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    高溫煅燒貝殼粉的抗菌除霉性能研究

    2021-10-18 08:58:02汪之和
    科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新 2021年27期
    關(guān)鍵詞:黑曲霉貝殼懸液

    安 鑫 汪之和*

    (上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

    貝類產(chǎn)量是我國(guó)漁業(yè)資源中僅次于魚(yú)類的第二大水產(chǎn)資源,根據(jù)《中國(guó)漁業(yè)年鑒》[1]統(tǒng)計(jì):2019 年我國(guó)貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量約1458 萬(wàn)噸,捕撈量約62 萬(wàn)噸。目前貝類的利用僅限于肉質(zhì)部分,按貝殼占比60%計(jì)算[2],2019 年產(chǎn)生約912 萬(wàn)噸貝殼,大多數(shù)貝殼資源未能得到有效利用,并在一定程度上造成對(duì)環(huán)境的污染[3]。廢棄貝殼的積累已成為真正的環(huán)境問(wèn)題,特別是在貝類養(yǎng)殖區(qū)或沿海地帶。這些貝殼通常有肉質(zhì)殘留,在自然條件下,這些有機(jī)物會(huì)被微生物分解,釋放出有毒有害的氨、硫化氫和烴類氣體[3]。廢棄貝殼的堆積也會(huì)造成沿海水域污染加劇、生態(tài)環(huán)境惡化、生物資源減少等問(wèn)題。

    為了減少貝殼資源的浪費(fèi),已有許多學(xué)者將貝殼作為抗菌劑進(jìn)行相關(guān)研究。比如將貝殼經(jīng)過(guò)高溫煅燒后制得活性氧化鈣,比較不同貝殼煅燒產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的殺菌作用[4]。還有海洋貝殼提取物對(duì)霉菌和酵母菌的抑制作用,使其在食物的保鮮以及防腐也有著重要的應(yīng)用。煅燒貝殼活性鈣已經(jīng)在美國(guó)和日本被允許作為食品添加劑,Young[5]等人研究了添加牡蠣殼對(duì)豆腐品質(zhì)和貨架期的影響,豆腐的口感好,硬度適中,并且保質(zhì)期比使用氯化鎂的豆腐延長(zhǎng)2 天以上。這種活性氧化鈣使得煅燒貝殼粉不僅對(duì)常見(jiàn)致病菌有殺菌和抑菌作用,而且在黑曲霉等霉菌的抑制上也有良好的作用。在日本建筑業(yè),主要是通過(guò)在涂料中添加煅燒牡蠣殼粉防止墻面發(fā)霉[6]。煅燒貝殼粉還可增強(qiáng)其他材料抗菌性能,提高復(fù)合材料的抑菌效果[7-9]。

    本文利用高溫煅燒貝殼粉為抑菌劑, 選擇最具代表性的金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌做供試菌,研究貝殼粉對(duì)兩種致病菌的抗菌性能和殺菌作用,以及抑菌圈試驗(yàn)。同時(shí)測(cè)定貝殼粉的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度;同時(shí)以黑曲霉菌為供試菌測(cè)定貝殼粉防霉性能,為高溫煅燒貝殼粉作為抗菌劑應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 材料與試劑

    材料:太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)購(gòu)于上海市蘆潮港生鮮市場(chǎng);供試菌株:大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、黑曲霉菌(ATCC16404)均取自上海海洋大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室,由國(guó)家級(jí)菌種保藏機(jī)構(gòu)提供。

    試劑:營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基均為北京雙旋微生物培育制品廠生產(chǎn);無(wú)菌水;氧化鈣,分析純。

    1.1.2 主要儀器設(shè)備

    QL-861 型旋渦混合器:海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠;JY-150B超聲波破碎儀:北京天恩瀚拓科技有限公司;ZWY 全溫型搖床:常州金壇娘友公司;S2 pH 計(jì):上海梅特勒- 托利多儀器有限公司;SW-CJ-1F 型超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DSX-280A 型不銹鋼手提式滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;UV-2000 型紫外分光光度計(jì):尤尼柯上海儀器有限公司;ALC-110,ACCULAB 型電子天平:鞏義市予華儀器有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 煅燒貝殼粉的制備

    貝殼預(yù)處理: 水煮貝殼直到開(kāi)口,去除內(nèi)臟和閉殼肌,浸泡24h 后將表面處理干凈。在自然光照下晾干2d 后,用去離子水清洗,并破碎成0.3cm 左右小塊。并置于稀醋酸溶液浸泡2h,再用去離子水清洗,將貝殼置入烘箱70℃恒溫烘干20h,冷卻后粉碎,過(guò)100 目篩,得到100μm 左右的貝殼粉[10]。

    將貝殼粉末置于1100℃的溫度下進(jìn)行煅燒處理,稱取適量粉碎好的貝殼粉坩堝中,設(shè)置溫度1100 ℃,煅燒時(shí)間為2 h,冷卻煅燒后的樣品均保存在密閉容器中,以避免使用前與二氧化碳和空氣中的水分發(fā)生反應(yīng)。

    1.2.2 煅燒貝殼粉懸濁液的制備

    參考GB/T 21510-2008 納米無(wú)機(jī)材料抗菌性能檢測(cè)方法[11],用生理鹽水配制濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%的高溫煅燒貝殼粉懸濁液。為了保證粉末在液體中分散均勻,采用超聲波分散3min,保證全部分散成均勻懸濁液。

    1.2.3 試驗(yàn)菌種活化及菌懸液的制備

    大腸桿菌、金黃色葡萄球菌:參考GB/T21510-2008 納米無(wú)機(jī)材料抗菌性能檢測(cè)方法[11],對(duì)供試菌種進(jìn)行活化分離、純化,在37℃培養(yǎng)24h 得到第三代培養(yǎng)物。取活化后的第三代培養(yǎng)物稀釋成濃度為105cfu/mL 的菌懸液。

    黑曲霉菌:在無(wú)菌操作臺(tái)上將霉菌孢子接種在PDA 培養(yǎng)基斜面上,28℃培養(yǎng)至斜面長(zhǎng)滿黑色霉菌孢子。取10 mL 無(wú)菌水倒入PDA 培養(yǎng)基斜面,用無(wú)菌接種環(huán)輕刮菌種表面洗出孢子,并倒入含玻璃珠的無(wú)菌水中,振蕩使孢子團(tuán)分散,并用無(wú)菌快速定性濾紙過(guò)濾,除去菌絲碎片、瓊脂塊和孢子團(tuán)。4000 rpm 離心,收集孢子沉淀并用50 mL 無(wú)菌水清洗,再次離心并收集沉淀,洗滌3 次,最后用無(wú)菌無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液稀釋,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),使孢子液中孢子含量為1×106個(gè)/mL~5×106個(gè)/mL。

    1.2.4 煅燒貝殼粉抑菌性能測(cè)定

    將5mL 菌懸液添加至95mL 制備好的貝殼粉懸濁液(0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%),置于恒溫37℃振蕩器中振蕩培養(yǎng),選用分析純微米尺度二氧化硅粉末作為對(duì)照組,振蕩時(shí)間為24 小時(shí),進(jìn)行平板法菌落計(jì)數(shù)。

    根據(jù)公式計(jì)算試驗(yàn)菌的增長(zhǎng)值F。對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等細(xì)菌,當(dāng)F≥1.5,且對(duì)照燒瓶中的活菌濃度比接種時(shí)的活菌濃度增加時(shí),試驗(yàn)判定為有效。否則試驗(yàn)無(wú)效,需重新進(jìn)行試驗(yàn)。

    F=lgWt-lgW0

    式中:

    F:對(duì)照樣的試驗(yàn)菌增長(zhǎng)值;

    Wt:對(duì)照樣24h 振蕩接觸后燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度的平均值(cfu/mL);

    W0:對(duì)照樣“0”接觸時(shí)間燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度的平均值(cfu/mL)。

    1.2.5 煅燒貝殼粉殺菌作用時(shí)間研究

    測(cè)定1.0%含量的貝殼粉懸液不同作用時(shí)間,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率。細(xì)菌初始濃度配制為108cfu/mL,作用時(shí)保持振蕩,使貝殼粉一直懸浮均勻,振蕩時(shí)間(作用時(shí)間)分別為0、10、20 及30 min,對(duì)照組選用分析純微米尺度二氧化硅粉末,殺菌溫度為26℃[11]。

    1.2.6 濾紙片法測(cè)定煅燒貝殼粉抑菌作用

    選取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為測(cè)試菌種,將載有樣品的濾紙片置于涂有菌液的瓊脂培養(yǎng)基中,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時(shí),測(cè)量抑菌圈的寬度[12]。抑菌帶寬度(H)的計(jì)算如式所示:

    H=(D-d)/2

    其中:D 為抑菌帶外徑的平均值(mm);d 為樣品的直徑(mm)。

    圖1 抑菌帶寬度計(jì)算示意圖

    用移液槍分別吸取無(wú)菌水、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%及1.0%三種混懸液各20μL 注入到對(duì)應(yīng)的小圓片的正中央,自然晾干待用。濾紙片僅一側(cè)滴加樣品,搖晃懸液,使懸液均勻。在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 小時(shí),用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈尺寸。

    1.2.7 最小抑菌濃度的測(cè)定(MIC)

    采用生理鹽水配制濃度為1.0%的貝殼粉懸液,并進(jìn)行系列對(duì)倍稀釋,混勻待用;含抗菌劑培養(yǎng)液配制:分別取各稀釋度樣品2.5 mL 和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液2.5 mL 于潔凈的試管內(nèi),陽(yáng)性對(duì)照組用2.5 mL 的生理鹽水代替樣品[12]。所有試管加液完后蒸汽滅菌。待冷卻至室溫,用超聲波分散3 min,添加0.1 mL 菌懸液并晃動(dòng)均勻。將整個(gè)試管架置于恒溫振蕩箱中,37℃振蕩24h,轉(zhuǎn)速200 rpm。24h 后對(duì)所有試管的渾濁度進(jìn)行比對(duì),判定其MIC。

    1.2.8 最小殺菌濃度的測(cè)定(MBC)

    在最小抑菌濃度的基礎(chǔ)上,選擇培養(yǎng)液開(kāi)始渾濁周圍幾個(gè)稀釋度,進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)后的培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),得出最小殺菌濃度。方法同MIC 的測(cè)定,在超凈臺(tái)內(nèi),用無(wú)菌移液槍各吸取1 mL 上述篩選出的樣本于無(wú)菌平皿內(nèi),并注入25 mL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基搖晃均勻,待其自然凝固,將平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察培養(yǎng)24h 后的平皿中細(xì)菌生長(zhǎng)情況,比對(duì)菌落數(shù)量,判定其MBC。

    1.2.9 煅燒貝殼粉對(duì)黑曲霉的抑制研究

    殺霉率測(cè)定:采用1%的貝殼粉準(zhǔn)確稱取1.00g 樣品(貝殼粉)和對(duì)照(微米級(jí)二氧化硅粉)于干燥潔凈的250 mL 錐形瓶中。用生理鹽水配置培養(yǎng)液,沙氏液體培養(yǎng)基的含量為正常沙氏液體培養(yǎng)基溶液的五百分之一。在恒溫振蕩箱中振蕩12 h(調(diào)節(jié)溫度為28℃,轉(zhuǎn)速150 rpm),振蕩后的培養(yǎng)液進(jìn)行10 倍梯度系列稀釋,從每個(gè)稀釋倍數(shù)的液體中分別吸取0.1 mL,加入準(zhǔn)備好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 平板中,用無(wú)菌玻璃推棒涂布均勻。平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,對(duì)平皿中霉菌菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算殺霉率[13]。

    防霉性能的測(cè)定:采用1.0%貝殼粉懸浮液測(cè)定其對(duì)黑曲霉的防霉性能,采用經(jīng)驗(yàn)證不具有防霉性能的微米級(jí)二氧化硅粉作為對(duì)照。接種后,將平板置于28℃(相對(duì)濕度90%±5%)的條件下培養(yǎng)28 天[13,14]。防霉效果評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。

    表1 防霉效果評(píng)價(jià)[13]

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同濃度高溫煅燒貝殼粉懸濁液對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌效果

    表2 為不同濃度貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。由表2 可知,隨著高溫煅燒貝殼粉懸濁液濃度增加,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果增大。當(dāng)濃度達(dá)到0.05%時(shí),高溫煅燒貝殼粉懸液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均大于99.99%,表現(xiàn)出優(yōu)異的抑菌性能。然而,0.01%的高溫煅燒貝殼粉懸液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率分別為92.50%和47.33%,結(jié)果表明其對(duì)大腸桿菌具有明顯的抑菌性能,而對(duì)金黃色葡萄球菌幾乎不具有抑菌性能。同時(shí)表明低濃度的貝殼粉懸液,抗大腸桿菌性能比抗金黃色葡萄球菌性能好。

    表2 不同濃度貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果

    2.2 作用時(shí)間對(duì)兩種細(xì)菌的殺菌效果

    表3 為1%濃度貝殼粉懸濁液作用時(shí)間對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果。由表3 可知,1.0%的貝殼粉懸液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用0min 的殺菌率分別為5.56%和34.29%;隨著時(shí)間延長(zhǎng),5min 后對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率分別為99.99%和99.50%。表明1.0%的貝殼粉懸液對(duì)菌濃度在108cfu/mL 數(shù)量級(jí)的大腸桿菌作用5 min 后,即可幾乎全部殺滅。10min 之后培養(yǎng)液中的兩種幾乎全部被殺滅(殺菌率大于99.99%)。說(shuō)明1.0%的貝殼粉懸液對(duì)菌濃度在108cfu/mL 數(shù)量級(jí)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用僅10 min 即可幾乎全部殺滅,具有優(yōu)異的殺菌性能。

    表3 1%濃度貝殼粉懸濁液作用時(shí)間對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果

    2.3 濾紙片法分析

    表4 為高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌濾紙片法抑菌效果。由表4 可知,對(duì)照組濾紙樣品周圍長(zhǎng)滿大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,無(wú)抑菌圈產(chǎn)生,相比對(duì)照組,所有負(fù)載不同濃度貝殼粉的濾紙片均產(chǎn)生了抑菌環(huán),相同樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)寬度比大腸桿菌的抑菌環(huán)寬度大,并且隨著高溫煅燒貝殼粉懸液濃度的增加,抑菌環(huán)寬度也在增加。表明負(fù)載貝殼粉的濾紙片中的貝殼粉可以通過(guò)擴(kuò)散作用擴(kuò)散至培養(yǎng)基中,抑制大腸桿菌及金黃色葡萄球菌生長(zhǎng),形成抑菌環(huán)。

    表4 高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌濾紙片法抑菌效果

    2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的確定

    高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)如表5 所示,陰性對(duì)照未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照組及金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照組均變渾濁。高溫煅燒貝殼粉濃度在313 ppm 以上時(shí),試管均未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,當(dāng)樣品濃度小于等于250 ppm 時(shí),試管中的培養(yǎng)液變渾濁,且渾濁度隨著濃度降低而增加。可確定高溫煅燒貝殼粉樣品時(shí)對(duì)大腸桿菌(和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)均為313 ppm。

    表5 高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)

    表6 為高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)。由表6 可知,陰性對(duì)照未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照組及金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照組均變渾濁,進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照基本滿板生長(zhǎng)。高溫煅燒貝殼濃度在250 ppm 及其以下時(shí),平板中細(xì)菌多不可計(jì);樣品濃度為313 ppm 時(shí),平板中有少量細(xì)菌生長(zhǎng);樣品濃度為500 ppm 時(shí),金黃色葡萄球菌僅4 個(gè)菌落生長(zhǎng),大腸桿菌僅3 個(gè)菌落生長(zhǎng);當(dāng)濃度在625 ppm 及其以上時(shí),平板中均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。以上結(jié)果與高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為313 ppm 也是一致的。綜上,確定高溫煅燒貝殼粉樣品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)均為500 ppm。

    表6 高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)

    2.5 高溫煅燒貝殼粉對(duì)黑曲霉菌抑制效果

    表7 為霉菌生長(zhǎng)平板圖。由表7 可知,對(duì)照組培養(yǎng)基表面黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子覆蓋面積大于60%,陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)基表面有大量黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子生長(zhǎng)。陰性對(duì)照培養(yǎng)基表面無(wú)黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子生長(zhǎng),對(duì)照樣培養(yǎng)基表面存在大量黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子,試驗(yàn)樣培養(yǎng)基表面無(wú)黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子生長(zhǎng),判定1.0%貝殼粉對(duì)黑曲霉的防霉等級(jí)為0級(jí)。為探究高溫煅燒貝殼粉的殺霉率,表9 結(jié)果表明,振蕩培養(yǎng)12 h 后,通過(guò)在PDA 培養(yǎng)基平皿中菌落計(jì)數(shù),對(duì)照組培養(yǎng)液中活菌數(shù)為2.7×104個(gè)/mL,實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中活菌數(shù)為10 個(gè)/mL,對(duì)黑曲霉的殺滅率為99.96%。

    表7 霉菌生長(zhǎng)平板圖

    表8 高溫煅燒貝殼粉對(duì)黑曲霉抑制性能評(píng)價(jià)

    3 結(jié)論

    3.1 通過(guò)研究牡蠣殼所制備的高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力和殺菌效果,結(jié)果表明,0.05%的高溫煅燒貝殼粉懸濁液對(duì)兩種致病菌的抑制率達(dá)到99%以上,0.01%的高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌的抑制效果比金黃色葡萄球菌的抑制效果好。1.0%濃度的貝殼粉作用5min 即可殺滅99%的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。隨著懸濁液濃度的增加,對(duì)兩種致病菌的抑菌圈寬度增大,1.0%懸液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)寬度分別為0.40 mm 和0.85 mm。這些結(jié)果表明,低濃度的高溫貝殼粉懸濁液具有一定的殺菌和抑菌作用,其抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步探究[15]。

    3.2 1.0%含量的貝殼粉與無(wú)機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基所形成的混合物對(duì)黑曲霉的防霉等級(jí)為0 級(jí),具有優(yōu)異的防霉性能。1.0%含量的貝殼粉對(duì)黑曲霉孢子作用12 h 的殺滅率達(dá)到99.96%,具有優(yōu)異的殺霉性能。

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