質(zhì)粒）和質(zhì)粒pBR322（中拷貝質(zhì)粒）構(gòu)建新質(zhì)粒pWYZ-1和pWYZ-2。

（1）以質(zhì)粒pAGI02作為模板，使用引物pUC19-xylI P1和pUC19-xylI P2PCR擴(kuò)增醛糖還原酶基因xylI；采用質(zhì)粒pUC19作為模板，使用反向引物pUC19/lac P1和pUC19/lac P2PCR擴(kuò)增得到序列長(zhǎng)度為2 362 bp的線性化質(zhì)粒pUC19，線性化質(zhì)粒pUC19為去除lacZα基因序列、保留lacO基因序列的質(zhì)粒；用T5外切酶將PCR擴(kuò)增出的醛糖還原酶基因xylI與線性化質(zhì)粒pUC19進(jìn)行外切處理[25]，取5 μL處理后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到100 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，將其涂布于含50 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，于30 ℃條件下培養(yǎng)20 h后，采用引物pUC19/lac P1和pUC19/lac P2對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，檢驗(yàn)克隆結(jié)果。提取檢驗(yàn)成功的菌落的重組質(zhì)粒，委托昆泰銳（武漢）生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pWYZ-1。質(zhì)粒pWYZ-1的圖譜見圖1。

圖1 質(zhì)粒pWYZ-1的圖譜Fig.1 Map of plasmid pWYZ-1

（2）以質(zhì)粒pBR322為模板，采用反向引物pBR322-F-P1和pBR322-F-P2PCR線性化質(zhì)粒pBR322，線性化質(zhì)粒pBR322為除去tetP和Tcr基因的序列，理論長(zhǎng)度為3 094 bp。以質(zhì)粒pWYZ-1為模板，采用引物pBR322-lacP-xylI P1和pBR322-lacP-xylI P2PCR擴(kuò)增lacO-xylI基因，堿基長(zhǎng)度為1 168 bp。用T5外切酶處理lacO-xylI基因和線性化質(zhì)粒pBR322載體，取5 μL處理后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到100 μLE.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將其涂布于含50 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，于30 ℃條件下培養(yǎng)20 h后，采用引物pBR322-lacP-xylI P1和pBR322-lacP-xylI P2對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，檢驗(yàn)克隆結(jié)果。提取檢驗(yàn)成功的菌落的重組質(zhì)粒，委托昆泰銳（武漢）生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pWYZ-2。質(zhì)粒pWYZ-2圖譜見圖2。

圖2 質(zhì)粒pWYZ-2的圖譜Fig.2 Map of plasmid pWYZ-2

1.3.3 工程菌的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pWYZ-2轉(zhuǎn)化到E.coliAI05中，得到基因工程菌E.coliAI05/pWYZ-2。將質(zhì)粒pAGI02、重組質(zhì)粒pWYZ-1和pWYZ-2分別化轉(zhuǎn)到E.coliAI07中，得到基因工程菌E.coliAI07/pAGI02、E.coliAI07/pWYZ-1和E.coliAI07/pWYZ-2。

1.3.4 工程菌種子液的制備

將工程菌E.coliAI05/pWYZ-2、E.coliAI07/pAGI02、E.coliAI07/pWYZ-1和E.coliAI07/pWYZ-2分別接種到含50 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃條件下活化3代；然后從平板上挑取3個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接至50 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h，作為種子液備用。

1.3.5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株E.coliAI07/pAGI02和E.coliAI07/pWYZ-1發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響

按照2%（V/V）的接種量將E.coliAI07/pAGI02、E.coliAI07/pWYZ-1分別接種于含有100mg/L氨芐青霉素的100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵溫度設(shè)置為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為0、50 r/min、100 r/min、150 r/min和200 r/min，振蕩培養(yǎng)96 h；每12 h向發(fā)酵搖瓶中補(bǔ)加100 μL氨芐青霉素（100 mg/L）；每24 h取2 mL發(fā)酵液，檢測(cè)菌株的OD600nm值、發(fā)酵液中的葡萄糖、木糖和木糖醇的含量。

1.3.6 質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株產(chǎn)木糖醇的影響

除了啟動(dòng)子種類外，質(zhì)?？截悢?shù)也是影響基因表達(dá)水平的重要因素。在固定lacP啟動(dòng)子條件下，考察了質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)木糖醇產(chǎn)量的影響。

按照2%（V/V）的接種量將E.coliAI07/pWYZ-1和E.coliAI07/pWYZ-2分別接種于含有100mg/L氨芐青霉素的100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵96 h。每12 h向發(fā)酵搖瓶中補(bǔ)加100 μL氨芐青霉素（100 mg/L）；每24 h取2 mL的發(fā)酵液，檢測(cè)發(fā)酵液中的葡萄糖、木糖和木糖醇的含量。

1.3.7 IPTG添加對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株產(chǎn)木糖醇含量的影響

當(dāng)質(zhì)粒上沒有l(wèi)acI基因表達(dá)阻遏蛋白時(shí)，lacP啟動(dòng)子僅靠大腸桿菌基因組表達(dá)少量阻遏蛋白來控制表達(dá)體系，因此，菌株E.coliAI07/pWYZ-2存在一定程度滲漏表達(dá)。加入IPTG后，這些少量的阻遏蛋白會(huì)進(jìn)一步從操縱位點(diǎn)離去，從而可進(jìn)一步提高xylI基因的轉(zhuǎn)錄水平。

為考察添加IPTG對(duì)木糖醇產(chǎn)量的影響，按照2%（V/V）的接種量將E.coliAI07/pWYZ-2接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件培養(yǎng)9.5 h，當(dāng)搖瓶中菌液OD600nm達(dá)到0.8～1.0時(shí)添加100 μL 0.1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG開始誘導(dǎo)（以不添加IPTG的組別為對(duì)照組），誘導(dǎo)至發(fā)酵結(jié)束。每12 h向發(fā)酵搖瓶中補(bǔ)加100 μL氨芐青霉素（100 mg/L）；每24 h取出2 mL的發(fā)酵液，檢測(cè)發(fā)酵液中的木糖醇的含量。

1.3.8 基因xylA和xylB敲除對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株產(chǎn)木糖醇含量的影響

按照2%（V/V）的接種量將E.coliAI07/pWYZ-2和E.coliAI05/pWYZ-2接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)96 h，每12 h向發(fā)酵搖瓶中補(bǔ)加100 μL氨芐青霉素（100 mg/L）。每24 h從搖瓶取出2 mL發(fā)酵液，檢測(cè)發(fā)酵液中木糖醇的含量。

1.3.9 木糖含量對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株產(chǎn)木糖醇含量的影響

為探索E.coliAI07/pWYZ-2轉(zhuǎn)化木糖的最大潛能，提高發(fā)酵原料即木糖的含量，同時(shí)維持木糖和葡萄糖質(zhì)量濃度比為4∶1，考察不同質(zhì)量濃度木糖下菌株產(chǎn)木糖醇的含量。按照2%（V/V）的接種量將E.coliAI07/pWYZ-2分別接種于含有100 mg/L氨芐青霉素和不同含量碳源（木糖20 g/L+葡萄糖5 g/L、木糖50 g/L+葡萄糖12.5 g/L、木糖80 g/L+葡萄糖20 g/L）的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至木糖醇含量達(dá)到最大值時(shí)結(jié)束發(fā)酵，每12 h向發(fā)酵搖瓶中補(bǔ)加100 μL氨芐青霉素（100 mg/L）。每24 h從搖瓶取出2 mL發(fā)酵液，檢測(cè)發(fā)酵液中木糖醇的含量，并記錄整個(gè)發(fā)酵過程中木糖醇含量達(dá)到最大值時(shí)所需的發(fā)酵時(shí)間和木糖醇的最高含量，并計(jì)算木糖醇生產(chǎn)強(qiáng)度。

1.3.10 分析檢測(cè)

OD600nm值的測(cè)定：采用可見分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值[26]。

葡萄糖、木糖和木糖醇質(zhì)量濃度的測(cè)定：將發(fā)酵液于12 000 r/min離心5 min，用超純水稀釋上清液至合適倍數(shù)，用0.22 μm的濾膜過濾，采用高效液相色譜法檢測(cè)濾液中的葡萄糖、木糖和木糖醇的含量[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 xylA和xylB基因的敲除結(jié)果

以內(nèi)部驗(yàn)證引物（L-xylA-P1和L-xylA-P2，L-xylA-P1和L-xylA-P2）分別對(duì)菌株E.coliAI05中編碼木糖A異構(gòu)酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB敲除的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。

圖3 xylA和xylB基因敲除菌的菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification result of xylA and xylB gene knockout strain by colony PCR

由圖3可知，擁有基因xylA和xylB的菌株經(jīng)過菌落PCR擴(kuò)增后，分別出現(xiàn)堿基長(zhǎng)度為913 bp和960 bp的核酸片段，而敲除這兩個(gè)基因后的菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后無該核酸片段，表明這兩個(gè)基因已成功敲除。

2.2 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株E.coli AI07/pAGI02和E.coli AI07/pWYZ-1產(chǎn)木糖醇的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)菌株E.coliAI07/pAGI02和E.coliAI07/pWYZ-1發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響見圖4。

由圖4可知，隨著轉(zhuǎn)速在0～200 r/min范圍內(nèi)的增加，兩株菌的OD600nm值、葡萄糖、木糖及木糖醇含量變化趨勢(shì)一致，其中OD600nm值與木糖醇產(chǎn)量呈升高的趨勢(shì)，而葡萄糖與木糖含量呈下降趨勢(shì)，表明生物量與木糖醇的產(chǎn)量存在著密切關(guān)系。當(dāng)轉(zhuǎn)速為0～100 r/min時(shí)，菌株E.coliAI07/pAGI02與E.coliAI07/pWYZ-1相比，木糖醇產(chǎn)量較高。分析原因可能是在低轉(zhuǎn)速（0～100 r/min）的條件下，菌株處于無氧或者微氧環(huán)境，具有厭氧啟動(dòng)子pflB-p6基因的菌株E.coliAI07/pAGI02菌株能表達(dá)更多醛糖還原酶，且還原力更強(qiáng)[26]，更有利于木糖醇的合成。而當(dāng)轉(zhuǎn)速為150～200 r/min時(shí)，菌株E.coliAI07/pAGI02與E.coliAI07/pWYZ-1相比，木糖醇產(chǎn)量較低且生物量和木糖都有顯著的提升。這表明厭氧啟動(dòng)子pflB-p6與lacP啟動(dòng)子對(duì)菌株產(chǎn)木糖醇含量有明顯影響。當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，E.coliAI07/pWYZ-1的木糖醇產(chǎn)量是E.coliAI07/pAGI02的1.8倍。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)Escherichia coli AI07/pAGI02和Escherichia coli AI07/pWYZ-1發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of rotation speed on Escherichia coli AI07/pAGI02 and Escherichia coli AI07/pWYZ-1 fermentation

2.3 質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株產(chǎn)木糖醇的影響

質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株E.coliAI07/pWYZ-1和E.coliAI07/pWYZ-2發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響見圖5。

由圖5可知，菌株E.coliAI07/pWYZ-2發(fā)酵產(chǎn)木糖醇含量高于菌株E.coliAI07/pWYZ-1，發(fā)酵48 h時(shí)，木糖醇含量分別達(dá)到19.56 g/L、7.90 g/L。說明中拷貝質(zhì)粒比高拷貝質(zhì)粒對(duì)菌株產(chǎn)木糖醇更有優(yōu)勢(shì)。

圖5 質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)Escherichia coli AI07/ pWYZ-1和Escherichia coli AI07/pWYZ-2發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of plasmid copy number on Escherichia coli AI07/pWYZ-1 and Escherichia coli AI07/pWYZ-2 fermentation

目前用于蛋白表達(dá)的載體多用中拷貝和高拷貝質(zhì)粒，高拷貝質(zhì)粒能提供更多的拷貝用于醛糖還原酶的表達(dá)，這更有利于提供木糖向木糖醇的轉(zhuǎn)化，但有些情況下，中拷貝質(zhì)粒在蛋白表達(dá)上更具有一定優(yōu)勢(shì)，有文獻(xiàn)報(bào)道顯示高拷貝質(zhì)粒作為表達(dá)載體會(huì)給宿主菌帶來沉重的生長(zhǎng)壓力，造成菌體內(nèi)代謝失衡，這不僅增加菌株生長(zhǎng)的延滯期，而且導(dǎo)致菌體最終生長(zhǎng)密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于中拷貝質(zhì)粒和低拷貝質(zhì)粒[27]。菌株E.coliAI05/pAGI02經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間保藏和傳代后，提取質(zhì)粒pAGI02并測(cè)序發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pAGI02出現(xiàn)部分堿基丟失現(xiàn)象，由此證明基于高拷貝質(zhì)粒pUC19改造的表達(dá)載體，在表達(dá)醛糖還原酶基因時(shí)具有一定的不穩(wěn)定性，這可能會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)。因此中拷貝質(zhì)粒pBR322比高拷貝質(zhì)粒pUC19更適合用于構(gòu)建醛糖還原酶基因xylI表達(dá)載體，用于菌株發(fā)酵產(chǎn)木糖醇。

2.4 IPTG添加對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響

IPTG的添加對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株E.coliAI07/WYZ-2發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響見表3。由表3可知，IPTG添加后木糖醇的含量?jī)H提高0.66g/L，表明IPTG添加對(duì)菌株E.coliAI07/WYZ-2發(fā)酵產(chǎn)木糖醇含量影響較小，菌株E.coliAI07/pWYZ-2發(fā)酵產(chǎn)木糖醇時(shí)，可不添加誘導(dǎo)劑IPTG。

表3 IPTG的添加對(duì)Escherichia coli AI07/WYZ-2發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響Table 3 Effect of adding IPTG on xylitol production by Escherichia coli AI07/WYZ-2 fermentation

2.5 基因xylA和xylB敲除對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)木糖醇含量的影響

基因xylA和xylB敲除對(duì)菌株產(chǎn)木糖醇的影響見圖6。

圖6 基因xylA和xylB敲除對(duì)Escherichia coli AI05/pWYZ-2、Escherichia coli AI07/pWYZ-2發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響Fig.6 Effect of genes xylA and xylB knockout on xylitol production by Escherichia coli AI05/pWYZ-2 and Escherichia coli AI07/pWYZ-2 fermentation

由圖6可知，發(fā)酵96 h時(shí)，菌株E.coliAI07/pWYZ-2產(chǎn)木糖醇的含量均顯著高于E.coliAI05/pWYZ-2（P＜0.01），說明敲除大腸桿菌進(jìn)入磷酸戊糖途徑的兩個(gè)酶基因xylA和xylB，可以避免大腸桿菌體內(nèi)其他代謝木糖的途徑，有利于提高木糖醇的產(chǎn)量。

2.6 木糖含量對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響

木糖含量對(duì)滲漏表達(dá)基因菌株發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響見表4。由表4可知，隨著木糖初始含量的增加，木糖醇產(chǎn)量呈升高的趨勢(shì)，但生產(chǎn)強(qiáng)度呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)木糖初始含量為80g/L時(shí)，木糖醇的生產(chǎn)強(qiáng)度下降至0.451g/（L·h），但木糖醇含量可達(dá)48.7 g/L。

表4 木糖含量對(duì)菌株Escherichia coli AI07/pWYZ-2發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的影響Table 4 Effect of xylose concentrations on the xylitol production by Escherichia coli AI07/pWYZ-2

3 結(jié)論

本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建不依賴異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)產(chǎn)木糖醇的工程菌E.coliAI07/pWYZ-2。當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，E.coliAI07/pWYZ-1（啟動(dòng)子為lacP）的木糖醇產(chǎn)量是E.coliAI07/pAGI02（啟動(dòng)子為pflB-p6）的1.8倍；E.coliAI07/pWYZ-2（中拷貝質(zhì)粒pBR322）發(fā)酵產(chǎn)木糖醇含量高于菌株E.coliAI07/pWYZ-1（高拷貝質(zhì)粒pUC19），分別為19.56 g/L、7.90 g/L；是否添加誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)E.coliAI07/pWYZ-2產(chǎn)木糖醇差異不大。發(fā)酵96 h時(shí)，木糖醇產(chǎn)量極顯著高于E.coliAI05/pWYZ-2（P＜0.01），其在不添加IPTG的條件下，當(dāng)木糖初始質(zhì)量濃度為80 g/L，發(fā)酵時(shí)間為108 h時(shí)，木糖醇產(chǎn)量達(dá)48.7 g/L。