1例豬偽狂犬病病毒的分離與鑒定

顏友榮 方向紅 王琳琳

江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（pseudorabies vi?rus，PRV）引起的一種重要傳染病，以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的一種重要傳染病[1]。近年來，我國許多省份的養(yǎng)豬場都出現(xiàn)了偽狂犬病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。為了了解偽狂犬病的感染情況，筆者從江蘇省某豬場采集疑似病料，并對其進(jìn)行病毒分離與鑒定，從而判斷是否為偽狂犬病，以期為豬場控制偽狂犬病提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）病料與實(shí)驗(yàn)動物。從江蘇某豬場采集疑似感染偽狂犬病的病料，如腦、肺臟、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)等，-20°C 保存?zhèn)溆茫粚?shí)驗(yàn)動物為家兔，購自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)中心；3 只健康家兔。

2）主要試劑。LA Taq DNA 聚合酶，dNTP mix，2×GC Buffer I，DL 5000 DNA Marker 等，購于寶生物工程（大連）有限公司；偽狂犬-SD 株由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；其他各種實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純試劑。

1.2 方 法

1）病料處理。將無菌采集的病料組織研磨，用0.01 mol/L、pH7.4 PBS 按照體積比制成1∶5 組織懸液，加入適量青霉素、鏈霉素處理后，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清液，置于–20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2）病毒提取與PCR 擴(kuò)增。取經(jīng)處理過的病料上清液與對照偽狂犬-SD株，按照TaKaRa試劑盒說明書操作方法進(jìn)行病毒提取，提取液-20 ℃貯存?zhèn)溆?。PCR 擴(kuò)增以提取液作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物（P1）：5’-CCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3’，下游引物（P2）：5’-CGGGGCGGGACATCAACAG?GC-3’，擴(kuò)增片段大小為1 737 bp，引物由上海英駿生物工程有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系（50μL）：DNA 模板5μL，5 U/μL LA Taq 酶0.5 μL，2×GC Buffer I 25 μL，100 μmol/L dNTP 8 μL，PRV-P1 1 μL，PRV-P2 1μL，2 mmol/L MgCl26μL，ddH2O 3.5μL。

PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃預(yù)變性1 min，64 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，最后4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物，溴化乙錠染色，用1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，紫外燈光下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

3）間接免疫熒光法。為了方便驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性對照與陰性對照，病毒液接種細(xì)胞選用的是BHK-21 細(xì)胞即乳倉鼠腎細(xì)胞，具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下[3]。

預(yù)先制備好含有生長良好的單層BHK-21細(xì)胞腔式載玻片，分別加入疑似偽狂犬病毒液和偽狂犬-SD 株病毒液各1 mL，標(biāo)注記號，37 ℃溫箱作用1 h后，吸掉病毒液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄掉維持液，用PBS洗3次，固定載玻片上的細(xì)胞培養(yǎng)物，用PBS 洗滌3 次，加入500μL 1∶100 稀釋的豬偽狂犬陽性血清，37 ℃孵育1 h；用PBS洗滌3次后，加入500 μL 1∶2 000 稀釋的山羊抗豚鼠-FITC，37 ℃孵育30 min；最后用PBS 洗滌3次，再用0.2μg/mL DAPI 染色液染色后，置于熒光顯微鏡下觀察。同時設(shè)置細(xì)胞培養(yǎng)物作陰性對照。

4）動物接種試驗(yàn)。本次試驗(yàn)選擇易感動物家兔，接種試驗(yàn)前先取3只大小、體重相似的健康家兔飼養(yǎng)2 d，觀察家兔是否有異常。若無異常，給3只家兔后頸部皮下分別注射分離的病毒培養(yǎng)液、對照用的偽狂犬-SD株培養(yǎng)液及生理鹽水各2 mL，觀察家兔接種后的臨床癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對家兔飼養(yǎng)場地進(jìn)行嚴(yán)格消毒，對發(fā)病死亡的家兔進(jìn)行無害化處理。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1 所示，疑似偽狂犬病毒分離株與對照偽狂犬-SD 株都有特異性片段，長度約為1 700 bp，與實(shí)驗(yàn)預(yù)測結(jié)果相同。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 間接免疫熒光檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2所示。圖2 中A 為疑似偽狂犬分離株，B 為偽狂犬-SD 株，二者均能觀察到明亮的黃綠色熒光；C為細(xì)胞對照，沒有觀察到黃綠色熒光。A 為疑似偽狂犬分離株，能與偽狂犬病毒陽性血清結(jié)合，與山羊抗豚鼠-FITC 發(fā)生特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下能與陽性對照B 觀察到同樣的結(jié)果。結(jié)果表明，分離到的疑似偽狂犬分離株就是豬偽狂犬病毒。

圖2 病毒分離株與陽性血清間接免疫熒光檢測

2.3 動物接種試驗(yàn)結(jié)果

接種分離的病毒培養(yǎng)液及對照用的偽狂犬-SD株培養(yǎng)液，24 h 后家兔出現(xiàn)興奮不安、食欲下降；40 h 后出現(xiàn)舌舔、嘴啃、抓撓等明顯的瘙癢癥狀，隨后家兔出現(xiàn)呼吸急促，體溫升高，接種部位被毛脫落、出血、皮膚潮紅，肌肉暴露；48 h 左右四肢出現(xiàn)麻痹、角弓反張、抽搐直至死亡，如圖3 所示。注射生理鹽水的家兔不表現(xiàn)臨床癥狀。試驗(yàn)結(jié)果說明分離毒株對家兔有明顯的致病性，表現(xiàn)出類似的偽狂犬病癥狀。

圖3 試驗(yàn)組家兔

3 討 論

1）本研究通過從江蘇某豬場一疑似病例分離出一株病毒，經(jīng)PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)、易感動物接種實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光鑒定及血清中和試驗(yàn)等證明分離株是偽狂犬毒株，說明該豬場母豬流產(chǎn)、仔豬死亡等很可能是豬偽狂犬病病毒感染造成的［4］。

2）偽狂犬病在我國大部分接種Bartha-K61 疫苗免疫的豬場中散發(fā)或廣泛流行，而且動物一旦感染，可終身帶毒、難以根除，說明傳統(tǒng)疫苗保護(hù)效率低，疫病難以防控，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已引起廣大養(yǎng)殖戶的高度重視［5］。