車前草醇提物對水負荷模型大鼠的利尿作用研究

王一強 ,李 晶 ,張玉香 ,張 瑞 ,史曉偉

（1.甘肅衛(wèi)生職業(yè)學院，甘肅 蘭州 730300；2.蘭州大學，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730070）

2015 版中國藥典規(guī)定，車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前 Plantago depressa Willd.的干燥全草作車前草用[1]。別名:當道、牛遺、牛舌草、車輪草、豬耳草、車轱轆菜、五根草等[2]，具有利尿通淋、涼血解毒、祛痰的功效，用于暑濕泄瀉，熱淋澀痛，水腫尿少、痰熱咳嗽、吐血衄血、癰腫瘡毒等[3-5]?，F代醫(yī)學研究表明，車前草中含有黃酮類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、三萜及甾醇類、揮發(fā)油、微量元素等多種有效成分，具有抗菌消炎、利尿、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗?jié)?、修復受損細胞、降血糖、降血壓、降血脂等藥理作用[6-10]。

我國將車前作為中藥材使用的歷史悠久，其道地產區(qū)為江西贛江沿岸[11-12]?！秷D經本草》中記載，車前產地有陜西和甘肅，屬于西北地區(qū)[13]，劉遠平[14]在小隴山林區(qū)車前草開發(fā)前景和陳拓[15]等人在甘肅馬銜山平車前葉片δ13C 的海拔和時間差異的研究中顯示，甘肅也分布有一定規(guī)模的車前草。

本實驗采用水負荷大鼠模型，研究江西車前草與甘肅車前草對水負荷大鼠的利尿作用，為進一步研究甘肅車前草臨床利尿作用和擴大其栽培規(guī)模提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取SPF 級別，同批雄性SD 大鼠100 只，清潔級，體質量(150±20)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，生產許可證號:SYXK(甘)2011-0001。實驗前將動物置于室內適應環(huán)境1 周，室溫18℃～20℃，標準大鼠飼料喂養(yǎng)，自由進食，飲用自來水。

1.2 藥物與試劑

車前草（安國市廣濟堂，批號：19022805，產區(qū)：江西）；甘肅車前草（經鑒定為車前科車前屬平車前的干燥全草，產區(qū)：甘肅天水小隴山）；氫氯噻嗪片（天津力生制藥有限公司，批號：2003002）；血尿素氮（BUN）測試盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)；碳酸酐酶(CA)試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)。

1.3 實驗儀器

5417R 低溫高速離心機(德國EPPENDORF 公司)；HH-S 型數顯恒溫水浴箱(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；ZY KHB-1280 型全自動生化儀(上海科華生物工程股份有限公司)；WFX-120A 原子吸收分光光度計（美國Beckman-coulter 公司）。

2 實驗方法

2.1 試樣液制備

江西、甘肅車前草各500g，適量粉碎，用80%乙醇浸泡12h 后，4 倍量80%乙醇回流提取3 次，每次2h，過濾，合并濾液并回收溶劑至干。江西、甘肅車前草醇提物用0.9% NaCl 溶液混懸，分別制成生藥含量1.6 g/ml，0.4 g/ml，0.1 g/ml 的試樣液；陽性對照藥氫氯噻嗪用0.9% NaCl 溶液配成0.4 mg/ml 的溶液。

2.2 動物分組與造模

采用Aston 法[16-18]將SD 大鼠預先禁食(不禁水)18 h，2.5 mL/100g 去離子水灌胃，收集2 h 尿量，選擇2 h 出入量比值＞40%的大鼠進行分組實驗。

篩選合格SD 大鼠80 只，隨機分為8 組，每組10 只，分別為：空白對照組，陽性對照組，江西車前草高劑量組（以下簡稱江草高）、中劑量組（以下簡稱江草中）、低劑量組（以下簡稱江草低），甘肅車前草高劑量組（以下簡稱甘草高）、中劑量組（以下簡稱甘草中）、低劑量組（以下簡稱甘草低）。實驗大鼠置于標準鼠籠適應2d，代謝籠中適應3d，實驗前禁食(不禁水)18h，以減少糞便的干擾。每組大鼠按25 mL/kg 體質量，用生理鹽水灌胃，造成水鈉潴留狀態(tài)。

2.3 給藥方法

造模結束30 min 后，輕壓大鼠下腹，排盡余尿，各組進行灌胃治療。實驗時，各藥物組給予含試樣藥物的0.9% NaCl 25 mL/kg，其中藥物組高、中、低劑量組分別含生藥量1.6 g/ml、0.4 g/ml、0.1 g/ml，陽性對照組含氫氯噻嗪0.4 mg/ml，空白對照組給予同體積生理鹽水。

2.4 標本采集與指標檢測

2.4.1 大鼠排尿量的測定

實驗各組大鼠分別于給藥第1d 收集大鼠1h、2h、4h、6h、24 h 的尿液，測定尿液體積并凍存于－20℃冰箱。

2.4.2 尿液中Cl－、Na+、K+濃度的測定

稱取一定量NaCl 和KCl，配制成標準系列濃度。取出凍存于－20℃冰箱中的尿液，室溫溶解并稀釋至一定濃度，用原子分光光度計在766.5nm 處檢測K+濃度，在589nm 處檢測Na+濃度，精確吸取適量尿液并稀釋至一定濃度，滴加5% K2CrO41 滴，搖晃均勻，緩緩加入AgNO3標準液，邊滴邊搖至橘紅色不褪色為止，記錄消耗的AgNO3標準液的體積，計算尿液中的Cl－濃度。

2.4.3 血尿素氮（BUN）和碳酸酐酶(CA)水平的測定

連續(xù)給藥6 d,第6 d 給藥1 h 后處死大鼠，取血約2 mL，立即放入低溫離心機，1000 r/min 離心5 min，得到血清。按大鼠BUN 試劑盒和CA 試劑盒的說明書操作。

2.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行處理，數據用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組組間比較采用單因素方差分析法，以P＜0.05 表示統計學差異顯著，P＜0.01 表示統計學差異極顯著。

3 結果

3.1 對水負荷大鼠排尿量的影響

由表1 可知，與空白對照組比較，車前草醇提物1 h 內的利尿效果不顯著，陽性對照組的利尿效果顯著（*P＜0.05）；1～4h 內，江草高組和甘草高組具有極顯著的利尿效果（**P＜0.01），江草中、低組和甘草中組具有顯著的利尿效果（*P＜0.05）；江草高、中、低劑量組和甘草高、中劑量組24 h 內的利尿效果有極顯著性差異（**P＜0.01）。6 h后，甘草低劑量組與江草高劑量組比較，有顯著性差異（ΔP＜0.05）。

表1 車前草醇提物對水負荷大鼠排尿量的影響（±s）

表1 車前草醇提物對水負荷大鼠排尿量的影響（±s）

注：與空白組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與江草高組比較ΔP＜0.05。

綜上所述，車前草提取物有明顯的利尿作用，但江西車前草的利尿作用稍強于甘肅車前草。

3.2 對水負荷大鼠尿液中Cl-、Na+、K+濃度的影響

實驗結果顯示，陽性對照組、江草高劑量組和甘草高劑量組大鼠尿液中Cl－、Na+、K+濃度與空白對照組比較，有極顯著性差異（**P＜0.01），江草中劑量組和甘草中劑量組（對Cl－濃度的影響除外）對水負荷大鼠Cl－、Na+、K+的排泄也具有顯著的促進作用（*P＜0.05）。與江草高劑量組比較，甘草低劑量組對水負荷大鼠Cl-、Na+、K+的排泄作用最弱。見表2。

表2 車前草醇提物對大鼠尿液中Cl－、Na+、K+濃度的影響（±s）

表2 車前草醇提物對大鼠尿液中Cl－、Na+、K+濃度的影響（±s）

注：與空白組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與江草高組比較ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01。

綜上所述，車前草醇提物有明顯促進Cl－、Na+、K+排泄的作用，但江西車前草的促進作用稍強于甘肅車前草。

3.3 對水負荷大鼠BUN 和CA 水平的影響

實驗結果表明，與空白對照組比較，江草高劑量組與甘草高劑量組的BUN 濃度和CA 濃度明顯下降，有顯著的統計學差異（*P＜0.05），其他劑量組無差異。與江草高劑量組比較，甘草低劑量組的BUN 濃度和CA 濃度明顯升高，有顯著的統計學差異（ΔP＜0.05）。見表3。

表3 車前草醇提物對大鼠BUN 和CA 水平的影響（±s）

表3 車前草醇提物對大鼠BUN 和CA 水平的影響（±s）

注：與空白組比較＊P＜0.05，與江草高組比較ΔP＜0.05。

初步說明，車前草醇提物對水負荷大鼠的腎小球濾過功能有影響，且江蘇車前草的腎小球濾過功能稍強于甘肅車前草。

4 討論

車前草具有利尿通淋的功效，水負荷大鼠排尿量和電解質的排泄是影響車前草利尿作用的重要因素。本實驗采用經典利尿模型，針對道地產區(qū)江西車前草和甘肅產車前草醇提物對水負荷大鼠的利尿作用進行比較觀察，發(fā)現車前草醇提物具有利尿效果，且江西車前草的利尿效果強于甘肅車前草，但同等劑量下兩者比較差異不明顯。

排尿量的變化可以影響尿液中Cl-、Na+、K+的排泄，實驗發(fā)現，車前草醇提物有明顯促進Cl-、Na+、K+排泄的作用，但江西車前草對Cl-、Na+、K+的排泄作用強于甘肅車前草。可以得出，車前草醇提物可能是通過增加尿液排泄量和尿液中Cl-、Na+、K+的排泄量而達到利尿效果，且生含藥量達到10g/kg 時才有效。

實驗中還發(fā)現，江西車前草高劑量組與甘肅車前草高劑量組對BUN 濃度有明顯的降低作用，說明車前草醇提物對水負荷大鼠的腎小球濾過功能有影響。江西車前草高劑量組與甘肅車前草高劑量組對CA 有明顯的抑制作用，從而造成腎小管內H+減少，管腔中Na+的重吸收減少，最終導致Na+排出量增加，排尿量增加。

綜上所述，車前草醇提物具有顯著的利尿作用，且江西產車前草的利尿效果強于甘肅產車前草，但同等劑量下，兩者利尿作用差異不明顯。

5 展望

車前草與車前子為同一原植物的不同藥用部位，車前子作為利尿藥已大量在臨床使用。經考證，車前草的道地產區(qū)位于江西贛江沿岸，但由于車前草適應性強，在田間地頭隨處可見，甘肅也分布有一定量車前草。現代藥理研究表明，車前草也具有顯著的利尿作用，但作為利尿藥在臨床使用的量遠不及車前子。所以，臨床上可將車前草作為利尿藥廣泛使用以擴大藥用資源，同時，甘肅地區(qū)對車前草的規(guī)?；N植和發(fā)展也有待后期進一步深入研究。