• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于三甲基苯磺酰羥胺消除反應的氧連接氮乙酰葡萄糖胺修飾肽段的精準鑒定

    2021-10-16 01:10:58郭志新秦偉捷
    色譜 2021年11期
    關(guān)鍵詞:疊氮人為巰基

    郭志新, 李 航, 秦偉捷

    (軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 國家蛋白質(zhì)科學中心(北京), 蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室, 北京 102206)

    氧連接氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,它廣泛參與機體的眾多生命活動,而其穩(wěn)態(tài)的破壞與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等[1-7]。大規(guī)模富集鑒定O-GlcNAc修飾蛋白有助于深度挖掘其生物學功能及相關(guān)疾病機制。由于O-GlcNAc糖基化修飾豐度低、形成的糖苷鍵不穩(wěn)定等[8],O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定面臨一定挑戰(zhàn)。因此,發(fā)展高效的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段富集鑒定新方法是對其深入研究的關(guān)鍵。

    非天然糖代謝標記技術(shù)作為蛋白質(zhì)糖基化研究的通用技術(shù)被廣泛應用于O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定[9-12]。非天然糖通常攜帶一個生物正交化學報告基團(如疊氮),其親水性羥基常以疏水性的乙酰基包裹保護,從而增強非天然糖的細胞攝取。全乙酰化的非天然糖進入細胞后通過細胞內(nèi)糖代謝途徑轉(zhuǎn)化為相應底物尿苷二磷酸-氮乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAz),進而被O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT)識別并整合在目標蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸羥基上,隨后可通過特異性的生物素探針捕捉目標蛋白質(zhì),實現(xiàn)O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定[13]。然而,最新研究表明,在細胞代謝標記過程中,全乙?;姆翘烊惶菚瑫r標記半胱氨酸的巰基而產(chǎn)生半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物[14-17],并且在蛋白質(zhì)或肽段層面的O-GlcNAc糖基化修飾鑒定結(jié)果中,難以排除副反應產(chǎn)物半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的干擾。因此,建立一種特異性去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法具有十分重要的意義。

    近年來,三甲基苯磺酰羥胺(MSH)被廣泛應用于蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基修飾物的氧化消除。MSH是一種氧化及胺化試劑,它可以提供游離的氨基以進攻硫醚中的親核性硫原子,在一定堿性條件下轉(zhuǎn)化為亞硫亞胺中間體,進而發(fā)生消除反應生成烯烴產(chǎn)物[18]。Davis課題組[19]在pH=8的溫和體系下,利用MSH氧化消除絲氨酸蛋白酶突變體S-乙基半胱氨酸中的硫醚鍵,成功將其轉(zhuǎn)化為脫氫丙氨酸。隨后,MSH氧化消除法又被成功應用于半胱氨酸巰基-微囊藻毒素修飾物中硫醚鍵的斷裂[20]。在此基礎(chǔ)上,本研究發(fā)展了MSH特異性消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法,實現(xiàn)了細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的精準鑒定,為非天然糖代謝標記技術(shù)在糖蛋白組學分析中的應用提供了新的研究策略。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    Ultrafle Xtreme MALDI TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀(Bruker公司,德國), EASY Nlc 1 200 Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀、HERAcell VIOS 160i細胞培養(yǎng)箱、MSC-100 Thermo-Shaker恒溫振蕩金屬浴、Micro 21微量離心機、Nano Drop 2000C超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司,美國), Concentrator Plus真空離心濃縮儀(Eppendorf公司,德國), Sartorius BP211d分析天平(Sartorius公司,德國), LX-200型迷你離心機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司,江蘇)。

    細胞低糖培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。O-GlcNAc水解酶抑制劑(Thiamet G)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自美國Corning公司。二甲基亞砜(DMSO)購自北京百靈威科技有限公司。疊氮全乙?;肴樘前?Ac4GalNAz)、核質(zhì)蛋白提取試劑盒、三苯基磷-生物素探針、鏈霉親和素磁珠和表面活性劑去除柱均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。十二烷基磺酸鈉(SDS)購自美國USB公司。MSH購自上海易恩化學技術(shù)有限公司。鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl, 1 mol/L, pH=7.4)購自北京索萊寶科技有限公司。碳酸氫銨(NH4HCO3)、甲酸(FA)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)和乙基苯基聚乙二醇(NP-40)均購自德國Sigma Aldrich公司。磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鈉(NaCl)、碳酸鈉(Na2CO3)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。所有化學試劑均為分析級或HPLC級,不經(jīng)額外純化直接使用。

    1.2 MSH氧化消除反應的建立

    1.2.1半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的制備

    首先取30 μg巰基標準肽段溶于23 μL碳酸鈉緩沖液(25 mmol/L, pH=10)中,然后加入終濃度2 mmol/L的Ac4GalNAz,于37 ℃恒溫箱孵育90 min,然后經(jīng)C18柱脫鹽熱干備用,待MALDI-TOF MS分析。

    1.2.2MSH氧化消除

    將上述制備的半胱氨酸巰基人為修飾物復溶于15 μL磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8),測定濃度后取出4 μg加入磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)至終體積40 μL,取出5 μL作為實驗對照組備用。

    將1 μg疊氮標記的O-GlcNAc(N3-O-GlcNAc)標準肽段溶于磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)中,配至終體積40 μL,取出5 μL作為實驗對照組備用。

    剩余樣品中分別加入終濃度15 mmol/L的MSH,于室溫快速渦旋1 min后,隨后置于95 ℃避光振蕩反應30 min,反應前后均采用MALDI-TOF MS進行分析。

    1.3 Hela細胞中O-GlcNAc修飾肽段的富集

    1.3.1Hela細胞代謝培養(yǎng)

    待Hela細胞生長狀態(tài)良好時進行代謝培養(yǎng):在10 mL細胞低糖培養(yǎng)基中加入終濃度100 μmol/L的Ac4GalNAz,再加入終濃度10 μmol/L的Thiamet G備用。移去Hela細胞的原培養(yǎng)基,用PBS清洗細胞兩次,加入配制的低糖培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

    1.3.2核質(zhì)蛋白提取及酶切

    收集的細胞于4 ℃以2 000 g離心3 min后移去上清液,使用核質(zhì)蛋白提取試劑盒提取核質(zhì)蛋白。首先向細胞加入1 000 μL細胞質(zhì)蛋白提取試劑I,以2 500 r/min渦旋15 s懸浮沉淀,于冰上放置10 min后加入55 μL細胞質(zhì)蛋白提取試劑II,以2 500 r/min渦旋5 s,再于冰上放置1 min,以2 500 r/min渦旋5 s,隨后于4 ℃以16 000 g離心5 min,轉(zhuǎn)移上清胞質(zhì)提取物至離心管。在剩下的組分中加入500 μL細胞核蛋白提取試劑,以2 500 r/min渦旋15 s,冰上放置10 min,重復操作4次,于4 ℃以16 000 g離心10 min,轉(zhuǎn)移上清至離心管,合并兩次上清液,即為核質(zhì)蛋白。

    將提取的核質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)移至10 kDa超濾管,以14 000 g離心15 min,用50 mmol/L NH4HCO3溶液清洗4次,檢測蛋白質(zhì)濃度。在核質(zhì)蛋白中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶50),于37 ℃恒溫箱酶切16 h,酶切后以14 000 g離心10 min,收集肽段,并用水清洗超濾管兩次。收集的肽段于45 ℃真空熱干后置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3酶切肽段的氧化消除

    熱干的肽段用磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)復溶,并測定其濃度。隨后將肽段溶液稀釋至1 μg/μL,取400 μL加入終濃度15 mmol/L的MSH,室溫快速渦旋1 min后于95 ℃避光振蕩反應30 min。反應完成后用C18柱脫鹽,于45 ℃真空熱干備用。

    1.3.4N3-O-GlcNAc修飾肽段的富集及洗脫

    取鏈霉親和素磁珠50 μL,棄去保護液,用300 μL PBS清洗4次,備用。熱干的肽段用100 μL PBS復溶,加入終濃度200 μmol/L的三苯基磷-生物素探針于37 ℃恒溫箱孵育過夜,標記N3-O-GlcNAc修飾肽段。使用0.5 mL表面活性劑去除柱去除未反應的三苯基磷-生物素探針。生物素標記后的肽段補加PBS至終體積672 μL,并加入28 μL含100 g/L SDS的水溶液,然后將其全部轉(zhuǎn)移至磁珠中,室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h,孵育結(jié)束后,棄去上清液。

    稱取146.2 mg NaCl和70.9 mg Na2HPO4,溶于25 mL水中,并加入25 mL Tris-HCl,配制為緩沖液A;依次使用300 μL含0.2% (v/v)NP-40的緩沖液A、300 μL緩沖液A及300 μL水分別清洗磁珠2次;然后加入80 μL含0.15% (v/v)TFA的水溶液,于95 ℃煮10 min,取洗脫液于離心管中;繼續(xù)用80 μL含0.15% (v/v) TFA的水溶液及80 μL洗脫液TFA-ACN-H2O(1∶50∶49, v/v/v)分別清洗磁珠1次;洗脫液合并過C8膜后于45 ℃真空熱干,熱干后置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 分析條件

    1.4.1MALDI-TOF MS

    將DHB溶于H3PO4-ACN-H2O(1∶29∶70, v/v/v)溶液,配制成25 mg/mL的DHB基質(zhì)溶液。將1 μL樣品及1 μL DHB基質(zhì)溶液混合點于靶板上后室溫干燥,采用陽離子反射模式在20 kV加速電壓下進行譜圖采集。

    1.4.2LC-MS/MS

    流動相A和B分別為含0.1%(v/v) FA的水溶液和FA-H2O-ACN (1∶19∶80, v/v/v)。富集的肽段用流動相A復溶,以600 nL/min通過C18反相分析柱(150 mm×0.15 mm, 1.9 μm)實現(xiàn)樣品分離。洗脫程序為:0~8 min, 6%B~12%B; 8~58 min, 12%B~30%B; 58~70 min, 30%B~40%B; 70~71 min, 40%B~95%B; 71~78 min, 95%B。

    噴霧電壓設(shè)定為2.3 kV,質(zhì)譜分析的一級掃描范圍設(shè)置為300~1 400 Da,分辨率為120 000;質(zhì)譜的二級譜圖以數(shù)據(jù)依賴型掃描模式(DDA)進行采集,二級碎裂方式為高能誘導解離(HCD),能量設(shè)置為35%,離子注入時間為50 ms。

    1.5 數(shù)據(jù)檢索

    LC-MS/MS數(shù)據(jù)(Raw文件)使用MaxQuant(版本1.6.17.0)以UniProt人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(20207-2015.7.21)為參考進行檢索,檢索條件設(shè)置如下:蛋白水解酶設(shè)置為胰蛋白酶,最多允許兩個漏切位點。甲硫氨酸氧化(M),蛋白質(zhì)N-末端乙?;?生物素標簽(Biotin-N3-O-GlcNAc,m/z=994.391 1)以及半胱氨酸巰基人為修飾物消除(-H2S,m/z=-33.987 7)均設(shè)置為可變修飾。母離子的最大質(zhì)量容差設(shè)置為2.0×10-5mg/L,碎片離子的最大質(zhì)量容差設(shè)置為0.5 Da,蛋白質(zhì)和肽段譜圖匹配的假陽性率(FDR)水平均設(shè)置為1%。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的構(gòu)建

    研究表明[14],在堿性條件下,全乙?;姆翘烊粏翁强苫谶~克爾加成原理與半胱氨酸的巰基發(fā)生反應,生成半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物?;诖?實驗采用碳酸鈉緩沖液(200 mmol/L, pH=10),利用Ac4GalNAz于37 ℃孵育巰基標準肽段90 min,構(gòu)建半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(見圖1a)。孵育產(chǎn)物的MALDI-TOF MS分析結(jié)果如圖1b所示,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)被成功檢測。通常,Ac4GalNAz體外孵育巰基標準肽段的產(chǎn)物多為二乙?;腚装彼釒€基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694),在堿性條件下乙?;l(fā)生部分水解,而產(chǎn)生單乙酰化的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 422.683)。以上結(jié)果表明半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的成功構(gòu)建。

    圖 1 (a)Ac4GalNAz孵育巰基肽段的反應式和(b)反應產(chǎn)物的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 1 (a) Reaction diagram of thiol peptide incubated with tetraacetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) and (b) MALDI-TOF MS spectrum of reaction products

    2.2 半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的氧化消除

    MSH作為一種氧化及胺化試劑,可潛在用于半胱氨酸巰基修飾物的氧化消除。在此基礎(chǔ)上,實驗將上述構(gòu)建的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物作為底物,探究MSH氧化消除反應的最佳反應條件。如圖2所示,在適宜的反應條件下,MSH可進攻半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的親核性硫原子,引發(fā)氧化消除反應,生成目標消除產(chǎn)物(m/z=1 102.604)。為了避免強烈的堿性條件對O-GlcNAc糖基化修飾的破壞,實驗首先確定了溫和的磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)體系,并且MSH在該體系下具有較高的熱穩(wěn)定性[21]。由于升高反應溫度有利于反應物分子吸收能量、促進反應的快速進行,實驗考察了不同反應溫度對MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的影響。實驗利用過量的MSH分別于4、20、50、80及95 ℃條件下處理半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物30 min(見表1)。MALDI-TOF MS分析結(jié)果(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com)顯示,在4、20和50 ℃反應30 min后,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)依舊有較高的信號強度,且未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物峰,說明反應未發(fā)生;在80 ℃反應30 min后,目標消除產(chǎn)物峰(m/z=1 102.604)部分生成,但半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)仍存在,表明氧化消除反應不完全;而在95 ℃反應30 min后,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物峰(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)完全消失,并且目標消除產(chǎn)物峰(m/z=1 102.604)顯示較高的信號強度,表明該半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)已被完全氧化消除。上述實驗結(jié)果表明,當溫度達95 ℃時,MSH可較完全氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。實驗進一步在95 ℃條件下評估了MSH氧化消除反應的反應時長(見表1)。MALDI-TOF MS分析結(jié)果顯示,在95 ℃條件下縮短反應時間,目標消除產(chǎn)物(m/z=1 102.604)部分生成,但半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)仍存在,消除不完全(見附表2)。綜上,實驗采用95 ℃反應30 min的條件實現(xiàn)MSH快速高效地氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。

    圖 2 MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物機理Fig. 2 Mechanism of oxidative elimination of cysteine thiol-azidosugar artificial modification with O-mesitylenesulfonylhydroxylamine (MSH)

    表 1 MSH于不同條件下氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的反應結(jié)果

    為了進一步驗證MSH氧化消除法的可行性,實驗制備了另一個半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 817.750) (見附圖1),并利用MSH于95 ℃避光處理該半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物30 min,理論反應式如圖3a所示;反應后的譜圖如圖3b所示,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 817.750)完全消失,并生成目標消除產(chǎn)物(m/z=1 455.661)。除此之外,圖3b顯示有未知峰(m/z=1 625.267)的生成,該物質(zhì)與推測的實驗潛在副產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量均不匹配(見附圖2)。由于反應體系復雜,未知峰(m/z=1 625.267)的化學分子式難以確定,猜測其是由消除產(chǎn)物衍生形成的副產(chǎn)物。但是,由于未知物(m/z=1 625.267)的相對分子質(zhì)量與半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物及相關(guān)乙?;夥宓南鄬Ψ肿淤|(zhì)量均不相同(見附圖3),該未知物的存在并不會干擾O-GlcNAc糖基化修飾的質(zhì)譜鑒定。綜上,MSH氧化消除法簡單可行,可高效去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。

    圖 3 (a)MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的反應式和(b)反應產(chǎn)物的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 3 (a) Reaction diagram of oxidative elimination of cysteine thiol-azidosugar artificial modification with MSH and (b) MALDI-TOF MS spectrum of reaction products

    2.3 N3-O-GlcNAc修飾肽段的穩(wěn)定性考察

    為了考察MSH氧化消除反應是否會同時破壞O-GlcNAc糖基化修飾,實驗選用了兩條含N3-O-GlcNAc修飾的標準肽段(m/z=1 333.758和m/z=1 354.707) (見附圖4)進行測試。兩條N3-O-GlcNAc標準肽段分別經(jīng)MSH在95 ℃條件下避光處理30 min,并采用MALDI-TOF MS分析。對比反應前、后的質(zhì)譜圖(見圖4),兩條N3-O-GlcNAc標準肽段峰經(jīng)MSH處理后仍穩(wěn)定存在,表明MSH氧化消除反應不會破壞N3-O-GlcNAc糖基化修飾。在后續(xù)復雜的生物代謝樣本中,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物與O-GlcNAc糖基化修飾肽段同時存在,該策略可在消除巰基-疊氮糖人為修飾物的同時,進一步保證內(nèi)源O-GlcNAc糖基化修飾肽段在MSH氧化消除反應中的穩(wěn)定性。因此,MSH氧化消除法可以應用于細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的富集鑒定。

    圖 4 兩條N3-O-GlcNAc肽段在MSH處理前、后的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 4 MALDI-TOF MS spectra of two N3-O-GlcNAc peptides before and after treated with MSH

    2.4 O-GlcNAc修飾肽段的精準鑒定

    O-GlcNAc糖基化修飾是一種動態(tài)可逆的翻譯后修飾,它參與許多重要的生物信號通路。研究表明,細胞質(zhì)和細胞核中的多種蛋白質(zhì)會發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾[22,23]。為了深入了解O-GlcNAc糖基化修飾蛋白的生物學功能,實驗選取Ac4GalNAz代謝Hela細胞后的核質(zhì)蛋白作為研究對象?;诤唵坞亩螌用?MSH特異性氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物方法的成功構(gòu)建,實驗利用MSH氧化消除核質(zhì)蛋白中的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物,并鑒定到51條半胱氨酸巰基人為修飾消除產(chǎn)物肽段。該鑒定結(jié)果證明,在細胞代謝樣本中,MSH氧化消除法可以去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的假陽性干擾,從而實現(xiàn)O-GlcNAc糖基化肽段的精準鑒定。最終,實驗利用生物素探針以及鏈霉親和素磁珠富集鑒定核質(zhì)蛋白中的N3-O-GlcNAc糖基化修飾肽段。通過質(zhì)譜鑒定分析,在3次重復實驗中成功富集鑒定到157條O-GlcNAc修飾肽段,歸屬于130個蛋白質(zhì)。進一步的基因本體分析顯示(見圖5),富集的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白主要分布于突觸后密度、細胞質(zhì)以及核染色體,主要參與細胞分裂、興奮性突觸后電位及微管運動等通路。其中,與轉(zhuǎn)移酶活性、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性以及微管結(jié)合等功能相關(guān)的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白被顯著富集,與文獻[8,24,25]相符。以上結(jié)果表明,O-GlcNAc糖基化修飾蛋白廣泛分布于細胞不同區(qū)室,在機體的多項生命活動中發(fā)揮著重要作用。

    圖 5 O-GlcNAc糖基化修飾蛋白的基因本體分析Fig. 5 Gene ontology analysis of O-GlcNAcylation proteinsP-value: significance level of enrichment.

    3 結(jié)論

    本研究發(fā)展了MSH特異性氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法,在保護O-GlcNAc糖基化修飾肽段的同時,特異性消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。MSH氧化消除法操作簡單,反應高效。該方法被成功應用于消除Ac4GalNAz代謝Hela細胞中產(chǎn)生的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物,最終在Hela細胞核質(zhì)蛋白中成功富集鑒定到157條O-GlcNAc修飾肽段,歸屬于130個蛋白質(zhì),并通過基因本體分析獲取了O-GlcNAc糖基化修飾蛋白潛在的生物學功能。本研究成功消除了全乙酰化非天然單糖細胞代謝產(chǎn)物中的副產(chǎn)物,去除了其對O-GlcNAc糖基化修飾肽段富集鑒定的干擾,實現(xiàn)了細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的精準富集鑒定,為非天然糖代謝標記技術(shù)在糖蛋白組學分析中的應用提供了新的研究策略。

    猜你喜歡
    疊氮人為巰基
    降低乏燃料后處理工藝中HN3 含量的方法研究
    山高人為峰
    兩種不同結(jié)構(gòu)納米疊氮化銅的含能特性研究
    火工品(2018年1期)2018-05-03 02:27:56
    齊多夫定生產(chǎn)中疊氮化工藝優(yōu)化
    源正泉自清 山高人為峰
    中國篆刻(2017年5期)2017-07-18 11:09:30
    3-疊氮基丙基-β-D-吡喃半乳糖苷的合成工藝改進
    合成化學(2015年9期)2016-01-17 08:57:14
    巰基-端烯/炔點擊反應合成棒狀液晶化合物
    海洋中β-二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽降解過程的研究進展
    山高人為峰
    詩歌月刊(2014年1期)2014-03-11 17:26:03
    巰基和疏水性對蛋白質(zhì)乳化及凝膠特性的影響
    食品科學(2013年23期)2013-03-11 18:30:02
    亚洲精华国产精华液的使用体验| 韩国av在线不卡| 国产精品一二三区在线看| 欧美潮喷喷水| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 97在线视频观看| 亚洲天堂av无毛| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 三级经典国产精品| 18+在线观看网站| 国产色婷婷99| 午夜精品国产一区二区电影 | videossex国产| 婷婷色av中文字幕| 青春草视频在线免费观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲最大成人中文| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 秋霞在线观看毛片| 日本三级黄在线观看| 高清毛片免费看| 在线播放无遮挡| 国产欧美亚洲国产| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲图色成人| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品人妻熟女av久视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美成人a在线观看| av专区在线播放| 国产成人91sexporn| 国产色爽女视频免费观看| 黄片无遮挡物在线观看| 国产视频内射| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 麻豆久久精品国产亚洲av| www.av在线官网国产| 欧美最新免费一区二区三区| 日本熟妇午夜| kizo精华| 欧美潮喷喷水| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美97在线视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美成人精品欧美一级黄| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日本一本二区三区精品| 国产免费一级a男人的天堂| 日本与韩国留学比较| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 最后的刺客免费高清国语| 国产美女午夜福利| 午夜免费男女啪啪视频观看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲av男天堂| 春色校园在线视频观看| 国产91av在线免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品无大码| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩伦理黄色片| 国产精品一及| 亚洲精品视频女| 亚洲综合精品二区| 久久精品国产自在天天线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩大片免费观看网站| 国产在线一区二区三区精| 欧美精品一区二区大全| 大香蕉97超碰在线| 国产精品一区二区性色av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 乱码一卡2卡4卡精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 18禁动态无遮挡网站| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品国产亚洲网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人aa在线观看| 久久久久精品性色| 亚洲四区av| 亚洲在线观看片| 久久久久久久久久久免费av| 中文欧美无线码| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产成人91sexporn| 99九九线精品视频在线观看视频| 婷婷色综合www| 涩涩av久久男人的天堂| 黄色日韩在线| 成年女人看的毛片在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| av黄色大香蕉| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 婷婷色综合大香蕉| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产伦精品一区二区三区四那| 激情 狠狠 欧美| av在线亚洲专区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 在线观看人妻少妇| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产一区有黄有色的免费视频| av在线app专区| 欧美成人午夜免费资源| 国产 一区 欧美 日韩| 天堂网av新在线| 亚洲色图av天堂| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 久久久久精品性色| 成人欧美大片| 欧美日韩综合久久久久久| 精品人妻视频免费看| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲怡红院男人天堂| 久久久久久久精品精品| 中文在线观看免费www的网站| 国产成人精品福利久久| 久热这里只有精品99| 亚洲精品日本国产第一区| 国产欧美亚洲国产| 中文字幕免费在线视频6| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产精品.久久久| 男女国产视频网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美另类一区| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 午夜福利高清视频| 国产精品成人在线| 五月伊人婷婷丁香| 精品久久久久久久久亚洲| 男女国产视频网站| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲高清免费不卡视频| 插阴视频在线观看视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 免费看光身美女| 一区二区三区精品91| 久久久久久久精品精品| 亚洲不卡免费看| 免费av观看视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 少妇丰满av| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲成人av在线免费| 91久久精品电影网| 久久亚洲国产成人精品v| 在线 av 中文字幕| 美女内射精品一级片tv| 亚州av有码| 成年版毛片免费区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲无线观看免费| 禁无遮挡网站| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美+日韩+精品| 精品视频人人做人人爽| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99久久九九国产精品国产免费| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲三级黄色毛片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 一本一本综合久久| 午夜福利视频1000在线观看| 在线免费十八禁| 国产亚洲一区二区精品| 欧美成人一区二区免费高清观看| 99热这里只有是精品50| 在线天堂最新版资源| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 人妻系列 视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜福利高清视频| 视频区图区小说| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 插逼视频在线观看| 亚洲成人一二三区av| 有码 亚洲区| 欧美日韩综合久久久久久| 99久久精品国产国产毛片| 我要看日韩黄色一级片| 国产综合精华液| 精品久久久久久久末码| 欧美zozozo另类| 精品久久国产蜜桃| 日本爱情动作片www.在线观看| 一本久久精品| 国产视频内射| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美性感艳星| 91久久精品国产一区二区成人| 国产乱来视频区| 国产精品99久久久久久久久| 视频区图区小说| 六月丁香七月| 免费少妇av软件| 亚洲无线观看免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品国产露脸久久av麻豆| 九九在线视频观看精品| 日韩精品有码人妻一区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 乱系列少妇在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| av网站免费在线观看视频| 久久精品国产亚洲av天美| 各种免费的搞黄视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 新久久久久国产一级毛片| 国产69精品久久久久777片| 性色avwww在线观看| 国产精品一区www在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 国产成人精品一,二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 两个人的视频大全免费| 欧美日韩视频精品一区| 精品久久久久久电影网| 99热网站在线观看| 国产亚洲最大av| 一级毛片我不卡| 韩国av在线不卡| 欧美日韩亚洲高清精品| 观看免费一级毛片| 少妇人妻一区二区三区视频| 性色avwww在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 看黄色毛片网站| av在线亚洲专区| kizo精华| 国产在视频线精品| 香蕉精品网在线| 香蕉精品网在线| 国产亚洲精品久久久com| 黄色怎么调成土黄色| 国产av国产精品国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 观看免费一级毛片| 91狼人影院| 日韩强制内射视频| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品午夜福利在线看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 色5月婷婷丁香| 日韩在线高清观看一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 国产极品天堂在线| 97超视频在线观看视频| 免费大片18禁| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品456在线播放app| 日韩一区二区视频免费看| 联通29元200g的流量卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影| 国产人妻一区二区三区在| 欧美3d第一页| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲av免费在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲内射少妇av| 干丝袜人妻中文字幕| 人人妻人人看人人澡| 日韩伦理黄色片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 成年女人看的毛片在线观看| 国产亚洲最大av| 天堂网av新在线| 永久网站在线| 亚洲最大成人中文| 亚洲无线观看免费| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品嫩草影院av在线观看| 97热精品久久久久久| 中国国产av一级| 精品午夜福利在线看| 久久国产乱子免费精品| 日韩国内少妇激情av| 国产精品久久久久久精品电影小说 | xxx大片免费视频| av在线播放精品| 国产精品一二三区在线看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看人妻少妇| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产成人91sexporn| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲人与动物交配视频| 婷婷色av中文字幕| 女人被狂操c到高潮| 国产探花在线观看一区二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲精品aⅴ在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 精品少妇久久久久久888优播| 观看免费一级毛片| 边亲边吃奶的免费视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 一级av片app| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产亚洲91精品色在线| 中文字幕免费在线视频6| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美性感艳星| tube8黄色片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美少妇被猛烈插入视频| 中文在线观看免费www的网站| 久久久午夜欧美精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久久久精品精品| 舔av片在线| 亚洲国产精品专区欧美| freevideosex欧美| 日韩视频在线欧美| 中文字幕制服av| 日本爱情动作片www.在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲av成人精品一二三区| 91久久精品国产一区二区成人| 香蕉精品网在线| 国产精品久久久久久久久免| 美女高潮的动态| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产有黄有色有爽视频| 免费观看a级毛片全部| 久久精品综合一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 亚洲内射少妇av| 69av精品久久久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲国产精品999| 国产成人免费观看mmmm| 青青草视频在线视频观看| 国产乱人偷精品视频| 亚洲真实伦在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 日韩免费高清中文字幕av| 在线播放无遮挡| 免费av毛片视频| 国产乱人偷精品视频| 国产黄频视频在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 91狼人影院| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲天堂av无毛| 精品久久久精品久久久| 国产在视频线精品| 久久久久性生活片| 性色av一级| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲av日韩在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 色视频www国产| 免费黄频网站在线观看国产| 成年女人看的毛片在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 99九九线精品视频在线观看视频| 人妻系列 视频| 18+在线观看网站| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美激情在线99| 成年人午夜在线观看视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| av卡一久久| 99久久精品国产国产毛片| 黄色欧美视频在线观看| 久久精品人妻少妇| 禁无遮挡网站| 热re99久久精品国产66热6| 日本免费在线观看一区| 久久久久久久精品精品| 另类亚洲欧美激情| 亚洲av福利一区| 男人和女人高潮做爰伦理| 黄色配什么色好看| 又大又黄又爽视频免费| 69av精品久久久久久| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲欧美成人精品一区二区| 麻豆成人av视频| 少妇的逼水好多| 日韩视频在线欧美| 男女无遮挡免费网站观看| 国产成人a区在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本一本二区三区精品| 久久久久久久久久久丰满| 51国产日韩欧美| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲av不卡在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 永久免费av网站大全| 中国国产av一级| 亚洲成人一二三区av| 国产在线男女| 久久久午夜欧美精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 少妇的逼水好多| 精华霜和精华液先用哪个| 丝袜美腿在线中文| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久久久国产网址| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 超碰97精品在线观看| 永久免费av网站大全| 69av精品久久久久久| 久久久a久久爽久久v久久| 中文天堂在线官网| 性色avwww在线观看| 看十八女毛片水多多多| 精品国产乱码久久久久久小说| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品国产三级专区第一集| 黄色怎么调成土黄色| 免费在线观看成人毛片| 18+在线观看网站| 边亲边吃奶的免费视频| 美女国产视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 国产在视频线精品| 在线免费十八禁| 少妇熟女欧美另类| 大片免费播放器 马上看| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 99久久九九国产精品国产免费| 精品人妻视频免费看| av在线播放精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 精品人妻视频免费看| 欧美成人a在线观看| 免费观看av网站的网址| 综合色丁香网| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 欧美高清成人免费视频www| 毛片女人毛片| 禁无遮挡网站| 特级一级黄色大片| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美另类一区| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲天堂av无毛| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产午夜精品一二区理论片| 26uuu在线亚洲综合色| 高清欧美精品videossex| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一边亲一边摸免费视频| 91精品国产九色| 最新中文字幕久久久久| 美女内射精品一级片tv| 国产欧美亚洲国产| 日韩大片免费观看网站| 老司机影院成人| 国产淫语在线视频| 欧美国产精品一级二级三级 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲伊人久久精品综合| 色吧在线观看| 简卡轻食公司| 国产精品.久久久| 国产精品一及| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 尾随美女入室| 永久免费av网站大全| 三级国产精品欧美在线观看| 97超碰精品成人国产| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国内精品宾馆在线| 丝袜喷水一区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 水蜜桃什么品种好| 黄色欧美视频在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 成人二区视频| 久久99蜜桃精品久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧洲国产日韩| 老司机影院成人| 久久人人爽人人片av| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久亚洲精品成人影院| 一边亲一边摸免费视频| 国产片特级美女逼逼视频| 国产毛片在线视频| 两个人的视频大全免费| 国产爱豆传媒在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 少妇人妻 视频| 国产精品女同一区二区软件| 国产综合懂色| 日韩欧美精品v在线| 黑人高潮一二区| 久久久色成人| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产黄片美女视频| 亚洲国产欧美人成| 少妇 在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 爱豆传媒免费全集在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费少妇av软件| 五月开心婷婷网| 亚洲欧美精品专区久久| 国产av国产精品国产| 丝瓜视频免费看黄片| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品久久久久久久久av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 寂寞人妻少妇视频99o| 99九九线精品视频在线观看视频| 一级爰片在线观看| av播播在线观看一区| 下体分泌物呈黄色| 日韩电影二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产淫片久久久久久久久| 女人被狂操c到高潮| 伦精品一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产高清三级在线| 日韩伦理黄色片| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 色视频在线一区二区三区| 国产一级毛片在线| 欧美+日韩+精品| 国产精品av视频在线免费观看| 简卡轻食公司| 中文字幕制服av| 青春草视频在线免费观看| 特级一级黄色大片| 国产一区二区在线观看日韩| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品一区蜜桃| 欧美日韩在线观看h| 欧美精品国产亚洲| 婷婷色av中文字幕| 精品视频人人做人人爽| 不卡视频在线观看欧美| 一级毛片电影观看| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日韩成人av中文字幕在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美成人一区二区免费高清观看| 午夜精品一区二区三区免费看| av在线观看视频网站免费| 亚洲综合精品二区| 国产欧美亚洲国产| 麻豆国产97在线/欧美| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 老司机影院毛片| 亚洲最大成人av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美精品国产亚洲| a级毛色黄片| 国产成人免费观看mmmm| 国产人妻一区二区三区在|