賒店老酒大曲中可培養(yǎng)真菌的分離和鑒定

劉延波，張 達(dá)，盧倩倩，韓素娜，王 賢，孫西玉，6，潘春梅*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南 鄭州 450046；2.河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后科研工作站，河南 澠池 472400；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；5.賒店老酒股份有限公司，河南 社旗 473300；6.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵 476733）

白酒是我國(guó)的傳統(tǒng)酒種，以糧谷為主要原料，發(fā)酵而成的蒸餾酒，歷史悠久，在漫長(zhǎng)的發(fā)展過(guò)程中形成了獨(dú)特的工藝和種類豐富的風(fēng)味[1]。白酒釀造過(guò)程中所產(chǎn)生的獨(dú)特風(fēng)味是多種微生物共同作用的結(jié)果，而大曲是發(fā)酵過(guò)程中微生物的主要來(lái)源之一[2]。大曲不僅作為原料，也起到網(wǎng)羅環(huán)境中微生物的作用，是白酒的釀造動(dòng)力源，有利于釀造過(guò)程中生成酶和風(fēng)味物質(zhì)成分[3]。同時(shí)大曲中含有豐富的兼性可培養(yǎng)微生物，為白酒釀造提供了大量產(chǎn)香微生物，對(duì)白酒中酯類、醛類、醇類等有機(jī)物的形成有著直接作用[4]，并且對(duì)白酒的風(fēng)味形成也至關(guān)重要[5]。

大曲中的微生物主要有細(xì)菌和真菌，真菌對(duì)于大曲的質(zhì)量以及白酒風(fēng)味的形成具有重要的作用。酵母菌是大曲主要功能微生物菌群之一，在大曲酒的發(fā)酵過(guò)程中起主導(dǎo)作用[6]。酵母不僅能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乙醇，而且能代謝產(chǎn)生豐富的風(fēng)味成分，如生香釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和假絲酵母（Candida）等；而畢赤酵母（Pichia pastoris）在不同發(fā)酵條件下，可以產(chǎn)生醇、酯、酸等多種風(fēng)味物質(zhì)，從而影響白酒的產(chǎn)品味感和風(fēng)味特征[7-8]。白酒發(fā)酵過(guò)程中酵母菌具有多樣性，不同種類酵母菌的耐熱性、耐酒精性、耐酸性和發(fā)酵力也都不同[9]。

大曲中的霉菌不僅是形成曲表穿衣、保證曲體排水順暢從而避免大曲酸敗的主要菌類[10]，而且賦予大曲糖化、液化、蛋白分解等各種水解能力及酯化能力，對(duì)白酒的風(fēng)格形成起到了重要作用[11]。在發(fā)酵伊始，霉菌所產(chǎn)生的酶在發(fā)酵過(guò)程中有糖化的作用，將淀粉質(zhì)原料在一定條件下全部或部分轉(zhuǎn)化為葡萄糖等可發(fā)酵性糖，以供酵母菌和細(xì)菌利用[12]，其次大曲中的霉菌可產(chǎn)生豐富的淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、酯化酶、果膠酶等酶系，不同的霉菌所產(chǎn)生的酶不同，這些酶系在釀酒的過(guò)程中產(chǎn)生積極的作用[13]。

由于微生物的各種生理代謝功能只能在可培養(yǎng)的條件下研究，純種培養(yǎng)技術(shù)可以得到微生物菌株，再對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)和遺傳特性進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，有利于豐富微生物的物種多樣性[14]。目前采用可培養(yǎng)技術(shù)對(duì)中原濃香型白酒大曲微生物物種多樣性的研究較少，本研究通過(guò)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)從賒店老酒大曲中得到純種真菌菌株，對(duì)獲得的純種菌株進(jìn)行菌種鑒定，最后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)大曲中酵母菌和霉菌進(jìn)行整體分析，以便于準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)賒店老酒大曲可培養(yǎng)真菌多樣性，豐富了中原地區(qū)濃香型白酒的真菌菌種資源庫(kù)，為真菌資源的有效開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大曲：河南賒店老酒股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

蔗糖、葡萄糖、無(wú)水乙醇、硫酸鎂、瓊脂：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉：西隴化工股份有限公司；磷酸二氫鉀、50%甘油、硝酸鈉、磷酸氫二鉀：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；硫酸亞鐵：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉：英國(guó)Oxoid公司；酵母膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯霉素、鏈霉素：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；1.0%瓊脂糖：廈門太陽(yáng)馬生物工程有限公司；0.5×三羥甲基氨基甲烷硼酸電泳緩沖液（Tris-borate electrophoresis buffer，TBE）：廣州賽國(guó)生物科技有限公司；溶壁酶（酶活200 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；SanTaqPCRMix預(yù)混液：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA Marker：天根生化科技（北京）有限公司；引物：上海英駿生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

豆芽汁富集培養(yǎng)基：黃豆芽10 g，水100 mL，煮沸30 min，過(guò)濾后補(bǔ)足失水，加水400 mL，葡萄糖25 g，121 ℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，115 ℃滅菌20 min。

PDA液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g/L，切成小塊，加水1 000 mL加熱攪拌30 min，過(guò)濾除去固形物并補(bǔ)足失水，加入葡萄糖20 g，加熱充分溶解，121 ℃滅菌20 min。

高鹽查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，氯化鈉60 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，瓊脂20 g/L，氯霉素0.1 g，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ZQLY-300S恒溫培養(yǎng)搖床：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；MQD-B3R振蕩培養(yǎng)箱、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LQ-C3002電子天平：上?，幮码娮涌萍加邢薰?；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；3-18KS高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；DYY-2C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Labcycler梯度聚合酶聯(lián)式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)SensoQuest公司；WD-9403F紫外分光光度儀、CX31型生物顯微鏡：奧林巴斯（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌菌株的分離純化

從賒店老酒優(yōu)質(zhì)大曲的曲心和曲皮按照1∶1的比例，分別取樣5 g。并混合研磨成粉[16]。取混合均勻的曲粉10 g（無(wú)菌條件下）于90 mL無(wú)菌水中150 r/min、28 ℃振蕩30 min。待混合液靜置后，取5 mL上清液與100 mL豆芽汁富集培養(yǎng)基混合均勻，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。分別取10-2～10-6梯度稀釋液100 μL于YEPD培養(yǎng)基及PDA培養(yǎng)基（含2%鏈霉素）涂布，每個(gè)梯度三個(gè)平行，其中YEPD平板培養(yǎng)基于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，PDA培養(yǎng)基于28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種到PDA培養(yǎng)基固體平板中，反復(fù)劃線純化獲得純菌株。觀察稀釋涂布平板分離得到的單菌落，根據(jù)菌落特征及鏡檢結(jié)果，挑選相應(yīng)的單菌落反復(fù)接種3～4次直至獲得純種菌落。對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的特殊菌落做好特征記錄。將純化后的菌落制成種子液，與50%滅菌甘油按1∶1（V/V）注入凍存管混勻，保存在-20 ℃冰箱。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

用PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基篩選霉菌，用YEPD培養(yǎng)基篩選酵母，對(duì)分離得到的酵母菌和霉菌觀察并記錄菌落形狀、顏色、透明度、邊緣、質(zhì)地、濕潤(rùn)程度等菌落特征，以及霉菌菌株的分生孢子梗著生情況、孢子形態(tài)與顏色等特征，并對(duì)所有菌株初步分類，結(jié)合鏡檢結(jié)果將形態(tài)和培養(yǎng)特征高度一致的歸為一類，對(duì)特殊形態(tài)的菌株特別標(biāo)記。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

將所獲得的真菌接種于PDA液體培養(yǎng)基，28℃、120r/min條件下振蕩培養(yǎng)約18 h，取1 mL菌液于已滅菌的離心管中離心，得到菌體沉淀后，按照Ezup柱式酵母基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取真菌基因組DNA，并于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察目的基因條帶，所獲基因組DNA保存在-20 ℃冰箱中備用。

以提取的基因組DNA為模板對(duì)分離酵母菌株的26S rDNA（D1/D2）區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中SanTaqPCRMix預(yù)混液25 μL、通用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）各2μL、DNA模板2μL、雙蒸水（ddH2O）19 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。

以提取的基因組DNA為模板對(duì)分離霉菌菌株的18S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中SanTaqPCR Mix預(yù)混液25 μL、通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）各2 μL，DNA模板2 μL、雙蒸水（ddH2O）19 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性6 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸120 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。

取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特異性，電泳條件：電壓110 V，時(shí)間30 min，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序所得的特定真菌菌株序列結(jié)果，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上通過(guò)局部序列排比檢索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進(jìn)行同源序列比較與分析，初步確定受試菌株的分類地位，用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的分離純化和菌落形態(tài)觀察

從賒店老酒優(yōu)質(zhì)大曲中分離純化得103株霉菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征的不同將霉菌分為35類，編號(hào)為L(zhǎng)QMJ1～LQMJ35，部分菌株菌落的形態(tài)及鏡檢結(jié)果見圖1，霉菌菌落特征描述結(jié)果見表1。分離純化得到45株酵母菌，編號(hào)為SDJM1～SDJM45，部分酵母代表菌株的菌落特征及鏡檢圖結(jié)果見圖2、菌落形態(tài)具體描述結(jié)果見表2。

表1 賒店老酒大曲可培養(yǎng)霉菌的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of culturable molds in Shedianlaojiu Daqu

表2 分離酵母菌的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of isolated yeasts

圖1 部分霉菌菌落及孢子形態(tài)Fig.1 Colonies and spore morphology of some molds

圖2 部分酵母菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Colonies and cell morphology of some yeasts

2.2 真菌分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 酵母菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)酵母DNA提取試劑盒獲得酵母DNA，用引物NL1/NL4對(duì)酵母26S rDNA序列擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠結(jié)果見圖3，都得到600 bp大小片段，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致。

圖3 部分酵母基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of some yeasts gene fragments

2.2.2 霉菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用酵母試劑盒提取霉菌DNA，用引物ITS1和ITS4對(duì)霉菌進(jìn)行18S rDNA序列擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠結(jié)果見圖4，都得到550 bp大小片段，均與預(yù)期產(chǎn)物大小一致。

圖4 部分霉菌基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR amplification products of some molds gene fragments

2.3 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

根據(jù)所得26S rDNA基因序列和18S rDNA基因序列，在NCBI上通過(guò)BLAST程序進(jìn)行同源序列比較與分析，構(gòu)建酵母菌及霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果分別如圖5和圖6所示，結(jié)合45株酵母的菌落形態(tài)觀察結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果，確認(rèn)從賒店老酒大曲中分離得到6株酵母菌，分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、異常威克漢姆酵母（Wicker hamomyces anomalus）、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）及光滑假絲酵母（Candida glabrata）。35株霉菌經(jīng)18S rDNA鑒定得到4個(gè)霉菌菌屬，分別為根霉屬（Rhizopus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、曲霉屬（Aspergillus）和毛霉屬（Mucor）。

圖5 基于26S rDNA序列45株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 45 yeasts based on 26S rDNA sequences

圖6 基于18S rDNA序列35株霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 35 molds based on 18S rDNA sequences

2.4 真菌的種群數(shù)量分析

6種酵母所占總量比例見圖7a。由圖7a可知，45株酵母中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）占71%、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）占2%、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）占9%、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）占5%、光滑假絲酵母（Candida glabrata）占11%、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）占2%。4種霉菌屬所占總量比例見圖7b。由圖7b可知，篩選的霉菌經(jīng)DNA分子鑒定最終確認(rèn)根霉屬（Rhizopus）和橫梗霉屬（Lichtheimia）數(shù)量較多，其中根霉屬（Rhizopus）占37%、橫梗霉屬（Lichtheimia）占33%、曲霉屬（Aspergillus）占18%、毛霉屬（Mucor）占12%。

圖7 6種酵母（a）及4種霉菌屬（b）所占總量比例Fig.7 Proportion of 6 kinds of yeasts(a)and 4 kinds of molds(b)in total

3 討論

白酒釀造處于一個(gè)開放的環(huán)境，相對(duì)于其他酒種具有一定的區(qū)域性，不同地區(qū)的微生物資源不同，釀造出的白酒風(fēng)格也不同。張杰等[17]在宋河酒廠高溫大曲中分離鑒定出假絲酵母（Candida）、三角酵母（Trigonopsis）、紅冬孢酵母（Rhodos poridium）等3個(gè)酵母屬。羅惠波等[18]從瀘州老窖濃香大曲中分離得出釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、德巴利氏酵母（Debaryomyces）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和鎖擲酵母（Sporidiololus pararoseus）4個(gè)酵母屬。劉宏媛等[19]以瀘州老窖大曲為樣本，使用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法得到2株酵母菌，經(jīng)過(guò)菌落特征觀察和顯微鏡觀察后，利用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對(duì)2株酵母進(jìn)行鑒定，確認(rèn)它們分別為佛羅倫薩結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces florentine）和伯頓絲孢畢赤酵母（Pichia burtoni）。徐占成等[20]以劍南春大曲為研究對(duì)象，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳研究得出劍南春大曲中酵母主要分布在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、漢遜酵母（Hansenula）、假絲酵母（Candida）和畢赤酵母（Pichia）5個(gè)屬。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的6個(gè)酵母菌屬與其他濃香型白酒相比處于較高水平，由此可以看出，不同地區(qū)白酒大曲酵母菌的種類有很大區(qū)別，正因?yàn)檫@些不同，構(gòu)成了各個(gè)白酒品牌的風(fēng)味特色。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是大曲中分布最為廣泛的酵母菌屬，能夠?qū)⒃沲械牡矸郯l(fā)酵為酒精，在白酒發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。企業(yè)從釀酒生產(chǎn)中分離篩選出功能突出的產(chǎn)酒酵母強(qiáng)化發(fā)酵，能夠節(jié)約糧食、提高出酒率、降低成本[21]。除了生產(chǎn)酒精外，酵母菌的代謝作用還能夠賦予白酒層次復(fù)雜的香味[22-23]。產(chǎn)酯酵母（產(chǎn)香酵母）的種類和數(shù)量對(duì)白酒的質(zhì)量有著極大的影響，產(chǎn)酯酵母也成為了近年來(lái)白酒功能菌的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)香酵母種類豐富，如畢赤酵母（Pichia）、光滑假絲酵母（Candida glabrata）、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）等，為白酒提供了復(fù)雜有層次的香味。異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）能夠產(chǎn)生豐富的香味物質(zhì)，有吡嗪類物質(zhì)、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚等[24]?？勰覐?fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）能夠使醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)含量提高，如使乙酸乙酯、乙酸異戊酯及其他產(chǎn)物呈現(xiàn)清靈果香[25]。

從賒店老酒大曲中分離篩選的霉菌屬也在白酒的釀造過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。如根霉（Rhizopus）能產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，能將淀粉近乎理論值地轉(zhuǎn)化為葡萄糖[26]，在釀酒過(guò)程中用做糖化菌，在發(fā)酵過(guò)程中也能產(chǎn)生乙酸乙酯、丙酸乙酯、正丙醇等芳香性成分，從而影響酒的品質(zhì)。曲霉（Aspergillus）是大曲中產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的一類微生物，自身能夠分泌葡萄糖氧化酶、糖化酶和蛋白酶，對(duì)于白酒的口感和質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用[27]。毛霉（Mucor）具有極其豐富的酶系，針對(duì)蛋白酶而言，就能產(chǎn)出酸性蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶，可以合成端肽酶、分泌內(nèi)肽酶，是一種天然的復(fù)合酶系[28]。另外，毛霉在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生分解蛋白質(zhì)的酶系能代謝積累乙酸和甘油等，對(duì)大曲的品質(zhì)有一定的積極影響，這對(duì)曲酒的發(fā)酵進(jìn)程具有非常重要的作用。

4 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法，研究了賒店老酒優(yōu)質(zhì)大曲中真菌的物種多樣性，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法共得到45株酵母菌、103株霉菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，大曲中共鑒定出6株酵母菌和4個(gè)霉菌屬。6株酵母菌分別為：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）占71%、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）占2%、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）占5%、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）占9%、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）占2%、光滑假絲酵母（Candida glabrata）占11%。4個(gè)霉菌屬分別為：根霉屬（Rhizopus）占37%、橫梗霉屬（Lichtheimia）占33%、曲霉屬（Aspergillus）占18%、毛霉屬（Mucor）占12%。研究結(jié)果表明，賒店老酒優(yōu)質(zhì)大曲中含有豐富的真菌資源，為中原濃香型白酒的釀造微生物研究奠定了基礎(chǔ)。