應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析來鳳地區(qū)腌制大頭菜葉中微生物多樣性

朱俊喆，鄧曉茜，胡曉淞，李云捷，趙慧君*

（湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053）

大頭菜（Brassica iuncea）原產(chǎn)于我國，隸屬于蕓苔屬一年生草本植物，栽培面積約100萬hm2，具有極其豐富的莖用、葉用和根用等價值[1]。腌制大頭菜葉以根用大頭菜的綠葉為主要原料，并輔以食鹽、姜末和大蒜等發(fā)酵制成，經(jīng)過清洗切斷、曬干脫水、輔料混合和厭氧發(fā)酵等過程[2-3]。在腌制過程中，芥菜葉中的硫代葡萄糖苷和氨基酸等，在酸和酶的作用下生成芥子油等揮發(fā)性風味物質(zhì)，賦予成品獨特的香味[4]。研究報道顯示，大頭菜葉腌制一般為自然發(fā)酵，葉片表面附著的微生物起主要作用，包括乳酸球菌、乳酸桿菌、酵母菌和腸膜明串珠菌等有益微生物[5]。目前，對于大頭菜葉腌制的研究主要集中在發(fā)酵工藝優(yōu)化[6]、減少食鹽用量[7-8]和揮發(fā)性風味物質(zhì)的研究[9]以及提取物抗氧化上等[10-13]，而對于腌制大頭菜葉中微生物多樣性的研究卻相對較少。

隨著測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，以其快速高效等特點，成為微生物群落多樣性解析的主要工具[14]，目前廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中微生物多樣性解析[15-18]。周森等[19]利用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對來自5個地區(qū)的11份清香型大曲中微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)清香型大曲中細菌微生物多樣性豐富，真菌則以扣囊覆膜酵母為優(yōu)勢真菌；瑪依樂·艾海提等[20]利用高通量測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)南疆傳統(tǒng)酸奶中厚壁菌門（Firmicutes）和子囊菌門（Ascomycota）分別為優(yōu)勢細菌門和真菌門。蔡懷依等[21]利用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對新鮮年糕內(nèi)細菌多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)年糕內(nèi)生細菌優(yōu)勢菌屬為玫瑰色半光合菌屬（Roseateles）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）。

本研究以湖北省來鳳縣腌制大頭菜葉樣品為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，以細菌16S rRNA和真菌18S rRNA為靶點，對腌制大頭菜葉中細菌和真菌微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行了解析。本研究通過對腌制大頭菜中微生物的研究，以期為后續(xù)腌制大頭菜葉品質(zhì)提升、純種發(fā)酵及安全評價提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LB培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit 脫氧核糖核苷酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）混合液、FastPfu Fly DNA聚合酶、5×TransStartTMFastPfu Buffer：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Thermo公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈式反應(yīng)polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機架式服務(wù)器：美國Dell公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

從恩施土家族苗族自治州來鳳縣北門菜市場和金鳳市場采集腌制大頭菜葉樣品3份，分別標記為LF1、LF2、LF3，置于含有冰袋的采樣箱中運回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品微生物宏基因組DNA的提取

稱取2.0 g腌制大頭菜葉樣品，按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒說明書步驟對樣品DNA進行提取。

1.3.3 細菌16S rRNA的PCR擴增

使用加入成對核苷酸標簽（barcode）的引物，參照文獻[22]中的PCR擴增體系和條件對細菌16S rRNA V3-V4區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增體系：5×PCR緩沖液4 μL，dNTPs混合液（2.5 mmol/L）2 μL，正反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL，DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，DNA模板10 ng，補充雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30 次；72 ℃再延伸10 min。

1.3.4 真菌18S rRNA序列擴增

加入成對核苷酸標簽（barcode）的引物，對真菌18SrRNA V3-V4區(qū)進行PCR擴增，PCR擴增體系及條件同1.3.3。

1.3.5 高通量測序及生物信息學(xué)分析

將經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測成功的PCR產(chǎn)物，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序，使用Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺進行測序。將返回序列拼接后進行質(zhì)控[23]，對齊和去除引物。參照沈馨等[24]的分析流程，使用QIIME（V1.70）平臺對質(zhì)控后合格的序列進行物種分析和多樣性評價。1）使用PyNAST軟件對序列進行對齊；2）按照97%和100%相似度對序列進行兩步UCLUST法構(gòu)建操作分類單元（operationaltaxonomicunits，OTU）矩陣；3）使用ChimeraSlayer軟件將含有嵌合體的OTU進行篩選與去除；4）挑選OTU代表性序列，使用RDP、SILVA和GREE-NGENE 3 個數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，明確不同水平的分類學(xué)地位；5）計算Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)，進而對微生物群落的多樣性和豐度進行評價。

1.3.6 多元統(tǒng)計學(xué)分析

使用柱狀圖表示樣品中優(yōu)勢細菌門和真菌門構(gòu)成及相對含量；使用熱圖對優(yōu)勢細菌屬和真菌屬間相關(guān)性進行可視化處理；使用R軟件（V3.6.2）對文中的圖進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐度和多樣性分析

對納入本研究的3 份腌制大頭菜葉樣品的16S rRNA和18S rRNA高通量測序結(jié)果的不同分類學(xué)地位進行數(shù)量統(tǒng)計，結(jié)果如表1所示。

表1 腌制大頭菜葉樣品測序結(jié)果及不同分類學(xué)地位數(shù)量統(tǒng)計Table 1 Sequencing results and quantitative statistics in different taxonomic status of pickled kohlrabi leaves samples

由表1可知，3 個樣品共產(chǎn)生102 905 條高質(zhì)量16S rRNA序列，平均每個樣品產(chǎn)生34 301 條；共產(chǎn)生131 955 條高質(zhì)量18S rRNA序列，平均每個樣品產(chǎn)生43 985 條。按照97%和100%的相似度對序列進行劃分后分別得到8 217個細菌OTU和2 340 個真菌OTU。

當細菌測序量達到24 010 時，樣品BLF1的超1指數(shù)最高為1 754，樣品BLF3的香農(nóng)指數(shù)最高為8.25；當真菌測序量達到40 010 時，樣品FLF2的超1指數(shù)最高為3 559，樣品FLF3的香農(nóng)指數(shù)最高為4.38。由此可見，3 號樣品細菌和真菌菌落較其他2個樣品具有較高的物種多樣性。值得一提的是，細菌菌落香農(nóng)指數(shù)均高于真菌，而超1指數(shù)均低于真菌，說明腌制大頭菜葉中細菌群落多樣性較高且分布均勻，而真菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性和分布均勻性均不如細菌，可能與密封發(fā)酵中的厭氧環(huán)境對真菌生長抑制以及腌制大頭菜制作環(huán)境的差異有關(guān)[25]。

2.2 基于不同分類地位的微生物菌群種類及平均相對含量分析

腌制大頭菜葉樣品中細菌和真菌優(yōu)勢門（相對含量＞1%）種類及平均相對含量如圖1所示。

圖1 腌制大頭菜葉細菌（A）和真菌（B）優(yōu)勢門平均相對含量分析Fig.1 Average relative contents of bacteria (A) and fungi (B) dominant phylum of pickled kohlrabi leaves

3個腌制大頭菜葉樣品在門的分類水平上，注釋到明確分類地位的分別有20個細菌門和3個真菌門，其中平均相對含量＞1%的細菌門有4個，分別為硬壁菌門（Firmicutes，52.28%）、變形菌門（Proteobacteria，38.40%）、放線菌門（Actinobacteria，4.30%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，2.83%）；平均相對含量＞1%的真菌門有2個，分別為子囊菌門（Ascomycota，88.19%）和擔子菌門（Basidiomycota，11.15%）。

本研究進一步對腌制大頭菜葉樣品中細菌和真菌優(yōu)勢屬（相對含量＞1%）的種類及平均相對含量進行了統(tǒng)計，結(jié)果如圖2所示。

圖2 腌制大頭菜葉細菌（A）和真菌（B）優(yōu)勢屬平均相對含量分析Fig.2 Average relative contents analysis of bacteria (A) and fungi (B)dominant genera of pickled kohlrabi leaves

在屬的分類水平上，注釋到明確分類地位的細菌屬和真菌屬分別有382個和31個。

由圖2（A）可知，腌制大頭菜葉樣品中優(yōu)勢細菌屬有12個，分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus，22.45%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，10.97%）、櫻桃樣芽胞桿菌屬（Cerasibacillus，10.58%）、腸桿菌屬（Enterobacter，8.29%）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus，6.44%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，6.06%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，2.50%）、魏斯氏菌屬（Weissella，2.08%）、歐文氏菌屬（Erwinia，1.65%）、氣單胞菌屬（Aeromonas，1.42%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，1.09%）和乳球菌屬（Lactococcus，1.02%）。由圖2（B）可知，腌制大頭菜葉樣品中優(yōu)勢真菌屬有8 個，分別為接合酵母屬（Zygosaccharomyces，55.29%）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces，9.33%）、隱球菌屬（Cryptococcus，7.97%）、假絲酵母屬（Candida，6.83%）、枝孢屬（Cladosporium，6.70%）、曲霉菌屬（Aspergillus，4.23%）、畢赤酵母屬（Pichia，1.57%）和節(jié)菌屬（Wallemia，1.07%）。由圖2亦可知，細菌屬和真菌屬分別有5.04%和5.40%的屬不能注釋到明確的分類地位。

值得一提的是，接合酵母屬（Zygosaccharomyces）在樣品FLF1中含量高達91.95%，與其他樣品存在較明顯差異，且隱球菌屬（Cryptococcus）在樣品FLF3中相對含量為22.06%，而在FLF1和FLF2中僅含有0.24%和1.62%，進一步證明，不同大頭菜樣品中真菌菌群分布不均勻。

2.3 OTU統(tǒng)計分析

據(jù)統(tǒng)計，樣品中細菌和真菌OTU總數(shù)分別為7 510個和1 959個，而3個樣品共有的OTU分別為143個和88個。本研究進一步統(tǒng)計了樣品中平均相對含量大于1%的核心OTU構(gòu)成及平均相對含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 腌制大頭菜葉細菌（A）和真菌（B）核心OTU平均相對含量分析Fig.3 Average relative content analysis of bacteria (A) and fungi (B)core OTU of pickled kohlrabi leaves

由圖3（A）可知，3個樣品中核心細菌OTU有17個，其中有5個隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus），4個隸屬于腸桿菌屬（Enterobacter）、4個隸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）、1個隸屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、1個隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、1個隸屬于魏斯氏菌屬（Weissella）。由圖3（B）可知，3個樣品中核心真菌OTU有11個，其中有3個隸屬于枝孢屬（Cladosporium）、3 個隸屬于接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、2個隸屬于曲霉菌屬（Aspergillus）、1個隸屬于德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、1個隸屬于隱球菌屬（Cryptococcus）和一個僅鑒定到綱的銀耳綱（Tremellomycetes）。

此外，細菌OTU867（隸屬于腸桿菌屬）在樣品BLF2含量達到21.32%，在樣品BLF1和BLF3中含量僅為0.03%和1.30%；真菌OTU1675（隸屬于德巴利氏酵母屬）在樣品FLF1和FLF2中含量高達92.57%和48.12%，而在樣品FLF3中僅含2.80%。由此可見，雖然細菌和真菌的核心OTU在所有樣品中均存在，但是在每個樣品中的含量卻存在明顯的差異[26]，進一步證明自然發(fā)酵蔬菜中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性受制作環(huán)境的影響，進而影響發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)。

2.4 核心細菌屬和真菌屬相關(guān)性分析

本研究共發(fā)現(xiàn)12個核心細菌屬和8個核心真菌屬，其相關(guān)性熱圖如圖4所示。

圖4 腌制大頭菜葉細菌和真菌優(yōu)勢屬相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of bacteria and fungi dominant genera of pickled rutabaga leaves

由圖4可知，曲霉菌屬（Aspergillus）與假單胞菌屬（Pseudomonas）和枝孢屬（Cladosporium）與魏斯氏菌屬（Weissella）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而其他優(yōu)勢細菌屬和真菌屬之間相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。由此可見，腌制大頭菜葉中部分真菌和細菌之間存在著明顯的共生關(guān)系，這種共生關(guān)系對發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)有什么樣的影響還需要進一步的研究。

3 結(jié)論

本研究利用Illumina MiSeq第二代測序技術(shù)對3 個腌制大頭菜葉樣品進行微生物多樣性研究后發(fā)現(xiàn)，共鑒定出20 個細菌門，優(yōu)勢細菌門有4個，分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）；鑒定出3個真菌門，優(yōu)勢真菌門僅有2 個，分別為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）。優(yōu)勢細菌屬分別為隸屬于硬壁菌門的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、櫻桃樣芽孢桿菌屬（Cerasibacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳球菌屬（Lactococcus）；隸屬于變形菌門的假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、歐文氏菌屬（Erwinia）、氣單胞菌屬（Aeromonas）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）。優(yōu)勢真菌屬分別為隸屬于子囊菌門的接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、假絲酵母屬（Candida）、枝孢屬（Cladosporium）、曲霉菌屬（Aspergillus）和畢赤酵母屬（Pichia）；隸屬于擔子菌門的隱球菌屬（Cryptococcus）和節(jié)菌屬（Wallemia）。結(jié)果表明，由于是自然發(fā)酵，制作環(huán)境的不同造成腌制大頭菜葉樣品中間微生物多樣性差異較高，密閉發(fā)酵的方式造成樣品中細菌群落物種種類和分布的均勻性高于真菌。