纖維素水解液發(fā)酵生產氨基酸的研究進展

謝 慧，張周利，張 東，王怡沛，張宏森，毛國濤，王風芹，宋安東*

（河南農業(yè)大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002）

隨著經濟總量的迅速擴大，目前我國面臨資源約束趨緊、環(huán)境污染嚴重、生態(tài)系統(tǒng)退化的嚴峻形勢。解決這一問題的方法之一，是合理開發(fā)生物質資源，尤其是儲量豐富的可再生農業(yè)廢棄物資源，發(fā)展農作物秸稈的高效轉化技術，實現(xiàn)農作物秸稈的無害化與資源化利用。木質纖維素是地球上最豐富的可再生資源，據估計，木質纖維素原料占世界生物質量（1.0×1010～5.0×1010t）[1]的40%～50%[2-3]，這些豐富而廉價的自然資源主要來源于農林業(yè)廢棄物、工業(yè)廢棄物和城市廢棄物。這些資源除少量通過高溫汽化、固化（成型）、液化（高溫裂解）等技術能源化直接或間接作為飼料及用于農村炊事外，其余近75%[4]的比例閑置在田間地頭，沒有實現(xiàn)資源化利用。如果這些資源可以開發(fā)并且得到有效利用，將在很大程度上緩解我國資源緊張的矛盾。

我國農業(yè)生物質資源利用還處于起步階段，這嚴重制約了我國豐富農業(yè)生物質資源對國家經濟社會發(fā)展的支撐和保障作用，近年來，許多高校和科研院所相繼開展了此領域的研究。研究者利用現(xiàn)代生物技術的手段，開展農業(yè)生物質資源轉化為能源（如燃料乙醇、燃料丁醇、生物沼氣、生物氫氣、生物柴油等）、生物基產品（如聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）、聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）和聚對苯二甲酸丙二酸酯（polypropylene terephthalate，PTT）等）、生物飼料、生物肥料和生物農藥等的研究。這些研究取得了一定的理論、技術和工程的進步，但目前我國農業(yè)生物質資源的轉化技術多處于實驗室研究階段，距大規(guī)模產業(yè)化生產尚具有較大的距離。因此，大力開展農業(yè)生物質資源轉化研究是我國資源利用的重大基礎和戰(zhàn)略問題。

1 氨基酸的生產方法

氨基酸主要應用于飼料工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和化妝品行業(yè)，具有數(shù)十億美元的市場[5]。目前中國已經成為氨基酸的生產和消費大國。據統(tǒng)計，2017年總產量約為542萬t[6]，其中賴氨酸的產量達到193萬t[7]，2019年中國賴氨酸出口達到88.8萬t[8]。除了谷氨酸和賴氨酸占據氨基酸大部分市場份額外，氨基酸產品中發(fā)展最為迅速的是蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸等。

氨基酸的生產方法主要是化學合成法、酶轉化法、提取法和微生物發(fā)酵法?；瘜W合成法能夠合成幾乎所有種類的氨基酸，但合成的產物中存在D-、L-兩種旋光異構體，并且無法分離。其中D-異構體大多數(shù)的動物不能利用，因此不具備商業(yè)價值。而酶轉化法原理是利用化學合成法制得的廉價中間體，借助酶的生物催化作用，使許多本來用發(fā)酵法或化學合成法生產的光學活性（具有不同旋光異構體）氨基酸具有工業(yè)生產的可能。但由于酶自身穩(wěn)定性差，易發(fā)生其他反應，同時可產生大量無用的副產物，因此成本高，產率低。提取法是通過蛋白質水解來獲得相應的氨基酸，工藝過程相對簡單，但畢竟原材料來源十分有限，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產。目前全球氨基酸總產量的85%以上都是通過微生物發(fā)酵法生產，利用微生物發(fā)酵發(fā)生產氨基酸的種類較多，可獲得L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-谷酰胺、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-碳酸銨、L-鳥氨酸、L-谷丙酰胺、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸等[9]。

微生物發(fā)酵法生產氨基酸是利用微生物自身能夠合成某種氨基酸的能力，通過對其進行物理及化學方法的誘變處理，選育出營養(yǎng)缺陷型或抗性的菌株，以獲得某種氨基酸的高產菌株。1960年日本首先采用紫外誘變選育出一株谷氨酸棒狀桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株，從此拉開了工業(yè)化發(fā)酵生產L-賴氨酸的序幕。BECKER J等[10]通過廣泛的工程設計，利用谷氨酸棒桿菌使賴氨酸的生產產量達到120 g/L；PARK S H等[11]對谷氨酸棒桿菌的代謝系統(tǒng)工程改造，通過5 L發(fā)酵罐發(fā)酵獲得精氨酸的產量達到92.5 g/L；XU Q Y等[12]使用基因工程菌，通過真空蒸發(fā)除去乙酸和NH4+的方法控制發(fā)酵，使L-色氨酸的產量達到60.2 g/L。ZHOU H Y等[13]使用大腸桿菌MET-3，通過發(fā)酵優(yōu)化控制，使蛋氨酸的產量達到12.8 g/L。目前通過發(fā)酵法生產氨基酸的菌株如表1所示，主要有谷氨酸棒狀桿菌（Cornebacterium glutamicum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）等[14-15]。

表1 目前主要氨基酸生產菌株Table 1 Main amino acid-producing strains

續(xù)表

2 纖維素水解液生產氨基酸的研究進展及存在問題

氨基酸行業(yè)是高糧耗的行業(yè)，發(fā)酵采用的碳源主要是淀粉原料，包括玉米淀粉、小麥淀粉等，如何解決氨基酸工業(yè)中碳源，同時又不與人爭糧、不與人爭地，成為擺在科研人員面前的艱巨任務。以農業(yè)廢棄物為原料替代糧食作物進行氨基酸的生產，既不會改變現(xiàn)有土地的耕種現(xiàn)狀又可以解決與人畜爭糧的問題。而且對農業(yè)廢棄物的利用能夠增加相應農產品的附加值，并減少農業(yè)廢棄物焚燒引起的環(huán)境污染。因此，如何利用農作物等纖維素原料進行氨基酸的發(fā)酵進行生產，也逐漸成為科研工作者研究的熱點。

2.1 我國農業(yè)生物質資源概況

農業(yè)生物質資源主要包括農作物秸稈、農業(yè)加工剩余物和人畜糞便，其中秸稈是農業(yè)生產中產量最大的副產物。我國秸稈資源儲量豐富，全國農作物秸稈總量從2002年的6億t增加至2011年的7.4億t，年均增加2.38%；2011年全國秸稈總量中，稻草27%、玉米秸稈27%、麥秸19%、甘蔗渣7%、油菜秸5%、豆4%、棉柴3%、花生秸2%、其他秸稈6%[16]。2015年全國理論資源量達到10.4億t[17]，可以收集的資源量為9億t[17]，其中玉米秸稈3.6億t[18]，開發(fā)利用潛力巨大。此外，每年還產生2億t林地廢棄物[19]。農產品加工業(yè)副產品主要包括稻殼、玉米芯等，多來源于糧食加工廠、食品加工廠和釀酒廠等，數(shù)量巨大，產地相對集中，易于收集處理，其中中國每年花生殼的廢棄物到500萬t[20]，因此其更便于用作氨基酸發(fā)酵生產的原料。

2.2 木質纖維素的預處理

在木質纖維素原料中，纖維素和半纖維素被木質素緊密包裹，形成能夠抵抗水解的復雜網狀結構，因此在木質纖維素水解之前，需要對其進行預處理。目前預處理方法主要有：物理預處理法，化學預處理法，物理化學預處理法，生物預處理法。不同學者對甘蔗渣、高粱秸稈、玉米秸稈、稻草秸稈等進行了不同的預處理工藝研究，以此獲得高濃度纖維素水解液。

AGUILAR R等[21]利用2%稀硫酸在高溫下處理甘蔗渣24 min，約90%的半纖維素被水解，水解液含21.6 g/L木糖，3 g/L葡萄糖，3.65 g/L乙酸，以及少量的糠醛。同樣的稀酸條件處高溫處理高粱秸稈，處理時間延長到71 min，獲得木糖產量為18.17 g/100 g（原料）；PRISTAVKA A等[22]研究通過蒸汽爆破預處理秸稈，在非連續(xù)攪拌反應器中，添加21%的秸稈固形物，并加入一定量的纖維素酶，獲得總還原糖質量濃度達到160 g/L。

趙晶等[23]采用分批補料酶解工藝，添加20%的秸稈固形物，并加入一定量的纖維素酶，獲得總還原糖質量濃度達到116.3 g/L，酶解得率達到80.1%。宋安東等[24]通過分批補料方式對稀酸水解的玉米秸稈和稻草秸稈進行糖化條件優(yōu)化，72 h獲得水解液中總還原糖含量達到138.5 g/L和84.22 g/L[25]。

2.3 抑制物的脫除

在當前的纖維素水解產業(yè)化探索中，經過預處理之后，都不可避免的產生各種抑制物，包括有機酸（包括甲酸、乙酸和少量的乙酰丙酸等）、糠醛、羥甲基糠醛、糖醛酸、己糖酸和芳香族化合物等[26]。目前用于脫毒處理纖維素水解液的方法，通常是活性炭、堿處理、離子交換等。金顯春等[27]研究了有機酸、醛和酚類物質對汽爆玉米秸稈酶解的影響，結果表明有機酸中甲酸的抑制作用最強，乙酸最弱；酚類物中，香草醛的作用最強，丁香醛次之，4-羥基苯甲醛最弱。LEE J M等[28-29]的研究表明，使用2.5%的活性炭可以去除96%的5-羥甲基糠醛和93%的糠醛以及42%甲酸、14%乙酸，活性炭也可以去除色素等有害物質；GE J P等[30]用氫氧化鈣過飽和處理玉米秸稈水解液，可以去除99%的糠醛、51.4%的乙酸以及16.7%的酚類物質；劉天成等[31]使用混合樹脂床處理秸稈水解液，可去除96%的多酚類物質和94%的陽離子及96%的弱酸根離子。

2.4 糖化和發(fā)酵

木質纖維素原料的糖化與發(fā)酵主要有分步糖化與發(fā)酵（separate hydrolysis and fermentation，SHF）和同步糖化與發(fā)酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）兩種模式。

王燦等[32]通過敲除大腸桿菌工程菌mglB基因，構建雙缺陷菌株JH-B6，降低混合糖發(fā)酵時常存在的葡萄糖效應，以水稻秸稈為原料，經過預處理、分步糖化和88 h發(fā)酵，L-丙氨酸的最大產量為98.4 g/L，糖酸轉化率達到93.9%，較出發(fā)菌株JH-B3縮短了40 h。

CHEN Z Y等[33]以玉米秸稈為原料，經過干酸預處理、固態(tài)生物脫毒后，使用谷氨酸棒桿菌SIIM B253通過同步糖化發(fā)酵，在玉米秸稈固體含量為30%的條件下獲得的L-賴氨最大產量為33.8 g/L。

2.5 纖維素水解液生產氨基酸的研究進展

近年來，許多研究者利用不同的農業(yè)廢棄物，不同的微生物菌種，以及采用不同的生產工藝進行氨基酸的發(fā)酵，結果如表2所示。

表2 纖維素水解液生產氨基酸Table 2 Production of amino acids from cellulose hydrolysate

農業(yè)生物質中被用于氨基酸生產的原料有水稻秸稈及麩皮、玉米秸稈、甘薯渣、菠蘿種子等，這些原料因其價格低廉、儲備量大，受到了廣泛的關注。玉米秸稈經稀酸處理后的液體中含有大量的葡萄糖和木糖，水稻秸稈經過稀酸預處理后的液體中含有大量的木糖，麥麩稀酸預處理后的液體中含有大量的木糖和阿拉伯糖，甘蔗渣的稀酸預處理液中含有大量的木糖。目前以玉米秸稈水解液為原料，L-賴氨酸產量為33.8 g/L[33]；以棉籽蛋白水解液為原料，其最高產量可以達到265 g/L[38]；ANUSREE M等[34]以菠蘿種子水解液及甘蔗渣為原料，經響應面優(yōu)化，在初始糖含量為7.5%，水分含量為70%的條件下，經72 h發(fā)酵，賴氨酸最大產量為16 mg/g干基質，這表明農業(yè)廢棄物水解物可作為大規(guī)模生產氨基酸的替代原料。

目前利用纖維素水解液生產氨基酸的常用菌株有谷氨酸棒桿菌、北京棒桿菌或其誘變菌株。常用的誘變方法有紫外（ultra-violet ray，UV）誘變、硫酸乙二酯（diethyl sulfate，DES）誘變、亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）誘變和常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP），其中ARTP是近年來發(fā)展起來的新型技術，在氨基酸高產菌株的選育上已經有了顯著成效。郭燕風等[40]以黃色短桿菌Q-5為出發(fā)菌株，通過ARTP誘變賦予其新遺傳標記3-ATrSucg，并提高了其原有遺傳標記α-ABr（20～50 mg/mL）和Ethr（3～12 mg/mL）的耐受濃度，最終篩選出L-異亮氨酸產量較高的突變株ART-I，產酸量為（24.1±0.70）g/L，比出發(fā)株菌株提高了33.9%；張東[41]利用常壓室溫等離子技術，對菌株B413、B253進行誘變選育，在100 W，60 s的處理條件下進行十次連續(xù)誘變，分別獲得高產菌株B413-ARTP-X-153和B253-ARTP-X-030，產量最大可達12.16 g/L和22.50 g/L，較未誘變菌株分別提高10.65%和72.94%。除了傳統(tǒng)誘變之外，通過基因工程手段改造氨基酸的代謝通路的這種育種方法越來越受育種工作者的重視。徐建中[14]采用自己構建的方法過表達谷氨酸棒桿菌中L-賴氨酸生物合成途徑中6個關鍵性酶基因，提高了L-賴氨酸生物合成途徑中的代謝通量，發(fā)酵48 h后，L-賴氨酸鹽酸鹽最終產量達155.7 g/L，葡萄糖轉化率達47.2%；周盛等[42]從大腸桿菌（E.coli）K-12中通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增出磷酸果糖激酶編碼基因（pfkA），將其與表達載體pCMVTNTTMvector連接構建成重組質粒pKu-2，轉化谷氨酸棒桿菌B10，并得到表達，從而解除了磷酸果糖激酶對已經改造的賴氨酸的整個代謝途徑的限制。同時，轉化菌對糖轉化率比菌株B10高11.59%，產酸率高16.52%。

雖然以纖維素原料生產氨基酸還處于研究階段，距離工業(yè)化生產還存在較大的差距，但是其巨大的生產潛力不能忽視。構建農作物秸稈高效利用的技術體系及其產業(yè)化是當前我國經濟、社會發(fā)展的迫切需求，對全球資源與環(huán)境領域的技術進步也具有強大的推進作用。

2.6 纖維素水解液生產氨基酸存在問題

利用微生物發(fā)酵法生產氨基酸有著巨大的發(fā)展?jié)摿?。尤其是利用木質纖維素原料生產氨基酸不僅能解決農作物秸稈焚燒，隨意堆放帶來的一系列環(huán)境、安全等問題，而且還能解決淀粉質原料發(fā)酵L-賴氨酸替代品的問題。但目前，將木質纖維素原料進行大規(guī)模的工業(yè)化生產還存在很多問題。

（1）木質纖維原料的收集及儲存

以農作物廢棄物為代表的木質纖維素，分布分散，體積較大，具有季節(jié)性，不利于收集和長期儲存，因此，需要找到合適的處理方法，比如壓縮打捆、壓縮成型等來減少空間，降低收集、儲存和運輸成本。

（2）木質纖維原料的預處理

目前大部分預處理技術仍停留在實驗室階段，盡管稀酸預處理、蒸汽爆破預處理具有可行性，但是處理成本高、轉化效率低、特別是環(huán)境污染大是當前國內外預處理技術面臨的主要瓶頸。因此，積極開發(fā)成本低、效率高、環(huán)境友好的新型預處理技術是木制纖維素高效、綠色轉化的關鍵。MORTEZA H等[43]采用稀酸和酸化甘油（diluted acid acidcatalysed glycerol，DA-AG）兩步法對甘蔗渣進行預處理，使葡聚糖的消化率達到99%，葡萄糖產量為91%。WANG Z M等[44]以FeOCl為催化劑，利用類芬頓預處理方法處理生物質，反應結束后的還原糖含量是未處理的3倍，節(jié)約了成本，有很高的利用價值。

（3）酶處理的成本較高

以玉米秸稈為原料，使用纖維素酶生產1 t葡萄糖，總的成本為3 400～4 500元[45]，其中纖維素酶的成本大概在1 200～2 000元[46]，而如果以淀粉為原料，酶的成本在60～70元[46]。再者玉米秸稈經過預處理和酶解后，其還原糖得率也只有56%[47]。LIN X L等[48]通過酶促水解木質素（enzymatic hydrolysis lignin，EHL）和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）來制備木質素基聚氧乙烯醚來提高玉米秸稈的酶促水解效率，玉米秸稈經過72 h時的葡萄糖轉化率達到70.1%；SONG H T等[49]以玉米秸稈為原料，使用混合纖維素酶和木聚糖酶，葡萄糖的轉化率達到48.5%?？傊?，以玉米秸稈為原料生產葡萄糖，酶的成本高，還原糖得率低是目前的技術難題。而原料中糖濃度低勢必導致發(fā)酵液中氨基酸的含量也不高。

（4）纖維水解液含有毒性物質抑制微生物的生長

纖維水解液含有毒性物質抑制微生物的生長，因此，合適的脫毒方法，或者耐受性菌株的選育將成為提高產量的關鍵。PALMQVIST E等[50]研究表明，水解液里面含有高毒性物質抑制微生物的生長的物質主要包括糠醛、5-羥甲基糠醛（hydroxymethylfurfural，HMF）、香蘭素和丁香醛。目前使用多種脫毒技術，但是成本高，難以實現(xiàn)產業(yè)化應用。盡管生物法脫毒比較新穎，來解決纖維素水解液中毒物去除的難題，但該方法依然處于實驗室研究階段。

（5）全糖利用問題

木質纖維素經過預處理和酶解工藝，獲得可發(fā)酵的水解液，其主要成分包含纖維二糖、己糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖），多糖共存不利于氨基酸的發(fā)酵生產。因為氨基酸的主要生產菌谷氨酸棒桿菌，不能直接利用木糖和阿拉伯糖，因此構建能夠利用全糖的菌株至關重要。SASAKI M等[51]構建的能夠代謝纖維二糖和木糖的谷氨酸棒桿菌工程菌株，在葡萄糖存在的條件下也是同步利用3種碳源。這進一步證明通過工程菌改造的方法引入外源代謝途徑，才能利用木質纖維素水解液中的己糖和戊糖共發(fā)酵進行氨基酸的發(fā)酵生產。

綜上所述，目前以纖維素水解液為原料進行氨基酸的生產，菌株、酶制劑、原料、是所面臨的關鍵難題，但是要突破其產業(yè)瓶頸，依賴于各個環(huán)節(jié)生產技術和工藝的共同進步。

3 展望及挑戰(zhàn)

工業(yè)上用于生產氨基酸的主要原料是玉米、小麥、木薯等淀粉質原料，這些原材料每年價格浮動且遠高于木質纖維素原料價格，且與“不與人爭糧，不與糧爭地”的國家政策相違背，因此急需找到這些原材料的替代品。而玉米秸稈、小麥秸稈等原料含有較高的木質纖維素成分，經高效的預處理、酶解后，可得到高濃度的可發(fā)酵糖。因此，用木質纖維素原料代替淀粉質原料生產氨基酸，不僅節(jié)約資源，響應國家政策，而且可避免農作物秸稈因無法處理而焚燒、隨意堆放帶來的環(huán)境污染問題。同時，也為木質纖維素合理利用，及氨基酸發(fā)展提供新的思路。

然而以纖維素水解液為原料生產氨基酸，其發(fā)酵水平距離工業(yè)化還有很大差距，面臨巨大挑戰(zhàn)，還需要從菌種改造、工藝優(yōu)化、抑制物去除等方面進行突破。如①通過代謝工程改造提高菌株的發(fā)酵性能，包括增加氨基酸前提供應、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADPH）的供應；②耐高溫發(fā)酵菌株的篩選，進行同步糖化發(fā)酵，簡化生產工藝；③對進化菌株進行基因組分析，結合生理代謝數(shù)據與測序結果，挖掘影響菌株生產氨基酸的關鍵基因或調控因子，為進一步的菌種改造和優(yōu)化奠定基礎。