益生菌發(fā)酵對蘋果汁主要營養(yǎng)成分及揮發(fā)性物質(zhì)的影響

周勸娥，杜小強*，王 玉

（平?jīng)鍪惺称窓z驗檢測中心，甘肅 平?jīng)?744000）

益生菌是一類活菌數(shù)達到一定數(shù)量、具有抑制致病菌生長能力的對人體有益的微生物[1]。蘋果汁含有多種營養(yǎng)成分，包括糖類、有機酸、多酚、維生素等[2]，是良好的益生菌發(fā)酵基質(zhì)[3]。

目前，國內(nèi)外學者對益生菌發(fā)酵果蔬汁進行了許多研究。在揮發(fā)性風味物質(zhì)方面，羅心欣等[4]用電子鼻分析益生菌發(fā)酵獼猴桃汁的香氣成分，研究了獼猴桃在益生菌發(fā)酵過程中香氣成分的動態(tài)變化規(guī)律；錢籽霖[5]用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀，從益生菌發(fā)酵拐棗子中檢出77種揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其相對含量明顯高于未發(fā)酵的拐棗子；DI CAGNO R等[6]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌發(fā)酵石榴汁中醇類、酮類、烯烴類等揮發(fā)性物質(zhì)含量較發(fā)酵前都有明顯增加，而對風味不友好的醛類在發(fā)酵后減少；李汴生等[7]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了蘋果汁、梨汁、橙汁和葡萄汁發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的變化，發(fā)現(xiàn)不同種類果汁之間揮發(fā)性物質(zhì)的變化存在較大差異；任婷婷等[8]對益生菌發(fā)酵蘋果漿發(fā)酵前后揮發(fā)性風味成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后蘋果漿中的酯類、醇類和酮類揮發(fā)性成分含量增加，醛類揮發(fā)性成分含量降低。在營養(yǎng)成分方面，CIRLINI M等[9]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵接果木果汁過程中蘋果酸和檸檬酸含量降低；束文秀等[10]研究發(fā)現(xiàn)胡柚汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，其乳酸含量遠高于蘋果酸完全轉(zhuǎn)化所能達到的水平；李維妮等[11]用益生菌發(fā)酵蘋果汁，發(fā)現(xiàn)蘋果酸下降明顯，酒石酸及檸檬酸顯著提高；某些研究表明益生菌發(fā)酵可促進結合酚的游離從而提高發(fā)酵果汁中多酚的含量[12-15]；HASHEMI S M B等[16]用植物乳桿菌發(fā)酵甜檸檬汁時發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長多酚含量降低；OH B T等[17]用短乳桿菌發(fā)酵藍莓汁48 h后總酚含量也降低了。

益生菌發(fā)酵果蔬汁可改變果蔬汁的揮發(fā)性風味物質(zhì)的組成及含量，同時益生菌在果蔬汁的發(fā)酵過程中，糖類和有機酸作為碳源被利用[9，18-19]，酚類物質(zhì)含量也在益生菌的作用下發(fā)生變化[20-23]，但不同種類的果蔬汁在不同種類不同組合的益生菌發(fā)酵過程中，其揮發(fā)性風味物質(zhì)、糖、有機酸及酚類物質(zhì)的變化趨勢存在較大差異。

本實驗以靜寧紅富士蘋果為主要原料，通過分析復合益生菌對蘋果汁發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)、糖類、有機酸及酚類物質(zhì)的影響，為益生菌發(fā)酵蘋果汁風味的改良及營養(yǎng)品質(zhì)的提升提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果（靜寧紅富士）：2020年10月上旬采摘于靜寧當?shù)毓麍@，大小均一，無損傷、無爛果。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）GDMCCI1.140、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）GDMCCI1.985、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GDMCCI1.412：購于廣州微生物菌種保藏中心，保存于平?jīng)鍪称窓z驗檢測中心微生物實驗室。

蘋果酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、奎寧酸、莽草酸、琥珀酸、丙酮酸、3-辛醇、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、槲皮素、根皮苷、蘆丁標準品（純度均＞98%）：壇墨質(zhì)檢-標準物質(zhì)中心。

甲醇、乙腈、乙酸（均為色譜純）：德國MERCK公司；試驗用水為一級超純水；磷酸、磷酸氫二銨（均為色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；2000JP-1型果汁榨汁機：南通金橙機械有限公司；MVS-83型立式高壓蒸汽滅菌器：松下冷鏈（大連）有限公司；DRP-9162型恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；A2S-T-1024-BE型超純水機：美國艾科浦國際有限公司；手動固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）進樣器：美國Supelco公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、賽默飛Trace1310-TSO8000Evo氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）儀：賽默飛世爾科技有限公司；LC20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合益生菌發(fā)酵蘋果汁的制備

將植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌以1∶1∶1的菌種比例混合，以3%的接種量接種至300 mL蘋果汁中，36 ℃條件下發(fā)酵24 h。每隔一定時間取樣測定發(fā)酵蘋果汁中的有機酸、酚類物質(zhì)組成及含量，并對發(fā)酵前后蘋果汁的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行測定。

1.3.2 發(fā)酵蘋果汁有機酸含量的測定

參照李佳秀等[24]的方法，取1 mL發(fā)酵蘋果汁，定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后采用高效液相色譜儀進行分析。色譜條件：InertSustain AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.02 mol/L的磷酸氫二銨，用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.40；等度洗脫；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.3 酚類物質(zhì)的測定

總酚的測定采用福林酚比色法[25]，取1 mL蘋果汁樣品，加入2.5 mL福林酚試劑，50 ℃水浴避光反應5 min，冷卻，加入2 mL 75 g/L碳酸鈉溶液，搖勻，避光反應30 min。于波長760 nm處測定吸光度值。構建沒食子酸標準曲線，含量以沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）表示。

6種酚類物質(zhì)的測定參照仵白敏[26]的方法，取20 mL蘋果汁樣品，用60 mL乙酸乙酯分次萃取，合并有機相，37 ℃減壓濃縮至干，用甲醇定容至2 mL，過0.22 μm濾膜上機測試。色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（B）、0.02%甲酸（A），梯度洗脫程序見表1；流速1.0mL/min；檢測波長190～800nm；柱溫35℃；進樣量10μL。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure

1.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

（1）香氣成分的富集

參照李維妮等[27]的方法，吸取5 mL蘋果汁樣品于20 mL頂空瓶中，加入1.5 g氯化鈉和一定量的內(nèi)標物，于45 ℃平衡30 min，將老化過的萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min，取出萃取頭插入GC-MS/MS進樣口，250 ℃解吸5 min。

（2）GC-MS條件

色譜柱：DB-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.5 μm）；手動進樣，進樣口溫度250℃，載氣為氦氣（He），流速1mL/min，不分流進樣。升溫程序：起始溫度40℃，保持3min，以3℃/min速率升溫至160 ℃，再以6 ℃/min升溫至220 ℃。

電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～500 m/z。

（3）定性定量方法

利用GC-MS分析軟件和美國國家標準與技術研究所（national insititute of standard and technology，NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索對比，根據(jù)匹配度和保留時間定性，按照以下公式計算各香氣物質(zhì)的含量：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3次，采用Excel 2016初步分析，SPSS20.0進行方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中有機酸含量的動態(tài)變化

有機酸的種類與含量不僅影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性、感官特性、營養(yǎng)品質(zhì)等，還能在一定程度上抑制有害微生物的生長[28-29]。復合益生菌發(fā)酵蘋果汁發(fā)酵過程中各有機酸的變化如表2所示。

表2 蘋果汁發(fā)酵過程中各有機酸含量的變化Table 2 Changes of organic acids contents in apple juice during fermentation process

由表2可知，未發(fā)酵的蘋果汁中含量最高的有機酸是蘋果酸，其發(fā)酵初始含量為3 589.62 mg/L，發(fā)酵8 h后含量達到最大值為4 013.48 mg/L，說明發(fā)酵初期有其他物質(zhì)合成蘋果酸，之后迅速下降，這可能是由于乳酸菌在進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵時分解了蘋果酸，在發(fā)酵期間，蘋果酸的含量一直在動態(tài)變化中，說明蘋果酸參與了多個不同的合成與分解的生化反應。乳酸在發(fā)酵過程中，一直處于上升趨勢，發(fā)酵初期變化不大，后期上升顯著，這可能主要是因為發(fā)酵過程中存在蘋果酸-乳酸發(fā)酵，且作為糖酵解產(chǎn)物的丙酮酸也能轉(zhuǎn)化為乳酸導致乳酸含量一直上升，至發(fā)酵結束時，乳酸的含量達到1 930.81 mg/L。

由表2可知，奎寧酸在未發(fā)酵的蘋果汁中含量僅次于蘋果酸，其發(fā)酵起始含量為188.12 mg/L，發(fā)酵過程中，其含量一直處于上升狀態(tài)，至發(fā)酵結束，其含量值為460.21 mg/L。酒石酸在未發(fā)酵的蘋果汁中的起始含量為90.79 mg/L，在益生菌發(fā)酵8 h時，含量達到最大值為208.13 mg/L，之后總體呈下降趨勢，發(fā)酵結束，其含量為145.56 mg/L，較未發(fā)酵時顯著提高。莽草酸在蘋果汁中含量較低，其發(fā)酵起始含量為8.26 mg/L，在整個發(fā)酵過程中，蘋果汁中莽草酸的含量變化不大，至發(fā)酵結束，其含量為9.12 mg/L。在發(fā)酵過程中，蘋果汁中的丙酮酸含量呈先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵8 h時，含量達到最大值為110.23 mg/L，這可能主要是因為在發(fā)酵早期，糖酵解、三羧酸循環(huán)及蘋果酸-乳酸發(fā)酵產(chǎn)物的積累，使得丙酮酸的含量上升，發(fā)酵后期在厭氧條件下，丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸及其他產(chǎn)物[30]。蘋果汁中琥珀酸的含量在益生菌發(fā)酵過程中，呈下降趨勢，其發(fā)酵起始含量為101.45 mg/L，發(fā)酵結束時含量僅為2.72 mg/L，下降顯著。蘋果汁中檸檬酸的含量在發(fā)酵過程中呈動態(tài)變化狀態(tài)，發(fā)酵起始含量為132.12 mg/L，發(fā)酵12 h達到最大值，為278.35 mg/L，這可能是因為作為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的檸檬酸，在發(fā)酵早期，乳酸菌的有氧呼吸，丙酮酸代謝產(chǎn)生檸檬酸[31]，后期無氧環(huán)境下，檸檬酸在乳酸菌的作用下降解生產(chǎn)乳酸、乙酸及雙乙酰等風味物質(zhì)[30]。綜上，蘋果汁經(jīng)復合益生菌發(fā)酵后，與未發(fā)酵的蘋果汁相比，蘋果汁中的蘋果酸和琥珀酸含量顯著下降而乳酸、奎寧酸、酒石酸、莽草酸、丙酮酸及檸檬酸均顯著上升。

2.2 蘋果汁發(fā)酵過程中總酚含量的變化

酚類物質(zhì)是一類生物活性成分，與多種保健功能有關。蘋果汁在益生菌發(fā)酵過程中總酚及總黃酮含量的變化如圖1所示。

圖1 蘋果汁發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.1 Changes of total phenol contents in apple juice during fermentation process

由圖1可知，蘋果汁發(fā)酵前總酚含量為（1 530.55±3.22）mg/L，在復合益生菌發(fā)酵的0～8 h，蘋果汁中的總酚含量增加，8 h達到最大值為（1 546.53±2.43）mg/L，相比未發(fā)酵之前增加了1.04%，發(fā)酵8 h之后，蘋果汁中的總酚含量開始持續(xù)性下降，至發(fā)酵結束，總酚含量為（1 528.34±7.11）mg/L，與未發(fā)酵相比，下降了0.14%。益生菌發(fā)酵對酚類物質(zhì)的影響因發(fā)酵的菌種及發(fā)酵的原料不同而不同[15-17]。酚類物質(zhì)含量的增加可能是因為益生菌能夠促進一些結合酚的解離，其含量的降低，可能是因為其自身的氧化損失或者益生菌產(chǎn)生的酚酸脫羧酶對酚類物質(zhì)的一系列轉(zhuǎn)化。

2.3 蘋果汁發(fā)酵過程中各酚類物質(zhì)組成和含量的變化

復合益生菌發(fā)酵蘋果汁發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的組成及含量的變化如表3所示。

表3 蘋果汁發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的組成及含量的變化Table 3 Changes of phenolic composition and contents in apple juice during fermentation process

由表3可知，綠原酸在發(fā)酵過程中呈下降趨勢，發(fā)酵之前的含量為（79.23±1.21）mg/L，發(fā)酵之后含量為（67.45±0.33）mg/L，下降了14.7%。這可能跟乳酸菌能將綠原酸分解代謝成咖啡酸有關[32]。根皮苷在發(fā)酵過程中呈上升趨勢，其發(fā)酵起始與發(fā)酵結束含量分別是（0.73±0.13）mg/L和（0.87±0.09）mg/L，上升了19.2%。兒茶素、表兒茶素、蘆丁及槲皮素在發(fā)酵初期（0～8）h，其含量均呈上升趨勢，隨著發(fā)酵時間的進一步延長，其含量有所下降，與未發(fā)酵時相比，發(fā)酵結束時其含量分別增加了5.57%、5.65%、4.52%和5.83%。益生菌發(fā)酵對果汁中酚類物質(zhì)的影響機制復雜，有待進一步更詳細的研究。

2.4 發(fā)酵前后蘋果汁風味物質(zhì)的變化

發(fā)酵蘋果汁中風味物質(zhì)的組成和含量是影響產(chǎn)品感官以及消費者接受程度的重要因素。本研究中益生菌發(fā)酵前后蘋果汁揮發(fā)性物質(zhì)的變化如表4所示。

表4 發(fā)酵前后蘋果汁揮發(fā)性風味物質(zhì)及含量Table 4 Volatile flavor substances and contents in apple juice before and after fermentation

續(xù)表

由表4可以看出，蘋果汁發(fā)酵前，共檢測出27種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中酯類12種，醇類5種，醛類5種，酮類3種及其他2種。發(fā)酵后共檢測出37種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類20種，較發(fā)酵之前新產(chǎn)生8種；醇類10種，較發(fā)酵之前新產(chǎn)生5種；醛類2種，較發(fā)酵之前減少3種；酮類3種，較發(fā)酵之前新產(chǎn)生1種，減少1種；其他類2種，較發(fā)酵之前新生成1種，減少1種?？梢?，蘋果汁經(jīng)混合乳酸菌發(fā)酵后，揮發(fā)性成分增加，且主要以酯類和醇類為主。

由微生物的氨基酸代謝產(chǎn)生的醇類物質(zhì)是發(fā)酵蘋果汁中的一類重要揮發(fā)性香氣成分[8]。由表4可以看出，蘋果汁經(jīng)混合益生菌發(fā)酵后，新產(chǎn)生的5種醇類含量由高到低依次是6-甲基-5-庚稀-2-醇（1.382±0.04）mg/L、乙醇（0.927±0.02）mg/L、異丙醇（0.183±0.02）mg/L、正戊醇（0.056±0.01）mg/L、芳香醇（0.031±0.01）mg/L。正丁醇、2-甲基-1-丁醇、正辛醇、1,3-辛二醇較發(fā)酵之前分別增加了39.6%、52.3%、11倍、29倍。6-甲基-5-庚烯-2-醇含量是醇類中含量最高的，但香氣閾值高，香氣值較低。2-甲基-1-丁醇含量位居醇類第二，含量較高，其香氣值也較高，賦予蘋果汁青香。乙醇在發(fā)酵后的果汁中含量也較高，但其香氣閾值很高，對蘋果汁的整體香氣影響不大。正丁醇屬于高級脂肪醇具有水果芬芳的香氣，同時也可作為其他香氣成分的良好溶劑[33]。其他一些含量較低的醇類如芳樟醇、正辛醇和1,3-辛二醇，因其香氣閾值低，對整體的香氣成分具有一定的貢獻。

由表4可以看出，酯類物質(zhì)是發(fā)酵蘋果汁中的種類豐富的香氣成分，因其香氣閾值相對其他物質(zhì)普遍較低，對蘋果汁的風味貢獻較大。蘋果中的酯類香氣成分主要來源于醇類和有機酸的酯化作用以及醇類和甘油酯或乙酰輔酶A的合成[8]。由表4可知，蘋果汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，除新生成的8種酯類物質(zhì)（乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、丙酸丙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯和2,2,4-三甲基-1,3戊二醇二異丁酸酯），其他酯類物質(zhì)較發(fā)酵之前均有所增加。其中，2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯是蘋果汁中發(fā)酵前與發(fā)酵后均存在的主要酯類物質(zhì)，發(fā)酵前后的含量分別是（0.227±0.07）mg/L和（1.605±0.04）mg/L、（1.135±0.08）mg/L和（1.623±0.03）mg/L、（0.557±0.03）mg/L和（0.624±0.02）mg/L、（0.084±0.00）mg/L和（0.723±0.04）mg/L、（1.552±0.02）mg/L和（1.321±0.03）mg/L，使蘋果汁具有強烈的果香。除上述含量較高的酯類物質(zhì)，蘋果汁中還檢出了一些含量低但對整體香氣有影響的物質(zhì)，如2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯和戊酸乙酯等。

由表4可知，除醇類和酯類，蘋果汁中發(fā)酵前后還檢出了醛類、酮類及其他一些香氣成分。醛類化合物在未發(fā)酵的蘋果汁中檢出5種，發(fā)酵后只檢出2種且與發(fā)酵之前相比E-2-己烯醛減少了14倍，這可能是因為醛類物質(zhì)不穩(wěn)定，在微生物的作用下被還原為醇或者被氧化為酸[34]。酮類物質(zhì)4種，其中6-甲基-5-庚烯-2-酮和大馬酮發(fā)酵前后均檢出且發(fā)酵后是發(fā)酵前的9倍和2倍。蘋果汁經(jīng)益生菌發(fā)酵后，還會產(chǎn)生一些如有機酸、胺類、酚類等其他類的揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)的含量都很低[36]，其含量之和占總揮發(fā)性成分的0.5%左右，在本試驗中未列出。香葉基丙酮發(fā)酵之前檢出含量為（0.029±0.03）mg/L，發(fā)酵后未檢出；乙偶姻發(fā)酵后檢出含量為（0.031±0.00）mg/L。其中E-2-己烯醛具有令人愉快的綠葉清香和水果香氣；甲基庚烯酮具有檸檬草般的香氣；大馬酮帶有與玫瑰相似的強烈味道；香葉基丙酮是一種帶有甜味；青草味和水果香味的香氣成分；乙偶姻具有令人愉快的奶香氣[27，35]，這些物質(zhì)雖然含量低，但對蘋果汁的整體香氣有貢獻。

3 結論

經(jīng)高效液相色譜對混合益生菌發(fā)酵蘋果汁發(fā)酵過程中的有機酸、酚類物質(zhì)的變化情況進行檢測分析，結果顯示蘋果汁經(jīng)益生菌發(fā)酵后，有機酸中的蘋果酸和琥珀酸含量顯著下降，分別下降了40.9%和97.3%；而乳酸、奎寧酸、酒石酸、莽草酸、丙酮酸及檸檬酸均上升，其中乳酸發(fā)酵結束含量達到1 930.81 mg/L，其他有機酸的含量分別上升了144.6%、60.3%、10.4%、129.2%和6.1%?？偡雍吭诎l(fā)酵8 h時達到最大值為（1 546.53±2.43）mg/L，發(fā)酵結束時，總酚含量下降了0.14%。其中，兒茶素、表兒茶素、槲皮素、根皮苷和蘆丁含量分別上升了5.57%、5.65%、5.83%、19.2%和4.52%；綠原酸含量下降了14.9%。

經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜檢測分析，蘋果汁未發(fā)酵之前，檢測出27種香氣成分，發(fā)酵之后檢測出37種，增加了10種揮發(fā)性物質(zhì)，主要是一些醇類和酯類化合物，其中發(fā)酵后新產(chǎn)生5種醇類，其含量由高到低依次是6-甲基-5-庚稀-2-醇（1.382±0.04）mg/L、乙醇（0.927±0.02）mg/L、異丙醇（0.183±0.02）mg/L、正戊醇（0.056±0.01）mg/L、芳香醇（0.031±0.01）mg/L；正丁醇、2-甲基-1-丁醇、正辛醇、1,3-辛二醇較發(fā)酵之前分別增加了39.6%、52.3%、11倍、29倍。發(fā)酵后新生成了8種酯類物質(zhì)，其他酯類物質(zhì)較發(fā)酵之前均有所增加。其中，2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯是蘋果汁中發(fā)酵前與發(fā)酵后均存在的主要酯類物質(zhì)，發(fā)酵前后的含量分別是（0.227±0.07）mg/L和（1.605±0.04）mg/L、（1.135±0.08）mg/L和（1.623±0.03）mg/L、（0.557±0.03）mg/L和（0.624±0.02）mg/L、（0.084±0.00）mg/L和（0.723±0.04）mg/L、（1.552±0.02）mg/L和（1.321±0.03）mg/L。這些化合物之間的變化平衡構成了發(fā)酵蘋果汁特有風味。