冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水微生物群落組成及其功能預(yù)測(cè)

趙佳怡, 甄世軍, 張翠云, 殷密英, 張 勝

中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所, 河北石家莊 050061;中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局/河北省地下水污染機(jī)理與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北石家莊 050061

越來(lái)越多的研究揭示地下深部存在各種微生物, 構(gòu)成一個(gè)深部生物圈(Colman et al., 2017;Escudero et al., 2018), 深部微生物在全球生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。地下深部是一個(gè)陽(yáng)光照射不到、沒(méi)有光合作用的黑暗環(huán)境, 在地表1 km以下常常是高溫、高壓、高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)的極端環(huán)境,能夠適應(yīng)這種極端環(huán)境的微生物具有獨(dú)特的組成和功能, 這種極端環(huán)境與地球早期和其他星球環(huán)境相類似。深入了解深部微生物群落組成和功能特性,對(duì)探索早期生命的起源、生理極限、適應(yīng)機(jī)制和利用其獨(dú)特功能均有重要意義(董海良等, 2009)。

早期采用培養(yǎng)法檢測(cè)深部微生物(Hallbeck and Pedersen, 2008), 但是自然界大部分微生物是不可培養(yǎng)的, 培養(yǎng)法只能檢出部分微生物?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù), 特別是 16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)不但可檢測(cè)可培養(yǎng)菌, 而且還可檢測(cè)不可培養(yǎng)菌, 近年來(lái)已應(yīng)用于地下深部微生物檢測(cè)(Nyyss?nen et al.,2014; Lau et al., 2014; Dutta et al., 2018)。宏基因組測(cè)序技術(shù)可檢出微生物的所有功能基因, 推測(cè)碳、氮、硫循環(huán)過(guò)程中的微生物代謝途徑, 但是該技術(shù)所需樣品量大, 深部樣品微生物含量低, 一些樣品不能滿足樣品量要求。新一代生物信息技術(shù), 可利用 PICRUSt軟件(Langille et al., 2013), 通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果與已知基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 進(jìn)行微生物群落功能預(yù)測(cè)(Bomberg et al., 2016;Chiriac et al., 2018)。地下深部地質(zhì)環(huán)境復(fù)雜多樣,深部微生物群落特征受地質(zhì)水文地質(zhì)條件的控制,已有的研究只涉及其中很少一部分, 地?zé)釁^(qū)深部碳酸鹽巖巖溶-裂隙熱儲(chǔ)環(huán)境中微生物群落組成和功能特性仍然不清。

冀中地?zé)釁^(qū)地?zé)崮荛_(kāi)發(fā)歷史悠久, 目前主要開(kāi)采 1800 m以上薊縣系霧迷山組上段碳酸鹽巖巖溶-裂隙熱儲(chǔ)熱水, 而對(duì)1800 m以下薊縣系霧迷山組下段和高于莊組碳酸鹽巖巖溶-裂隙熱儲(chǔ)地?zé)豳Y源狀況不清。中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局自2018年以來(lái)在冀中地?zé)釁^(qū)實(shí)施了一批地?zé)峥茖W(xué)鉆探, 用于獲取深部熱儲(chǔ)的地質(zhì)、水文地質(zhì)和地?zé)峄A(chǔ)數(shù)據(jù), 評(píng)價(jià)深部新儲(chǔ)層地?zé)豳Y源(王貴玲等, 2018)。地?zé)峥茖W(xué)鉆探為深部熱水微生物研究提供了獲取深部樣品的機(jī)會(huì), 我們選取了部分鉆孔用于深部熱水微生物群落研究。前期工作建立了深部熱水硫酸鹽還原菌微滴數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù), 并利用該技術(shù)對(duì)深部熱水、淺層水和土壤進(jìn)行了檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)深部熱水富含硫酸鹽還原菌(趙佳怡等,2020)。在此基礎(chǔ)上, 本次研究繼續(xù)以冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水為研究對(duì)象, 采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)和功能預(yù)測(cè)技術(shù), 以淺層水和土壤為參照, 研究深部熱水微生物群落組成和功能特性, 為提高深部生物圈認(rèn)識(shí)和深部熱水合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預(yù)處理

冀中地?zé)釁^(qū)(115°55′46″E, 38°58′45″N)位于河北平原冀中凹陷中部, 區(qū)內(nèi)構(gòu)造斷裂發(fā)育, 基底凹凸相間, 其中牛頭鎮(zhèn)凸起、容城凸起和高陽(yáng)低凸起地?zé)豳Y源豐富, 埋藏淺, 水溫高, 水量大, 地?zé)峥茖W(xué)鉆探孔均位于這些基巖凸起區(qū)。本次研究6組深部熱水樣(E1-1, E3-1-E7-1)分別采自冀中地?zé)釁^(qū)地?zé)峥茖W(xué)鉆探孔抽水試驗(yàn)時(shí)最后階段的抽出水, 井臺(tái)泵口取樣, 同時(shí)采集每個(gè)鉆孔附近大田農(nóng)灌井淺層水(E1-2, E3-2-E7-2)和土壤(E1-3, E3-3-E7-3)樣品各6組作為參照, 共計(jì)18組樣品用于微生物分析。地?zé)峥茖W(xué)鉆探孔深變化于 2506—3853 m 之間, 抽水試驗(yàn)出水層段為薊縣系霧迷山組或高于莊組碳酸鹽巖基巖熱儲(chǔ)層, 采樣深度1500—3853 m。淺層水井深變化于 70—120 m 之間, 土樣采集深度均為0.5 m。采樣點(diǎn)分布如圖 1所示。水樣采集容器為18 L耐高溫的無(wú)菌塑料桶, 采集時(shí)利用哈希便攜式測(cè)試儀進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試, 測(cè)試項(xiàng)目為pH、溫度T和總?cè)芙夤腆wTDS。水樣運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行抽濾預(yù)處理,按4 L水樣過(guò)濾到孔徑為0.22 μm的多片聚四氟乙烯濾膜上, 將帶有過(guò)濾物的濾膜置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中–70℃冰箱保存。土樣采集使用洛陽(yáng)鏟取芯, 采用無(wú)菌小刀從巖芯中部挖取土樣, 裝入無(wú)菌塑料袋, 現(xiàn)場(chǎng)冰塊保溫箱保存, 運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后–70℃冰箱保存?zhèn)溆?。土樣現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試指標(biāo), 采用土水體積比1:2.5水溶液測(cè)試。

圖1 研究區(qū)采樣點(diǎn)圖Fig.1 Sampling sites of the study area

1.2 高通量測(cè)序

深部熱水和淺層水的過(guò)濾膜及土壤樣品, 送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rRNA基因高通量測(cè)序。采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek, USA), 按說(shuō)明書(shū)提取水土樣品微生物總 DNA。通過(guò) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性, 使用NanoDrop2000測(cè)定DNA濃度和純度, 其中深部熱水 DNA 濃度變化于9.00～71.70 ng/μL。通過(guò) Illumina Miseq PE250測(cè)序平臺(tái), 使用細(xì)菌古菌通用引物:515FmodF(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')(Parada et al., 2016)和806RmodR(5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') (Apprill et al., 2015)對(duì)16S rRNA基因 V4區(qū)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增儀為ABI GeneAmp? 9700型 PCR儀, DNA聚合酶為TransStart?Fastpfu DNA Polymerase (TransGen,北京), 20 μL PCR 反應(yīng)體系: 5 × FastPfu Buffer 4 μL;2.5 mM dNTPs 2 μL; 前后引物(5 μM)各 0.8 μL;FastPfu DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.4 μL; Template DNA 10 ng; ddH2O 補(bǔ)足 20 μL。先預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最小循環(huán)數(shù), 最終 PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃3 min; 95℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 45 s, 29 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min, 10℃保育無(wú)窮。每樣設(shè)置三個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物取3 μL于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確, 濃度合適者,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物, 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)純化, 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用 Quantus? Fluorometer (Promega, USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit試劑盒建立 MiSeq文庫(kù)。利用 Illumina公司的Miseq PE250平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將高通量測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù), 使用 Fastp和Flash軟件進(jìn)行質(zhì)控, 去掉低質(zhì)量序列, 獲得優(yōu)化序列。使用 Usearch軟件, 根據(jù) 97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行分類最小單元 OTU(Operational Taxonomic Units)聚類并剔除嵌合體。使用RDP classifier 軟件對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為Silva 132/ 16S, 比對(duì)閾值為70%, 并按照最小樣品序列數(shù)進(jìn)行抽平處理, 分別在各個(gè)分類學(xué)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落物種組成。

利用Mothur軟件計(jì)算抽平后樣品OTU水平的Alpha 多樣性指數(shù) sobs、chao、ace、shannon、simpson和 Coverage, 并使用 Student's-t方法檢驗(yàn)組間顯著性差異。依據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果, 采用 Excel分別進(jìn)行深部熱水、淺層水和土壤門和屬水平平均相對(duì)豐度大小排序, 利用 R語(yǔ)言分別繪制各樣品門(≥1%)和屬(≥5%)水平類群相對(duì)豐度柱狀圖。采用克氏秩和檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H test方法, fdr多重檢驗(yàn)校正,對(duì)多組樣品的物種進(jìn)行顯著性差異分析。使用PICRUSt2軟件對(duì)樣品中微生物群落的功能組成進(jìn)行預(yù)測(cè), 從KEGG功能模塊Module挑選出與C、N、S循環(huán)相關(guān)的關(guān)鍵功能基因模塊, 利用Excel繪制功能模塊相對(duì)豐度條形圖, 并進(jìn)行組間顯著性差異單因素方差統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。除了 Excel分析外, 上述所有分析均在美吉生物云平臺(tái)上操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試和高通量測(cè)序結(jié)果評(píng)估

冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水、淺層水和土壤的pH、溫度T和總?cè)芙夤腆wTDS現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試結(jié)果如表1所示?，F(xiàn)場(chǎng)測(cè)試和組間顯著性差異單因素方差統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果是, 深部熱水pH值變化于6.77～8.75之間, 屬中性及弱堿性水,其pH值與淺層水(7.50～7.87)相近(P＞0.05),而較土壤浸提液(8.55～8.94)顯著低(P＜0.01)。深部熱水 T變化于 56～105℃之間, 屬中低溫?zé)崴? 極顯著高于淺層水(13～17℃)和土壤(8～13℃)(P＜0.001)。深部熱水TDS變化于1990～2677 mg/L之間, 屬微咸水, 其TDS也極顯著高于淺層水(202～503 mg/L)和土壤浸提液(72～178 mg/L)(P＜0.001)。由此可見(jiàn), 本區(qū)深部熱水以溫度和鹽度高而顯著區(qū)別于淺層水和土壤。

18個(gè)樣品高通量測(cè)序, 獲得原始序列2 560 782條, 經(jīng)質(zhì)控過(guò)濾后, 獲優(yōu)化序列1 146 829條, 又去單序列和嵌合體, 獲有效序列362 386條, 以最小樣本序列數(shù)46 740抽平, 以97%相似水平下聚類劃分分類單元 OTU, 產(chǎn)生 1131個(gè)OTU。各樣品有效序列和OTU見(jiàn)表1。樣品的群落覆蓋度Coverage很高, 均大于98%(表2), 說(shuō)明本次測(cè)序量代表了樣品微生物的真實(shí)情況。

表1 深部熱水、淺層水和土壤樣品現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試和高通量測(cè)序結(jié)果Table 1 Results of field measurement and high-through sequencing from deep geothermal water, shallow water and soil

2.2 深部熱水微生物多樣性分析

微生物群落豐富性采用Sobs、Chao1和Ace指數(shù)表示, 數(shù)值越大, 豐富性越高; 微生物群落多樣性用Shannon和Simpson指數(shù)表示, 前者數(shù)值越大,多樣性越高, 而后者則相反。多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果如表2所示。顯著性差異檢驗(yàn)結(jié)果是, 深部熱水的豐富性指數(shù)Sobs、Ace和Chao均低于淺層水(P＜0.05)和土壤(P＜0.001), 說(shuō)明深部熱水的微生物豐富性低于淺層水, 極顯著低于土壤。深部熱水的多樣性指數(shù)Shannon低于淺層水(P＜0.05)和土壤(P＜0.001), 而Simpson高于淺層水(P＜0.05)和土壤(P＜0.001), 均說(shuō)明深部熱水的微生物多樣性低于淺層水(P＜0.05),極顯著低于土壤(P＜0.001)。

表2 冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水、淺層水和土壤樣品α多樣性指數(shù)Table 2 Alpha-diversity indices of deep geothermal water, shallow water and soil samples from Jizhong geothermal area

2.3 深部熱水的微生物群落組成特征

本次高通量測(cè)序引物為細(xì)菌古菌通用引物, 測(cè)序結(jié)果為細(xì)菌古菌有關(guān)序列。18個(gè)樣品的高通量測(cè)序結(jié)果共檢出生物域3個(gè), 門62個(gè), 屬1280個(gè), 種2494個(gè), 其中深部熱水細(xì)菌(6個(gè)樣品均值百分?jǐn)?shù),97.5%), 古菌(2.5%); 淺層水細(xì)菌(96.4%), 古菌(3.6%); 土壤細(xì)菌(90.9%), 古菌(9.1%)。

2.3.1 門水平和屬水平組成特征

深部熱水6個(gè)樣品平均相對(duì)豐度≥1%的門水平優(yōu)勢(shì)群落是厚壁菌門Firmicutes (38%), 變形菌門Proteobacteria (37%), 硝化螺旋菌門Nitrospirae(13%), 廣古菌門Euryarchaeota (2%), 產(chǎn)水菌門Aquificae (2%), 熱袍菌門Thermotogae (2%)、擬桿菌門Bacteroidetes (1%)、綠彎菌門Chlorofexi (1%)和異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus (1%), 其中厚壁菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria的相對(duì)豐度大, 前者主要分布于樣品E1-1、E3-1、E4-1、E5-1, 而后者主要分布于樣品E3-1、E6-1、E7-1(圖2A)。淺層水最豐富的類群是變形菌門Proteobacteria(61%), 其次是擬桿菌門Bacteroidetes (13%), 而厚壁菌門Firmicutes很少(1%), 古菌主要是奇古菌門Thaumarchaeots(1%)。土壤最豐富的類群主要是放線菌門Actinobacteria (28%), 其次是變形菌門Proteobacteria (18%), 厚壁菌門Firmicutes較豐富(10%), 古菌主要也是奇古菌門Thaumarchaeots(9%)。由此可見(jiàn), 本區(qū)深部熱水門水平優(yōu)勢(shì)類群與淺層水和土壤不盡相同。經(jīng)分組樣品ANOSIM統(tǒng)計(jì)分析檢驗(yàn), 深部熱水與淺層水微生物群落結(jié)構(gòu)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05), 與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異更顯著(P＜0.01)。

深部熱水平均相對(duì)豐度≥5%的屬水平優(yōu)勢(shì)群落是硝化螺旋菌門Nitrospirae 成員熱脫硫弧菌屬Thermodesulfonbrio(13%), γ-變形菌綱成員假單胞菌屬Pseudomonas(10%)、磂豆菌屬Thiofaba(5%)和嗜氫菌屬Hydrogenophilus(6%), δ-變形菌綱成員熱脫硫桿菌屬Thermodesulfobacterium(9%), 厚壁菌門成員嗜熱厭氧菌科Thermoanaerobacteraceae (8%)和鈣雙螺桿菌屬Caldicoprobacters(6%), 古菌最豐富的菌屬是嗜熱彎曲甲烷熱桿菌屬M(fèi)ethanothermobacter(2%)。這些菌屬在各樣品的分布不均(圖2B), 其中熱脫硫弧菌屬Thermodesulfonbrio主要分布于E4-1和E5-1, 假單胞菌屬Pseudomonas主要分布于E7-1、熱脫硫桿菌屬Thermodesulfobacterium主要分布于E7-1, 屬未定名的嗜熱厭氧菌科Thermoanaerobacteraceae主要分布于E4-1, 磂豆菌屬Thiofaba主要分布于E6-1, 嗜熱彎曲甲烷熱桿菌屬M(fèi)ethanothermobacter主要分布于E5-1和E6-1。

圖2 冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水、淺層水和土壤各樣品門(A)和屬(B)水平微生物群落組成柱狀圖Fig.2 Compositional columnar section of microbial communities at phylum (A) and genus (B) level in deep geothermal water, shallow water and soil samples from Jizhong geothermal area

另外, 深部熱水的優(yōu)勢(shì)菌屬包括硫酸鹽還原菌,如熱脫硫弧菌屬Thermodesulfovibrio、熱脫硫桿菌屬Thermodesulfobacterium、嗜熱厭氧菌科Thermoanaerobacteraceae、脫硫化小幡菌屬Desulfovirgula和脫硫腸狀菌屬desulfotomaculum等,這些菌的存在有利于發(fā)生較強(qiáng)的硫酸鹽還原作用。

2.3.2 組間差異分析

通過(guò)克氏秩和方法(Kruskal-Wallis H test)進(jìn)一步檢驗(yàn)組間菌群結(jié)構(gòu)差異顯著性。深部熱水、淺層水和土壤間菌門和菌屬相對(duì)豐度差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示, 在門水平, 厚壁菌門Firmicutes、硝化螺旋菌門Nitrospirae、廣古菌門Euryarchaeota、產(chǎn)水菌門Aquificae和熱袍菌門Thermotogae在深部熱水中相對(duì)豐度高, 但是只有厚壁菌門Firmicutes、廣古菌門Euryarchaeota和熱袍菌門Thermotogae組間相對(duì)豐度差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)(圖3A), 說(shuō)明這些菌門是深部熱水的特征性菌門; 在屬水平上, 硝化螺旋菌門Nitrospirae 的熱脫硫弧菌屬Thermodesulfovibrio、γ-變形菌綱的假單胞菌屬Pseudomonas、嗜氫菌屬Hydrogenophilus和磂豆菌屬Thiofaba、δ-變形菌綱的熱脫硫桿菌屬Thermodesulfobacterium、厚壁菌門的嗜熱厭氧菌科Thermoanaerobacteraceae、鈣雙螺桿菌目Caldicoprobacters和磂豆菌屬Thiofaba在深部熱水中相對(duì)豐度高, 但是只有熱脫硫弧菌屬Thermodesulfovibrio、屬未定名的嗜熱厭氧菌科Thermoanaerobacteraceae、嗜氫菌屬Hydrogenophilus和屬未定名的鈣雙螺桿菌目Caldicoprobacters組間相對(duì)豐度差異顯著(P＜0.05 或P＜0.01)(圖 3B),說(shuō)明深部熱水特征性菌屬是熱脫硫弧菌屬Thermodesulfovibrio、屬未定名的嗜熱厭氧菌科Thermoanaerobacteraceae、嗜氫菌屬Hydrogenophilus和屬未定名的鈣雙螺桿菌目Caldicoprobacters。

圖3 冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水、淺層水和土壤樣品門水平(A)和屬水平(B)微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析Fig.3 Kruskal-Wallis H test columnar section of microbial community structural difference at phylum level (A) and at genus level (B) among deep geothermal water, shallow water and soil samples from Jizhong geothermal area

2.4 深部熱水微生物群落功能預(yù)測(cè)

PICRUSt2軟件可將樣品OTU置于軟件已有的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中, 并與參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 獲得KEGG功能信息, 包括功能基因模塊Module、功能基因 KO信息及其在樣品中的相對(duì)豐度, 但是這種預(yù)測(cè)受到已知菌種、已知功能、參考數(shù)據(jù)庫(kù)是否充足、基因轉(zhuǎn)移等因素的影響, 預(yù)測(cè)的功能僅僅是一種潛在的、分子功能, 實(shí)際是否存在這些功能還需要通過(guò)宏基因組測(cè)序和功能表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證。碳氮硫循環(huán)相關(guān)的功能基因模塊組成和相對(duì)豐度結(jié)果(圖 4)及組間顯著性差異單因素方差檢驗(yàn)結(jié)果顯示,深部熱水中除個(gè)別樣品外, 還原性檸檬酸途徑Reductive citrate cycle(M00175)、還原性乙酰輔酶A途徑Reductive acetyl-CoA pathway(M00377)和異化硫酸鹽還原作用 Dissimilatory sulfate reduction(M00596)功能基因模塊相對(duì)豐度較高, 可能指示這些途徑和作用在深部熱水中較強(qiáng)。醋酸產(chǎn)甲烷作用基因模塊(M00357)和甲醇產(chǎn)甲烷作用基因模塊(M00356)相對(duì)豐度也較高, 但是產(chǎn)甲烷作用是由發(fā)酵細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌共同完成的, 而產(chǎn)甲烷古菌的關(guān)鍵功能基因 mcrA(K00399)在各樣品中相對(duì)豐度很低(＜1%), 可能指示深部熱水的產(chǎn)甲烷作用很弱。醋酸產(chǎn)甲烷作用基因模塊M00357和甲醇產(chǎn)甲烷作用基因模塊 M00356等相對(duì)豐度較高, 是發(fā)酵作用功能基因(如編碼ACSS酶的基因K01895、IdhA基因K00016、poxB基因K00156、ackA基因K00925和 pflD 基因 K00656)相對(duì)豐度較高(18%～40%)之故。因此, 深部熱水的發(fā)酵作用可能較強(qiáng), 而產(chǎn)甲烷作用可能很弱。與淺層水和土壤相比, 深部熱水的還原性檸檬酸途徑 Reductive citrate cycle(M00175)和還原性乙酰輔酶A途徑Reductive acetyl-CoA pathway(M00377)的基因模塊相對(duì)豐度較淺層水更高(P＜0.05), 而與土壤無(wú)顯著性差異(P＞0.05);深部熱水的異化硫酸鹽還原 Dissimilatory sulfate reduction(M00596)功能基因模塊相對(duì)豐度(最高達(dá)18%)(除樣品E6-1和 E7-1外)顯著高于淺層水和土壤(P＜0.05), 可能指示深部熱水的異化硫酸鹽還原作用較強(qiáng)。

圖4 冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水(A)、淺層水(B)和土壤(C)碳氮硫循環(huán)關(guān)鍵功能基因模塊相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of key functional gene modules of carbon (A), nitrogen (B) and sulfur (C) cycles in deep geothermal water, shallow water and soil from Jizhong geothermal area

綜上所述, 碳氮硫循環(huán)有關(guān)的關(guān)鍵功能基因模塊預(yù)測(cè)結(jié)果是, 冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水中除個(gè)別樣品外, 固碳作用、發(fā)酵作用和異化硫酸鹽還原作用可能較強(qiáng), 而反硝化作用和產(chǎn)甲烷作用可能很弱。

3 討論

本次研究的目的是采用高通量測(cè)序技術(shù)和功能預(yù)測(cè)技術(shù), 以淺層水和土壤為參照, 探索深部熱水的微生物群落結(jié)構(gòu)組成和功能特性。為了達(dá)到此目的, 首要任務(wù)是判別采集的深部熱水樣有無(wú)受到鉆井液的污染。本次地?zé)峥茖W(xué)鉆探設(shè)計(jì)要求, 鉆至深部基巖熱儲(chǔ)層時(shí)要改用清水鉆探, 以避免鉆井泥污染熱儲(chǔ)層; 另外, 抽水試驗(yàn)之前要洗井, 保證井凈水清, 流體中懸浮物含量小于1/2000質(zhì)量比。據(jù)研究, 當(dāng)抽出的水量超過(guò)50個(gè)鉆孔體積水量時(shí), 來(lái)自鉆井液的微生物污染可降至最低(Davidson et al.,2011)。本次采樣是抽水試驗(yàn)進(jìn)行了2～3天最后階段采樣, 此時(shí)抽出的水量已大大超過(guò)50個(gè)鉆孔體積水量。因此, 本次深部熱水微生物分析可不考慮來(lái)自鉆井液的污染。

深部熱水和土壤各自6個(gè)樣品的OTU數(shù)量均在同一數(shù)量級(jí), 而淺層水則不然, 其中E3-2和E6-2的OTU數(shù)量分別為112個(gè)和351個(gè), 僅為其它樣品的1/10(表1), 其原因可能是淺層水污染程度不同所致,E3-2和E6-2樣品井深60～70 m, 而其它樣品井深100～120 m, 由于含水層越淺, 越易受到污染, 污染越嚴(yán)重多樣性越低, 因此前者OTU數(shù)量低。

本區(qū)深部熱水域水平微生物組成主要是細(xì)菌(97.5%), 古菌很少(2.5%), 與本區(qū)70—120 m深的淺層水(細(xì)菌96.4%, 古菌3.6%)和0.5 m深的土壤(細(xì)菌90.9%, 古菌9.1%)域水平微生物組成相似; 也與印度西部科學(xué)深鉆獲得的玄武巖和花崗巖巖芯中的域水平微生物組成相近(細(xì)菌92.36%～99.36%, 古菌0.12%～6.33%)(Dutta et al., 2018), 但是與南非金礦2.8 km深的裂隙水和美國(guó)愛(ài)達(dá)荷州深部裂隙熱水域水平微生物組成差異大, 前者幾乎全是細(xì)菌(＞99%)(Chivian et al., 2008), 后者大部分是古菌(＞90%)(Chapelle et al., 2002)。微生物組成差異與當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件密切相關(guān)。另外, 本區(qū)古菌檢出種類較少, 可能與引物有關(guān), 本研究使用的引物對(duì)獲得的古菌通常較少。

本區(qū)深部熱水各樣品微生物組成分布不均, 尤其是采自3853 m深的E7-1樣品微生物組成與淺層水更相似(圖2A), 其原因可能是該樣品位于斷層附近,在大流量抽水條件下, 深部含水層通過(guò)斷裂得到淺層水補(bǔ)給所致, 而其溫度仍然很高(105℃), 可能是補(bǔ)給水通過(guò)深循環(huán)獲得熱能加熱的結(jié)果。

本區(qū)深部熱水最豐富的微生物群落是厚壁菌門Firmicutes, 主要分布于樣品E1-1、E3-1、E4-1和5-1, 而在淺層水和土壤, 尤其是淺層水中很少(圖2), 這個(gè)特點(diǎn)在其他一些研究場(chǎng)地也觀測(cè)到, 如在芬蘭深部基巖裂隙水中, 隨著深度的增加, 隸屬厚壁菌門Firmicutes的梭菌綱Clostridia的相對(duì)豐度增加, 在1400～1500 m深處該菌占76.5%(It?vaara et al.,2011)。盡管本區(qū)淺層水、土壤和深部熱水都存在厚壁菌門Firmicutes, 但是它們屬水平的優(yōu)勢(shì)菌不同。淺層水Firmicutes中最豐富的菌屬是八疊球菌屬Sporosarcina, 是嗜溫厭氧菌; 土壤Firmicutes的最豐富菌屬是桿菌Bacillus, 是嚴(yán)格需氧或兼性厭氧嗜溫菌。而深部熱水Firmicutes的優(yōu)勢(shì)菌屬種類多,主要是屬未定名的Thermoanaerobacteraceae菌科、Caldicoprobacter和Desulfovirgula, 其中菌科Thermoanaerobacteraceae和菌屬Caldicoprobacter均是一類嗜熱、化能異養(yǎng)厭氧菌, 能夠通過(guò)發(fā)酵作用將有機(jī)物分解為乙醇、醋酸等, 產(chǎn)生氫氣和二氧化碳, 這類菌最早分離于火山活動(dòng)和熱泉環(huán)境(Zeikus et al., 1979; Wiegel and Ljungdahl, 1981)。Desulfovirgula菌屬是一類嗜熱的硫酸鹽還原菌, 能夠以氫氣或有機(jī)物為電子供體, 硫及其化合物為電子受體, 產(chǎn)生硫化氫氣體, 其菌株已分離自礦井深部水熱活動(dòng)的黑色沉積物(Kaksonen et al., 2007)。由上可見(jiàn), 淺層水和土壤Firmicutes的優(yōu)勢(shì)菌屬均是嗜溫菌, 而深部熱水中Firmicutes的優(yōu)勢(shì)菌屬均是嗜熱、厭氧菌。

本區(qū)深部熱水次豐富的微生物群落是變形菌門Proteobacteria, 主要分布于E3-1、E6-1和E7-1樣品中(圖2A), 而該類群在淺層水和土壤, 尤其是淺層水中很豐富(61%)。但是它們的屬水平種類不盡相同。淺層水隸屬于Proteobacteria的優(yōu)勢(shì)菌屬種類較多, 最豐富的優(yōu)勢(shì)菌屬是γ-Proteobacteria成員中的屬未定名的Burkholderiaceae菌科, 其次是γ-Proteobacteria的Hydrogenphaga、Dechloromonas、Vogesella 和 Aeromonas, α-Proteobacteria 的Brevundimonas、Sphingomonas和屬未定名的Acetobacterales-incerfae-sedis, 這些菌均是嗜溫菌(＜45℃)。土壤中隸屬于Proteobacteria的優(yōu)勢(shì)菌屬種類少、含量低, 主要是α-Proteobacteria屬未定名的Geminicoccaceae菌科和δ-Proteobacteria的屬未定名的Bacteriap25菌科, 前者是專性好氧嗜溫菌, 后者是未培養(yǎng)菌。而深部熱水Proteobacteria的優(yōu)勢(shì)菌屬種類較多, 最豐富的是隸屬于γ-Proteobacteria的假單胞菌屬Pseudomonas, 主要分布于E7-1樣品中,該菌屬是革蘭氏陰性、好氧、嗜溫菌, 溫度范圍18～37℃, pH 6～10; 其次是隸屬于δ-Proteobacteria的硫酸鹽還原的熱脫硫桿菌屬Thermodesulfobacterium, 主要分布在E3-1樣品中,該菌屬菌株最早分離自火山活動(dòng)熱環(huán)境, 生長(zhǎng)溫度范圍是45～85℃, 最佳70℃, 為嗜熱硫酸鹽還原菌(Zeikus and Dawson, 1983)。第三豐富的是隸屬于γ-Proteobacteria的Hydrogenophilus、Thiofaba和Burkholderiaceae, 主要分布于E6-1和E7-1, 其中Hydrogenophilus是嚴(yán)格好氧的嗜熱菌; 硫氧化菌屬Thiofaba 是一類專性化能自養(yǎng)、硫氧化菌, 其菌株分離于日本溫泉, 最佳生長(zhǎng)溫度是45℃, 以硫代硫酸鹽、硫和硫化氫為電子供體, CO2為碳源, 將低價(jià)硫氧化為高價(jià)硫(Mori and Suzuki, 2008); 伯克霍爾德菌屬Burkholderiaceae也是專性需氧嗜溫菌, 廣泛分布于土壤和水環(huán)境中, 生長(zhǎng)溫度30～37℃。由此可見(jiàn), 深部熱水隸屬于Proteobacteria菌門的各菌屬種類與淺層水和土壤的不同, 但是大部分菌屬是好氧嗜溫菌, 相似于土壤和淺層水。采自E6-1和E7-1鉆孔的深部熱水, 出現(xiàn)好氧嗜溫菌可能是大流量抽水條件下, 深部熱水得到淺層水的補(bǔ)給所致。相似地,Hubalek等人研究結(jié)果是, 深至455 m含水層微生物多樣性取決于深層水與淺層水的連通程度(Hubalek et al., 2016)。Chiriac et al.(2018)認(rèn)為, 深部熱水嗜溫菌豐度和微生物群落多樣性增加可能是由淺層水補(bǔ)給引起的。

本區(qū)深部熱水第三豐富的微生物群落是硝化螺旋菌門Nitrospirae, 主要分布在E1-1、E4-1和E5-1樣品中, 而在本區(qū)淺層水和土壤均很少。該門成員中的熱脫硫弧菌Thermodesulfovibrio是本區(qū)深部熱水最豐富的菌屬, 是厭氧、嗜熱的硫酸鹽還原菌,該菌最早分離自美國(guó)黃石公園熱噴口水體中的該菌屬菌株, 最佳生長(zhǎng)溫度是65℃, 以硫酸鹽、硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽為電子受體, 以乳酸、戊糖、氫氣和醋酸等為電子供體, 將硫氧化物還原為硫化氫氣體(Henry et al., 1994)。其余的優(yōu)勢(shì)菌門(＞2%)情況是, 產(chǎn)水菌門Aquificae在淺層水和土壤也很少, 但是在深部熱水是優(yōu)勢(shì)菌門, 主要分布于E7-1樣品,優(yōu)勢(shì)菌屬為Sulfurihydrogenibium。該菌屬菌株最早在日本礦坑深部熱液含水層中發(fā)現(xiàn), 是嗜熱、化能自養(yǎng)、兼性厭氧菌, 可將氫氣氧化為水, 將硫和硫代硫酸鹽氧化為硫酸鹽, 最佳生長(zhǎng)溫度60～65℃,不能利用復(fù)雜的有機(jī)物, 以碳水化合物、氨基酸和有機(jī)酸為唯一能源和碳源(Takai et al., 2003)。熱袍菌門Thermotogae在本區(qū)淺層水和土壤也很少, 但是在深部熱水是優(yōu)勢(shì)菌門, 是一類超嗜熱厭氧菌。該菌屬菌株最早在海底水熱區(qū)分離得到, 可將乳酸和醋酸發(fā)酵降解為CO2和H2O, 將硫還原為H2S, 生長(zhǎng)溫度可達(dá)90℃, 最佳溫度80℃(Huber et al.,1986)。廣古菌門Euryarchaeota是深部熱水最豐富的古菌, 優(yōu)勢(shì)古菌屬是甲烷嗜熱桿菌屬M(fèi)ethanothermobacter, 主要分布在E5-1、E6-1樣品中,該菌屬是嗜熱、厭氧、氫營(yíng)養(yǎng)的產(chǎn)甲烷菌, 已發(fā)現(xiàn)于高溫油藏地層和天然氣田地層水等環(huán)境中(Cheng et al., 2011; Nakamura et al., 2013)。而淺層水和土壤優(yōu)勢(shì)古菌均是奇古菌門Thaumarchaeots, 優(yōu)勢(shì)菌屬分別是屬未定名的菌科Nitrosopumilaceae和菌科Nitrososphaeraceae, 這些菌均是嗜溫、好氧氨氧化菌(Qin et al., 2017)。由上可見(jiàn), 上述深部熱水優(yōu)勢(shì)菌門主要出現(xiàn)在深部熱環(huán)境中, 且大部分是嗜熱厭氧菌。

綜合上述分析結(jié)果, 除去來(lái)自淺層水補(bǔ)給的好氧、嗜溫菌, 本區(qū)深部熱水特征性菌群主要是厚壁菌門Firmicutes、硝化螺旋菌門Nitrospirae、熱袍菌門Thermotogae和廣古菌門Euryarchaeota, 與組間顯著性差異分析結(jié)果基本一致。

基于16S rRNA基因的功能預(yù)測(cè)結(jié)果是, 還原性檸檬酸循環(huán)Reductive citrate cycle模塊基因相對(duì)豐度最高, 該循環(huán)廣泛分布在厭氧和微好氧細(xì)菌中,如產(chǎn)水菌門Aquificae、δ-Proteobacteria和ε-Proteobacteria及硝化螺旋菌門Nitrospirae中各種厭氧和微好氧細(xì)菌中(Berg et al., 2011)。該循環(huán)也是羅馬西部平原深部熱水微生物群落CO2固定的主要途徑(Chiriac et al., 2018)。還原性乙酰輔酶A途徑Reductive acetyl-CoA pathway是可利用氫的化能自養(yǎng)厭氧菌(產(chǎn)乙酸菌、硫酸鹽還原菌和產(chǎn)甲烷菌等)的CO2固定途徑, 該途徑功能基因相對(duì)豐度在深部熱水較淺層水更高, 說(shuō)明深部熱水具有更強(qiáng)的氫營(yíng)養(yǎng)化能自養(yǎng)厭氧固碳作用。三羥基丙酸雙循環(huán)3-Hydroxypropionate bi-cycle和卡爾文循環(huán)途徑Calvin cycle均是光合細(xì)菌固碳途徑, 兩循環(huán)模塊功能基因少量存在于本區(qū)深部熱水中, 主要分布在E6-1樣品中, 說(shuō)明深部熱水存在少量光合作用固碳途徑, 其原因可能是大流量抽水條件下, 深部熱水得到與地表水有聯(lián)系的淺部水的補(bǔ)給, 導(dǎo)致光合細(xì)菌進(jìn)入了深部熱水中。

本區(qū)深部熱水生物產(chǎn)甲烷作用很弱, 其原因可能是深部熱水環(huán)境還原性強(qiáng)度尚未達(dá)到產(chǎn)甲烷作用發(fā)生所需的強(qiáng)還原條件。本區(qū)深部熱水氮循環(huán)有關(guān)模塊基因豐度較低, 可能是深部熱水環(huán)境還原性過(guò)強(qiáng)以及該作用發(fā)生所需的電子受體含量較低之故。本區(qū)深部熱水異化硫酸鹽還原作用 較強(qiáng), 原因是硫酸鹽還原作用所需的還原強(qiáng)度不及產(chǎn)甲烷所需的還原強(qiáng)度, 深部熱水處于較封閉的環(huán)境, 有利于硫酸鹽還原作用的發(fā)生。硫代硫酸鹽氧化作用是需氧反應(yīng), 該作用基因也出現(xiàn)在深部熱水中, 主要分布在E6-1和E7-1樣品中, 這里從功能基因角度說(shuō)明深部熱水得到淺部含氧水的補(bǔ)給。

本區(qū)深部熱水微生物群落組成和預(yù)測(cè)的功能具有顯著的地?zé)嵋饬x。本區(qū)深部熱水棲息著大量微生物, 而微生物的代謝活動(dòng)會(huì)改變深部熱水的化學(xué)成分。深部熱水中優(yōu)勢(shì)菌屬包括硫酸鹽還原菌, 該菌的代謝活動(dòng)會(huì)使深部熱水含量減少, 產(chǎn)生的H2S與金屬離子如Fe化合產(chǎn)生FeS沉淀, 會(huì)加速地下井管腐蝕結(jié)垢, 縮短地?zé)嵩O(shè)施使用年限, 本次研究結(jié)果為硫酸鹽還原菌的防治提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通常地下熱水CH4含量較高, 本次研究結(jié)果是本區(qū)深部熱水生物產(chǎn)甲烷作用很弱, 意味著深部熱水中的CH4大部分是非生物成因甲烷, 研究結(jié)果有助于深部熱水成因分析。采自E6-1和E7-1鉆孔的深部熱水出現(xiàn)好氧嗜溫菌, 意味著在大流量抽水條件下, 這些鉆孔的深部熱水得到淺層水的補(bǔ)給。由于深部熱水中變形菌門的優(yōu)勢(shì)菌屬(假單胞菌Pseudomonas)不同于淺層水變形菌門的優(yōu)勢(shì)菌屬(伯克氏菌科Burkholderiaceae), 說(shuō)明這種補(bǔ)給不是來(lái)自鉆孔上方淺層水的垂直補(bǔ)給, 可能是來(lái)自淺層水的側(cè)向補(bǔ)給, 通過(guò)深循環(huán)獲得熱能, 或通過(guò)斷裂帶連通得到其他部位淺層水的補(bǔ)給, 這些鉆孔的深部熱水具有資源的可更新性。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)和功能預(yù)測(cè)技術(shù),以淺層水和土壤為參照, 探索了冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水的微生物群落組成和預(yù)測(cè)的功能, 研究發(fā)現(xiàn), 冀中地?zé)釁^(qū)深部熱水含有38個(gè)菌門, 541個(gè)菌屬, 以細(xì)菌為主(97.5%), 古菌很少(2.5%), 特征性菌群主要是厚壁菌門Firmicutes、硝化螺旋菌門Nitrospirae、熱袍菌門Thermotogae和廣古菌門Euryarchaeota, 優(yōu)勢(shì)菌屬包括硫酸鹽還原菌, 固碳作用、發(fā)酵作用和硫酸鹽還原作用可能較強(qiáng), 而產(chǎn)甲烷作用和反硝化作用可能很弱。深部熱水個(gè)別鉆孔出現(xiàn)嗜溫、好氧菌, 說(shuō)明在大流量抽水條件下, 這些鉆孔的深部熱水得到淺層水的補(bǔ)給。本次研究揭示了深部碳酸鹽巖巖溶-裂隙熱儲(chǔ)層含有種類豐富、功能多樣的微生物群落, 微生物群落特征可作為深部熱水與淺層水水力聯(lián)系的指示劑。

致謝:本文工作得到中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所王貴玲研究員、張薇高級(jí)工程師等的大力支持和幫助, 特此致謝。

Acknowledgements:

This study was supported by China Geological Survey (No.DD20189112), and Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund(No.SK202010).