吡啶并[2, 3-d]嘧啶類衍生物的多組分反應(yīng)合成機(jī)理及抗腫瘤活性

吳林韜, 謝 煜, 韓 春, 景崤壁, 汪 清

(1. 長(zhǎng)治學(xué)院化學(xué)系, 山西 長(zhǎng)治 046011; 2. 揚(yáng)州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州 225002)

癌癥是一種與控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)穩(wěn)定(包括增殖、分化、細(xì)胞遷移和死亡)的調(diào)節(jié)回路缺陷相關(guān)的疾病[1-2]．盡管在過去幾十年里, 癌癥的治療取得了一定的進(jìn)步,但仍然是世界上最致命的疾病之一．

多組分反應(yīng)是一種高效的一步合成法, 由幾種(三種或以上)組分通過一步合成得到一個(gè)比較單一的化合物．1850年首篇報(bào)道多組分一步合成氨基酸[3]．近年來, 三組分以及四組分已經(jīng)成為多組分反應(yīng)的主要趨勢(shì)[4-6], 多組分反應(yīng)具有靈活性、會(huì)聚性和原子經(jīng)濟(jì)性,與線性合成法、分步合成法相比顯示出很多優(yōu)越性, 因此在很多領(lǐng)域(如有機(jī)化學(xué)、藥物化學(xué)和組合化學(xué)等)中得到了廣泛的應(yīng)用[7]．

吡啶并[2, 3-d]嘧啶類化合物及其衍生物近年來受到廣泛關(guān)注, 已有大量文獻(xiàn)報(bào)道其具有良好的抗腫瘤活性[8]．同時(shí), 研究表明, 此類化合物有著廣泛的生物活性及藥理活性, 比如應(yīng)用于治療止咳抗分支桿菌[9]、抗菌[10]和治療2型糖尿病[11]等．以2,4-二羥基嘧啶與丙腈類、醛的多組分合成吡啶并[2, 3-d]嘧啶化合物已有文獻(xiàn)報(bào)道[12], 但此類反應(yīng)在催化劑的選擇上還比較單一, 反應(yīng)芳構(gòu)化原因尚不明確, 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道, 本文擬以吡啶作為堿, 催化合成吡啶并[2, 3-d]嘧啶化合物, 并對(duì)其反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

SGWX-4顯微熔點(diǎn)儀(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司, 溫度未校正); HP1100LC/MSD質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司); Bruker ACF-500型核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司, TMS為內(nèi)標(biāo)); Bruker compact 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(德國(guó)布魯克公司); 柱層色譜硅膠、薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工有限公司)．合成實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售化學(xué)純或分析純．

1.2 反應(yīng)方程式

在50 ml圓底燒瓶中加入2,4-二羥基-6氨基嘧啶1.27 g(10 mmol), 0.66 g(10 mmol)丙二腈與10 mmol芳醛, 20 mL乙醇或DMF作溶劑, 滴加2～3滴吡啶作為催化劑加熱回流, 反應(yīng)2～4 h后停止加熱, 冷卻至室溫,抽濾得固體, 所得固體用DMF重結(jié)晶．

1.4 衍生物數(shù)據(jù)

化合物1: 白色固體, 熔點(diǎn)>300 ℃．1H NMR (500 MHz,d6-DMSO)δ: 7.28 (s, 1H), 7.23—7.17 (m, 2H), 6.93—6.81 (m, 2H), 6.64 (s, 2H), 6.41 (s, 1H), 5.82 (s, 1H), 4.53 (s, 1H)．13C NMR (125 MHz,d6-DMSO)δ: 174.03(s, 1H), 159.48 (s, 1H), 151.58 (s, 1H), 147.12 (s, 1H), 137.50 (s, 1H), 129.33 (s, 2H), 128.68 (d,J=3.5 Hz, 7H), 112.71 (s, 2H), 103.47 (s, 1H), 61.31 (s, 2H)．HRMS (ESI)m/z: [C14H11N5O2+H]+的計(jì)算值為281.105 4, 實(shí)測(cè)值為281.105 0．

化合物2: 白色固體, 熔點(diǎn)>300 ℃．1H NMR (500 MHz,d6-DMSO)δ: 7.25—7.11 (m, 2H), 6.97—6.82 (m, 2H), 6.64(s, 2H), 6.41 (s, 1H), 5.82 (s, 1H), 4.53 (s, 1H), 2.48 (s, 3H)．13C NMR (125 MHz,d6-DMSO)δ: 174.03 (s, 1H), 159.48 (s, 1H), 151.58 (s, 1H), 147.12 (s, 1H), 139.44 (s, 2H), 134.45 (s, 1H), 129.23 (d,J=11.5 Hz, 7H), 112.71 (s, 1H), 103.47 (s, 1H), 61.31 (s, 2H), 21.13 (s, 2H)．HRMS (ESI)m/z:[C15H13N5O2+H]+的計(jì)算值為298.110 2, 實(shí)測(cè)值為295.112 1．

化合物3: 白色固體, 熔點(diǎn)>300 ℃．1H NMR (500 MHz,d6-DMSO)δ: 7.50—7.36 (m, 2H), 7.27—7.13 (m, 2H), 6.64 (s, 2H), 6.41 (s, 1H), 5.81 (s, 1H), 4.52 (s, 1H)．13C NMR (125 MHz,d6-DMSO)δ: 174.03 (s, 1H), 159.48 (s, 1H), 151.58 (s, 1H), 147.12 (s, 1H), 136.97 (s, 1H), 134.54 (s, 2H), 130.24 (s, 3H), 128.56 (s, 3H), 112.71 (s, 2H), 103.47 (s, 1H), 61.31 (s, 2H)．HRMS (ESI)m/z:[C14H10ClN5O2+H]+的計(jì)算值為317.056 8, 實(shí)測(cè)值為317.056 9．

化合物4: 白色固體, 熔點(diǎn)>300 ℃．1H NMR (500 MHz,d6-DMSO)δ: 8.15 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.64 (s, 2H), 6.43 (s, 1H), 5.83 (s, 1H), 4.51 (s, 1H)．13C NMR (125 MHz,d6-DMSO)δ: 174.03 (s, 1H), 159.48 (s, 1H), 150.49 (s, 1H), 147.12 (s, 1H), 146.82 (s, 1H), 138.40 (s, 1H), 133.57 (s, 2H), 130.21 (s, 2H), 126.05 (s, 2H), 125.12 (s, 2H), 112.71 (s, 1H), 104.17 (s, 1H), 61.31 (s, 2H)．HRMS (ESI)m/z:[C14H10N6O4+H]+的計(jì)算值為326.081 5, 實(shí)測(cè)值為326.081 8．

化合物5: 白色固體, 熔點(diǎn)>300 ℃．1H NMR (500 MHz,d6-DMSO)δ: 7.24 (d,J=13.9 Hz, 2H), 7.02 (d,J=28.0 Hz, 2H), 6.64 (s, 2H), 6.41 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 4.52 (s, 1H), 3.93 (s, 3H)．13C NMR (125 MHz,d6-DMSO)δ: 174.03 (s, 1H), 159.48 (s, 1H), 159.06 (s, 1H), 151.36 (s, 1H), 147.12 (s, 1H), 131.85 (s, 2H), 131.38 (s, 2H), 127.08 (s, 1H), 119.91 (s, 2H), 113.68 (s, 2H), 112.71 (s, 1H), 103.39 (s, 1H), 60.14 (s, 2H), 56.79 (s, 3H)．HRMS (ESI)m/z:[C15H13N5O3+H]+的計(jì)算值為311.100 3,實(shí)測(cè)值為311.100 7．

化合物6: 白色固體, 熔點(diǎn)>300 ℃．1H NMR (500 MHz,d6-DMSO)δ: 7.43—7.36 (m, 2H), 7.35—7.20 (m, 2H), 7.16 (s, 1H), 7.14 —7.04 (m, 4H), 6.64 (s, 2H), 6.41 (s, 1H), 5.84 (s, 1H), 4.53 (s, 1H)．13C NMR (125 MHz,d6-DMSO)δ: 174.03 (s, 1H), 159.48 (s, 1H), 156.43 (s, 2H), 155.79 (s, 2H), 151.58 (s, 1H), 147.12 (s, 1H), 132.57 (s, 1H), 130.09 (d,J=7.2 Hz, 5H), 123.34 (s, 2H), 119.24 (s, 2H), 118.43 (s, 3H), 112.71 (s, 2H), 103.47 (s, 1H), 61.31 (s, 2H)．HRMS (ESI)m/z: [C20H15N5O3+H]+的計(jì)算值為373.124 7, 實(shí)測(cè)值為373.124 9．

化合物7: 白色固體, 熔點(diǎn)>300 ℃．1H NMR (500 MHz,d6-DMSO)δ: 7.32—7.18 (m, 2H), 6.98—6.84 (m, 2H), 6.64 (s, 2H), 6.41 (s, 1H), 5.84 (s, 1H), 4.53 (s, 1H), 3.89 (s, 3H)．13C NMR (125 MHz,d6-DMSO)δ: 174.03 (s, 1H), 159.42 (d,J=14.7 Hz, 3H), 151.58 (s, 1H), 147.12 (s, 1H), 130.11 (s, 1H), 128.90 (s, 3H), 113.89 (s, 3H), 112.71 (s, 1H), 103.47 (s, 1H), 61.31 (s, 2H), 56.04 (s, 2H)．HRMS (ESI)m/z:[C15H13N5O3+H]+的計(jì)算值為311.100 5, 實(shí)測(cè)值為311.100 6．

1.5 衍生物體外抗腫瘤活性

采用MTT法, 以五氟尿嘧啶(5-Fuorouracil)、吉非替尼(Gefitinib)為陽(yáng)性藥, 測(cè)試了所得7個(gè)目標(biāo)物對(duì)人體結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、肝癌細(xì)胞HepG2以及支氣管上皮樣細(xì)胞16HBE的體外抗腫瘤活性．取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞(100 μL)/孔接種于96孔培養(yǎng)板, 培養(yǎng)24 h后加入事先配制的不同濃度化合物(100 μL), 并設(shè)溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組; 化合物與細(xì)胞接觸48 h后, 每孔加入20 μL MTT, 在37 ℃、w(CO2)=5%條件下培養(yǎng)4 h后, 用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度值, 計(jì)算細(xì)胞存活率=(加化合物組的吸光度值-空白對(duì)照組的吸光度值)/(對(duì)照組的吸光度值-空白對(duì)照組的吸光度值)×100%, 利用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算化合物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)．

2 結(jié)果與討論

經(jīng)由1,4-二氫吡啶芳構(gòu)化而得到吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物的方法很多, 其主要差別在于催化劑的選擇．有文獻(xiàn)報(bào)道[13], 在強(qiáng)堿條件下丙二腈與芳醛會(huì)發(fā)生許多副反應(yīng),導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)率較低;因此本文選擇堿性較弱、易除去的吡啶作為催化劑, 催化合成得到2-氨基-3-氰基-4-芳基吡啶并[2,3-d]嘧啶類化合物,具體的合成產(chǎn)物如表1所示．同時(shí), 進(jìn)行了無催化劑條件下的對(duì)照反應(yīng), 產(chǎn)物如表2所示．核磁共振氫譜、碳譜、元素分析和X-ray單晶衍射儀等表征手段對(duì)所得衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證．另一方面, 本研究還對(duì)可能影響1, 4-二氫吡啶的芳構(gòu)化動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)因素進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)在室溫條件下反應(yīng)超過48 h仍無吡啶并[2,3-d]嘧啶類化合物生成．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 無催化條件下的反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng), 且產(chǎn)率也很低; 1, 4-二氫吡啶的芳構(gòu)化應(yīng)為熱力學(xué)作用的結(jié)果．

圖1為化合物5和反應(yīng)所得副產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu),表3是晶體學(xué)參數(shù)．晶體結(jié)構(gòu)表明,此反應(yīng)的機(jī)理可能為芳醛先于丙二腈縮合成不飽和二腈化合物, 然后再與2-氨基-3-氰基-4-芳基吡啶并[2,3-d]嘧啶類化合物發(fā)生Michael加成, 進(jìn)一步環(huán)合芳構(gòu)化將得到主產(chǎn)物;若與另一分子芳醛發(fā)生環(huán)合則得到副產(chǎn)物．反應(yīng)機(jī)理見圖2．

表4為體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果．從表4可以看出, 所有的目標(biāo)物對(duì)于這三種瘤株均有較好的抑制效果,多數(shù)化合物抑制活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶和吉非替尼, 且在這三種瘤株之間表現(xiàn)出了偏愛于HCT116細(xì)胞的選擇性．在本實(shí)驗(yàn)條件下, 與5-氟尿嘧啶相比, 化合物6對(duì)HCT116細(xì)胞的活性增強(qiáng)了大約100倍．

表1 回流下吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物的合成Tab.1 Synthesis of pyridino [2,3-d] pyrimidine derivatives (Reflux)

表2 無催化劑參與條件下吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物的合成Tab.2 Synthesis of pyridino [2,3-d] pyrimidine derivatives without catalyst

圖1 化合物5(a)和副產(chǎn)物(b)的晶體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Crystal structure of compound 5 (a) and byproduct (b)

表3 化合物5與副產(chǎn)物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)

續(xù)表

圖2 反應(yīng)機(jī)理Fig.2 Reaction mechanism

表4 吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物的體外抗腫瘤活性Tab.4 In vitro antiproliferative activities of pyridino [2,3-d] pyrimidine derivatives

3 結(jié)論

本文通過多組分法高效率地得到了一系列具有良好抗腫瘤活性的吡啶并[2,3-d]嘧啶化合物, 并明確了催化劑和反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)影響, 為后續(xù)進(jìn)一步深入研究該類化合物抗腫瘤生物活性奠定了良好的基礎(chǔ)．