基于Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析5種不同臭豆腐生坯細(xì)菌多樣性

鄧高文，蔣立文，2，劉 洋，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128）

臭豆腐是中國傳統(tǒng)的地方特色輕度發(fā)酵豆制品，歷史悠久，“聞起來臭，吃起來香”是臭豆腐的顯著特點(diǎn)。中國臭豆腐種類繁多，其中湖南長沙臭豆腐因其“黑如墨、香如醇、嫩如酥、軟如絨”的特點(diǎn)而深受廣大消費(fèi)者喜愛。各地臭豆腐從原料和制作工藝都有所不同，而制作長沙臭豆腐需先制作臭鹵水，再將制作好白豆腐浸泡進(jìn)行輕度發(fā)酵，以獲得含獨(dú)特“臭味”的臭豆腐坯，再在低溫冷鏈條件下運(yùn)輸?shù)郊庸らT面進(jìn)行油炸食用。臭鹵水是用豆豉、香菇、莧菜、竹筍和香辛料等植物為原料加水混合自然發(fā)酵數(shù)月至3年不等，使其具有特異的植物發(fā)酵液風(fēng)味[1-5]。微生物在臭豆腐特殊風(fēng)味的形成過程中起到至關(guān)重要的作用：臭豆腐鹵水中原料的蛋白質(zhì)被微生物分解為多肽及氨基酸，且釋放出吲哚、苯酚等特殊風(fēng)味的物質(zhì)，油炸后揮發(fā)，從而形成了臭豆腐的特殊風(fēng)味[6-8]。谷靜思等[9]通過對臭豆腐高通量測序分析，共發(fā)現(xiàn)212種細(xì)菌，其中66種屬于乳酸菌。賀靜等[10]通過454高通量技術(shù)對臭豆腐鹵水微生物多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同樣品優(yōu)勢菌種差異較大，說明鹵水來源不同對微生物的差異顯著。趙國忠等[11]通過傳統(tǒng)微生物鑒定和16SrRNA對臭豆腐鹵水微生物進(jìn)行分析，分離鑒定出漫游球菌（Vagococcus carniphilus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）、地衣芽孢桿菌（Enterococcus avium）、鳥腸球菌（Enterococcus devriesei）等細(xì)菌。譚金萍[12]則從鹵水中分離與臭豆腐鹵水風(fēng)味成分密切相關(guān)的微生物環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和解硫胺素解硫胺素桿菌（Bacillus aneurinolyticus）。

目前對于臭豆腐的微生物研究大多集中在臭豆腐鹵水，由于臭豆腐一般在企業(yè)生產(chǎn)半成品—臭豆腐生坯進(jìn)行真空包裝后再輸送到連鎖店進(jìn)行油炸食用和產(chǎn)品推廣，但因產(chǎn)品水分含量高，物流過程中冷鏈輸送特別是高溫季節(jié)稍有不慎就會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)氣漲包，影響產(chǎn)品質(zhì)量甚至安全[6]。本實(shí)驗(yàn)以5個(gè)不同廠家的臭豆腐生坯為研究對象，通過高通量測序技術(shù)分析臭豆腐生坯中細(xì)菌多樣性，并對其進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），探索出5種不同廠家臭豆腐生坯之間微生物多樣性特點(diǎn)，為預(yù)防和控制半成品脹氣提供重要參考，為產(chǎn)業(yè)鏈安全和質(zhì)量保證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

臭豆腐生坯（編號為YYD1、HSJD2、CGL3、PJX4、JXF5）：來自5個(gè)不同生產(chǎn)企業(yè)用于流通領(lǐng)域的低溫保存半成品（0～8 ℃）。

1.1.2 化學(xué)試劑

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酚酞溶液Phusion熱啟動(dòng)Flex 2X預(yù)混液：上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：日本Takara公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit：美國英杰生命技術(shù)有限公司；瓊脂糖G-10：法國Biowest公司；50×TAE 緩沖液：上海生工生物工程股份有限公司；AxyPre聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：美國愛思進(jìn)公司；RStool DNA試劑盒：美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50 KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD無菌操作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；S1000 PCR儀：美國BIO-RAD公司；MiSeq測序儀：美國Illumina公司；EPS 300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀：上海天能公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 臭豆腐生坯樣品基本指標(biāo)測定

水分含量：按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；菌落總數(shù)：按照GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測定》；大腸菌群：按照GB 4789.3—2016《大腸菌群計(jì)數(shù)》。

1.3.2 臭豆腐生坯樣品總DNA的提取

將臭豆腐生坯（YYD1、HSJD2、CGL3、PJX4、JXF5）與水按照質(zhì)量比1∶9攪拌均勻后各取50 g，然后用孔徑為0.22μm的水系微孔濾膜進(jìn)行抽濾[13]。將抽濾完成后的濾膜剪碎放入微型離心管中，按照R Stool DNA試劑盒說明書提取總DNA。

1.3.3 臭豆腐生坯16S rDNA高通量測序方法

以臭豆腐生坯總DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)域擴(kuò)增。引物：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）；806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

PCR擴(kuò)增體系：DNA模板50 ng、上下游引物各為2.5 μL、12.5 μL PCR預(yù)混合物、雙蒸水25 μL。

PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。

取PCR產(chǎn)物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將檢測合格樣品送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序[14-15]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

純化后的樣品由杭州聯(lián)川生物有限公司進(jìn)行上機(jī)測序。為了保證后續(xù)結(jié)果的可靠性，使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾去除長度＜100 bp的序列、含不確定堿基達(dá)5%以上的序列及嵌合體序列等低質(zhì)量序列。再以平均鄰近聚類算法通過Verseach（V2.3.4）將具有97%以上相似性的序列劃分為同一個(gè)操作分類單（operational taxonomic units，OTU），挑選代表性序列使用[16-17]。在核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）中進(jìn)行序列比對，明確序列的分類地位。通過Alpha和Beta多樣性分析研究單個(gè)樣本中物種的多樣性和多個(gè)樣本間菌群結(jié)構(gòu)的差異。對樣品進(jìn)行PCA，并基于16S rRNA基因擴(kuò)因子測序結(jié)果作圖。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0、SPSS 18.0和Excel 2019進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種臭豆腐生坯樣品基本指標(biāo)測定結(jié)果

由表1可知，不同廠家臭豆腐生坯的水分、菌落總數(shù)和大腸菌群存在一定差異，這可能是加工工藝不同所導(dǎo)致的。在5種臭豆腐生坯中，樣品PJX4水分含量、菌落總數(shù)、大腸菌群均最高，分別為84.73%、1.21×103CFU/g、29×10-2CFU/g；樣品HSJD2水分含量、菌落總數(shù)、大腸菌群均最低，分別為80.50%、1.05×103CFU/g、22×10-2CFU/g。可能是水分含量與菌落總數(shù)和大腸菌群呈正相關(guān)。

表1 5種臭豆腐生坯樣品基本指標(biāo)檢測結(jié)果Table 1 Determination results of basic indexes of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

2.2 5種臭豆腐生坯樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過IlluminaMiSeq測序后5個(gè)樣品共產(chǎn)生了1 676 294條有效數(shù)據(jù)（Valid Tags），本次測序有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

由表2可知，5種臭豆腐生坯樣品中共得到342 560個(gè)有效的序列數(shù)（Tags）。5種樣品中堿基質(zhì)量值（Q＞20%和Q＞30%）的數(shù)據(jù)均在90%以上，表明此次測序數(shù)據(jù)較好，可進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

表2 5種臭豆腐生坯樣品測序有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Sequencing valid data statistics of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

2.3 5種臭豆腐生坯樣品Alpha多樣性分析

Chao1指數(shù)曲線是反映樣品微生物豐富度的指標(biāo)，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣品中絕大多數(shù)細(xì)菌的物種信息[18-19]?；诟咄繙y序技術(shù)對臭豆腐生坯細(xì)菌的Chao1指數(shù)進(jìn)行分析，5種臭豆腐生坯樣品Chao1指數(shù)曲線見圖1。

圖1 5種臭豆腐生坯樣品Alpha多樣性分析結(jié)果Fig.1 Alpha diversity analysis results of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

從圖1可以看出，隨著序列數(shù)增加，樣品的Chao1指數(shù)均值＞150，說明5種樣品的物種多樣性和豐富度都較高。從樣品重復(fù)性稀釋曲線來看，在測序達(dá)到5 000以上基本趨于平緩，可以說明樣品基本可以代表樣品OTU實(shí)際情況，能夠反映樣品中微生物多樣性豐富程度，可以評價(jià)覆蓋所有微生物類群。

2.4 5種臭豆腐生坯樣品的主成分分析

采用PCA對五個(gè)樣品的多樣性進(jìn)行分析，評估其種群結(jié)構(gòu)的差異性和相似性。結(jié)果如圖2。由圖2可知，PC1和PC2貢獻(xiàn)率之和為87.21%。表明可以較好地反應(yīng)各樣品在圖上的種群結(jié)構(gòu)差異[20]。樣品HSJD2、PJX4和YYD1距離較近，但是JXF5和CGL3距離較遠(yuǎn)。說明HSJD2、PJX4和YYD1菌群結(jié)構(gòu)相似，而JXF5和CGL3與其他樣品的菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

圖2 5種臭豆腐生坯樣品主成分分析結(jié)果Fig.2 Principle component analysis results of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

2.5 5種臭豆腐生坯樣品中物種注釋及分類

由圖3可知，5種樣品在門分類水平上共注釋到30個(gè)門類。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）總和在5種不同樣品中均占80%以上占絕對優(yōu)勢，說明這5種不同的樣品在門分類水平上有極大的相似性。擬桿菌門（Bacteroidetes）是腸道有益微生物，對膳食多糖有一定的降解作用[21]。其中ε-變形菌門（Epsilonbacteraeota）在樣品CGL3相對豐度達(dá)4%，而在其他4個(gè)樣品中相對豐度較少。而變形菌門（Proteobacteria）在樣品YYD1、HSJD2和PJX4較多，分別為5%、3%和1%。在其他2種樣品中相對豐度較少。綜上，YYD1、HSJD2和PJX4樣品相似且與樣品CGL3和JXF5差異明顯，與PCA結(jié)果相同。

圖3 5種臭豆腐生坯樣品微生物群落門水平分類比較Fig.3 Comparison of microbial community at phylum level classification of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

由圖4可知，在屬分類水平上共注釋到31個(gè)屬類，普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）在5種豆腐生坯樣品中相對豐富均占絕對優(yōu)勢，特別是在JXF5中其相對豐度占70%以上。普雷沃氏菌屬有降解碳水化合物和蛋白質(zhì)的作用[22]。越來越多的研究表明，普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）是有益的腸道微生物群，可以降解消化膳食多糖[23-24]。其次是梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_13）和乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度較高。梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_13）在樣品CGL3的相對豐度超過15%，而乳桿菌屬（Lactobacillus）在樣品YYD1中相對豐度在20%以上。不同豆腐生坯微生物多樣性的差異可能是鹵水發(fā)酵過程中發(fā)酵不同的溫度、pH值以及周圍環(huán)境菌群所造成的影響。

圖4 5種臭豆腐生坯樣品微生物群落屬水平分類比較Fig.4 Comparison of microbial community at genus level classification of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

3 結(jié)論

本研究通過高通量測序測定5種不同廠家臭豆腐生坯，共注釋到30個(gè)門類和31個(gè)屬類。根據(jù)PCA發(fā)現(xiàn)，樣品CGL3和JXF5差異較大。樣品YYD1、HSJD2和PJX4較為相似。根據(jù)物種的門和屬分類發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）在5種樣品都占絕對優(yōu)勢，說明5種樣品具有一定的相似性。普雷沃氏菌屬和擬桿菌門在JXF5樣品中相對豐度均＞70%，兩者都為腸道有益微生物，對膳食多糖具有降解功能，有望通過促進(jìn)腸道健康，成為改善健康和預(yù)防疾病的功能性食品。綜上所述，5種臭豆腐生坯中有益腸道的擬桿菌門和普雷沃氏菌屬含量較高，而梭菌屬和乳桿菌屬含量又差異較大。普雷沃氏菌屬大部分屬于嚴(yán)格厭氧菌，大多數(shù)為革蘭氏陰性細(xì)菌，而梭菌屬和乳桿菌屬屬于革蘭氏陽性細(xì)菌，為產(chǎn)氣的嫌疑微生物，這有待于下一步采用純培養(yǎng)方法將其中占據(jù)優(yōu)勢微生物進(jìn)行分離純化，鑒定其產(chǎn)氣能力和水平，為進(jìn)一步采用有效控制措施奠定科學(xué)依據(jù)。