響應(yīng)面法優(yōu)化獅頭柑果皮總黃酮提取工藝

王 杰，張鵬鋒,2，趙小娜，張?jiān)圃?，魯周?

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.榆林市榆陽區(qū)森林防火保障中心，陜西 榆林 719000)

獅頭柑(Citrusreticulata)為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)亞熱帶常綠果樹，因其果皮皺起形如“獅頭”而得名[1]。獅頭柑是安康市地方名優(yōu)果品，栽培歷史悠久，主要分布在漢江、旬河沿線[2]，宋代時(shí)已在安康廣泛栽培，歷經(jīng)千年形成了獨(dú)具特色的地方栽培品種[3]。獅頭柑果樹常綠，單株產(chǎn)量高，盛果期長(zhǎng)，果肉甘酸可口，但后味微苦，具有明神降火、生津潤(rùn)肺、清熱理氣等醫(yī)療保健功效[4]。據(jù)西北農(nóng)林科技大學(xué)、農(nóng)科院校區(qū)測(cè)試中心2003年10月對(duì)旬陽獅頭柑檢測(cè)表明果實(shí)含蛋白質(zhì)0.96%、VC約0.12 mg·100g-1、Ca 147.4 mg·kg-1、P 166.9 mg·kg-1、Fe 2.31 mg·kg-1，未檢出砷、鉛、汞等有毒物質(zhì)[5]。孟瑤瑤等[6]研究了獅頭柑籽油提取技術(shù)，優(yōu)化提取工藝為：料液比1∶100(g·mL-1)，提取溫度49℃，提取時(shí)間7 h。張涵等[4]對(duì)獅頭柑果皮中的香氣進(jìn)行了提取分析和鑒定，認(rèn)為獅頭柑皮中香氣成分主要是烴類、醛類、酮類、醇類、酯類、芳香族化合物。獅頭柑在旬陽縣已成為全縣主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一[7]，獅頭柑全身是寶，其根、葉、果皮均可入藥，有消食化痰、理氣養(yǎng)胃等功效，其樹體木材堅(jiān)實(shí)致密，可制作優(yōu)良家具[8]。

植物源性黃酮化合物的生物活性越來越受關(guān)注[9]，其具有很好的抗炎活性、抗病毒活性[10]、抑菌性[11]、抗氧化[12]、抗過敏[13]、降血糖[14]等功效，柑橘屬的黃酮類化合物含量豐富，易分離[15]，已成為人們的研究重點(diǎn)之一。目前對(duì)獅頭柑的相關(guān)研究報(bào)道有良種選育技術(shù)[16]、常見蟲害防治[17]、標(biāo)準(zhǔn)化建園及高產(chǎn)栽培技術(shù)[2,18]，產(chǎn)業(yè)發(fā)展的分析與建議[17,19]，對(duì)獅頭柑的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保健功能和生物活性物質(zhì)的分析及資源的利用等方面研究相對(duì)較少。本研究對(duì)獅頭柑果皮的總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為獅頭柑資源能更好的開發(fā)利用提供新思路。

試驗(yàn)結(jié)果表明，獅頭柑果皮中總黃酮含量遠(yuǎn)>果肉，故以安康獅頭柑果皮為試驗(yàn)材料，采用超聲波輔助提取總黃酮，利于黃酮類化合物滲出[20-21]，通過響應(yīng)面法和數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法來優(yōu)化提取工藝，為獅頭柑的進(jìn)一步利用和開發(fā)，更好地發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獅頭柑樣品采集于陜西省安康市關(guān)廟鎮(zhèn)紅專村安康北亞熱帶經(jīng)濟(jì)林果樹試驗(yàn)示范站，均為隨機(jī)采摘。

主要試劑：無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，蘆丁為分析標(biāo)準(zhǔn)品，試劑均來自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯卡尺，上海九量五金工具有限公司；JJ500Y型電子天平，精度0.01 g，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；R200D型電子分析天平，精度0.000 001，德國(guó)Sartorious公司；DGG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；A1330011型Beckman離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司；超純水器，成都越純科技有限公司；BCD-215DC型冰箱，中國(guó)海爾集團(tuán)；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；IKA-A11基本型批量式分析研磨儀，德國(guó)IKA集團(tuán)；MULTISKAN-GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理 將所采獅頭柑樣品洗凈晾干，隨機(jī)取果實(shí)20個(gè)，分離果肉和果皮，用液氮將果皮進(jìn)行速凍粉碎，所選獅頭柑應(yīng)保證隨機(jī)性，分裝并標(biāo)明編號(hào)，放置于-80℃冰箱中備用。

1.3.2 獅頭柑總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

1)準(zhǔn)確稱取獅頭柑果皮樣品0.200 0 g各6份于10 mL離心管中，分別加入5 mL 75%乙醇，在超聲功率70 W，提取溫度為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下超聲提取60 min，計(jì)算總黃酮得率來確定提取溫度。

2)不同提取時(shí)間對(duì)獅頭柑總黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取獅頭柑果皮樣品0.200 0 g各6份于10 mL離心管中，分別加入5 mL 75%乙醇，在提取溫度55℃、超聲功率70 W下超聲提取20、30、40、50、60、70 min，計(jì)算總黃酮得率來確定提取時(shí)間。

3)準(zhǔn)確稱取獅頭柑果皮樣品0.2000 g各6份于10 mL離心管中，分別加入3、5、7、9、10 mL 75%乙醇，在提取溫度55℃、提取時(shí)間30 min、超聲功率70 W下提取，計(jì)算總黃酮得率來確定料液比。

4)準(zhǔn)確稱取獅頭柑果皮樣品0.200 0 g各6份于10 mL離心管中，加入7 mL的75%乙醇，提取溫度55℃、提取時(shí)間30 min保持不變，在超聲功率50、60、70、80、90、100 W條件下提取，計(jì)算總黃酮得率來確定超聲功率。

1.3.3 獅頭柑總黃酮提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)，料液比為1∶35(g∶mL-1)，以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、超聲功率(C)作為考察因子，以獅頭柑總黃酮得率(Y)為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，因素及水平編碼見表1。

表1 獅頭柑果皮響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平編碼Table 1 Factor and levels coding of Box-Behnken Design from peel of Shitougan

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用應(yīng)用廣泛的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[22]，但有所改動(dòng)。精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.030 0 g于100 mL容量瓶中，加入一定量的75%乙醇將其溶解并定容，搖勻后即制成質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-18℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取7支20 mL具塞試管依次為1～7號(hào)，用移液槍分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加一定量的75%乙醇補(bǔ)至3 mL，搖勻后加入1 mL 5% NaNO2于各試管中，放置6 min后加入1 mL 10% Al(NO3)3于各試管中，放置6 min后加入10 mL的1 mol·L-1NaOH溶液于各試管中，定容搖勻后靜置15 min，以空白液為參比，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程[4]。

1.3.4.3 樣品的測(cè)定 樣品提取方法同以上單因素試驗(yàn)方法，提取后冷卻至室溫，4 500 r·min-1離心20 min，取上清液1 mL并用75%乙醇稀釋至10 mL，再吸取1 mL進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮的質(zhì)量濃度，總黃酮得率計(jì)算公式：

(1)

式中：ρn為顯色液中總黃酮的質(zhì)量濃度/μg·mL-1；V為顯色液的體積/mL；M為樣品的質(zhì)量/g；N為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用Excel2016和DPS7.55軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上按Box- Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design Expert 10.0.3.1分析擬合數(shù)據(jù)并進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 獅頭柑總黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)獅頭柑總黃酮得率的影響 由圖1可知，獅頭柑提取溫度為35℃時(shí)總黃酮得率最低為0.86%，隨著提取溫度的上升，總黃酮得率也增加，在55℃時(shí)為最大值2.07%，原因可能為隨著提取溫度的上升，分子熱運(yùn)動(dòng)逐漸加劇，超聲空化引起的湍流效應(yīng)可使邊界層變薄，黃酮類化合物的傳質(zhì)速率和擴(kuò)散系數(shù)增加[23]，有利于黃酮類化合物的滲出擴(kuò)散；但是隨著提取溫度的繼續(xù)上升，總黃酮得率開始緩慢下降，在60℃時(shí)總黃酮得率下降到1.95%，可能由于提取溫度過高，使對(duì)熱敏感的黃酮類化合物受熱分解[24]，同時(shí)一部分乙醇揮發(fā)，造成料液比增大，黃酮類化合物提取量減少[25]，從而降低總黃酮得率。

圖1 提取溫度對(duì)獅頭柑果皮總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)獅頭柑總黃酮得率的影響 由圖2可知，獅頭柑總黃酮得率隨提取時(shí)間的增加而增加，在提取時(shí)間為30 min時(shí)總黃酮得率為最大值2.48%，原因可能為隨著時(shí)間的增加，提取溶劑與反應(yīng)物中的黃酮類化合物濃度差導(dǎo)致持續(xù)擴(kuò)散；但隨著提取時(shí)間的繼續(xù)增加，總黃酮得率開始緩慢下降，在提取時(shí)間為60 min時(shí)，總黃酮得率下降到2.02%，可能是提取時(shí)間的過長(zhǎng)，黃酮類化合物持續(xù)析出使?jié)舛忍荻冉档?，同時(shí)對(duì)熱敏感的黃酮類化合物水解[24]，從而降低總黃酮得率。

圖2 提取時(shí)間對(duì)獅頭柑果皮總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction duration on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.3 料液比對(duì)獅頭柑總黃酮得率的影響 由圖3可知，獅頭柑總黃酮得率隨著料液比的增加而增加，二者呈正相關(guān)，在料液比為1∶35(g∶mL-1)時(shí)總黃酮得率趨于穩(wěn)定為2.61%，原因可能為提取溶劑與反應(yīng)物中的黃酮類化合物濃度差持續(xù)存在，使其中的黃酮類化合物持續(xù)擴(kuò)散，同時(shí)加大了提取溶劑與反應(yīng)物的接觸面積[26]，但隨著料液比的進(jìn)一步增加，總黃酮得率增加緩慢且趨于穩(wěn)定，可能是隨著料液比的增加，使內(nèi)外滲透壓趨近穩(wěn)定，總黃酮化合物的傳質(zhì)擴(kuò)散趨于穩(wěn)定狀態(tài)[27]，同時(shí)隨著提取溶劑的增加，黃酮類化合物的擴(kuò)散所需時(shí)間也會(huì)增加[28]，所以在限定時(shí)間內(nèi)總黃酮得率增加緩慢，考慮到提取溶劑的增加會(huì)造成資源浪費(fèi)，且對(duì)提純?cè)斐衫щy，所以采用料液比1∶35(g∶mL-1)最為適宜。

圖3 料液比對(duì)獅頭柑果皮總黃酮得率的影響Fig.3 Effect ofsolid-liquid ratio on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.4 超聲功率對(duì)獅頭柑總黃酮得率的影響 由圖4可知，獅頭柑總黃酮得率先隨著超聲功率的增加而增加，在70 W時(shí)達(dá)到最大值2.11%，原因可能為隨著超聲功率的增加，超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)使細(xì)胞破碎充分[29]，媒介粒子的速度增大使界面擴(kuò)散層上分子擴(kuò)散速率增大[30]，導(dǎo)致黃酮類化合物擴(kuò)散量和擴(kuò)散速度增加；但隨著超聲功率的繼續(xù)增加，總黃酮得率開始下降，可能是超聲功率的增大會(huì)破壞某些苷體的穩(wěn)定性[31]，從而降低總黃酮得率。

圖4 超聲功率對(duì)獅頭柑果皮總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.2 獅頭柑總黃酮提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面模型擬合與顯著性分析檢驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、超聲功率(C)為自變量，以總黃酮得率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各試驗(yàn)均有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括12個(gè)析因點(diǎn)、5個(gè)中心點(diǎn)，中心試驗(yàn)均重復(fù)5次來估計(jì)純?cè)囼?yàn)誤差。

對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合分析，可得到二次多元回歸擬合方程：

表2 獅頭柑果皮Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of Box-Benhnken Design from peel of Shitougan

Y=2.27+0.048×A+0.14×B+0.012×C-0.007 5×A×B+0.002 5×A×C+0.017×B×C-0.065×A2-0.25×B2-0.13×C2(R2=0.975 9)

(2)

對(duì)此模型方程進(jìn)行顯著性分析檢驗(yàn)(表3)，可知模型P<0.01，說明該模型差異極顯著，其模擬性良好。一次項(xiàng)中A的偏回歸系數(shù)顯著(P<0.05)，說明提取溫度對(duì)總黃酮得率有顯著性影響，B的偏回歸系數(shù)極顯著(P<0.01)，說明提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率有極顯著影響，而C的偏回歸系數(shù)不顯著(P>0.05)，說明超聲功率對(duì)總黃酮得率沒有顯著影響；交互項(xiàng)中交互作用均不顯著；二次項(xiàng)中，A2對(duì)總黃酮得率影響顯著，B2、C2對(duì)總黃酮得率均有極顯著影響。該模型的回歸系數(shù)R2=0.975 9說明該模型響應(yīng)值變化的97.59%來自自變量，失擬項(xiàng)P=0.450 9>0.05，說明該模型對(duì)自變量擬合良好，能較好地描述各自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。剔除回歸方程中不顯著交互項(xiàng)，簡(jiǎn)化后公式為：

表3 獅頭柑果皮響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Anovariance analysis of regression model from peel of Shitougan

(3)

2.2.2 響應(yīng)面和等高線圖分析 由圖5可知，超聲功率為70 W時(shí)，三維面陡峭、等高線呈橢圓形，說明提取溫度和提取時(shí)間的交互作用顯著，獅頭柑果皮總黃酮得率受到二者的共同影響。其中提取時(shí)間較提取溫度的三維面陡，表明提取時(shí)間對(duì)獅頭柑果皮總黃酮得率有極顯著影響。

圖5 提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of interaction of extraction temperature and extraction duration on yield of total flavonoids

由圖6可知，提取時(shí)間為30 min時(shí)，三維面較陡、等高線呈橢圓形，表明提取溫度和超聲功率的交互作用顯著，獅頭柑果皮總黃酮得率受到二者的共同影響。其中提取溫度較超聲功率的三維面陡，說明提取溫度對(duì)獅頭柑果皮總黃酮得率有顯著性影響。

圖6 提取溫度和超聲功率交互作用對(duì)總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of interaction of extraction temperature and ultrasound power on yield of total flavonoids

由圖7可知，提取溫度為55℃時(shí)，三維面陡峭、等高線呈橢圓形，說明提取時(shí)間和超聲功率的交互作用顯著，獅頭柑果皮總黃酮得率受到二者的共同影響。其中提取時(shí)間較超聲功率的三維面陡，說明提取時(shí)間對(duì)獅頭柑果皮總黃酮得率有極顯著影響。

圖7 提取時(shí)間和超聲功率交互作用對(duì)總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of interaction of extraction duration and ultrasound power on yield of total flavonoids

2.2.3 獅頭柑總黃酮提取參數(shù)的優(yōu)化與模型驗(yàn)證 用Design-Expert 10.0.3.1對(duì)參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果表明，提取溫度60℃、提取時(shí)間32.673 min、超聲功率70.726 W，總黃酮得率為2.273%。在試驗(yàn)過程中對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行了多次重復(fù)出現(xiàn)相同結(jié)果，優(yōu)化后結(jié)果低于單因素最大值，可能是由于試驗(yàn)中做響應(yīng)面試驗(yàn)的原料是在單因素試驗(yàn)后放置了一段時(shí)間，從而導(dǎo)致的樣品原料存在差異引起的。

綜合分析后，將優(yōu)化后參數(shù)修正為：料液比1∶35(g∶mL)、提取溫度60℃、提取時(shí)間33 min、超聲功率70 W，使用修正后參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果測(cè)得總黃酮得率為2.258%，與模型預(yù)測(cè)值相差較小，證明該模型可以用于分析及預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論與討論

本研究主要為獅頭柑資源能更好的開發(fā)利用提供新思路，進(jìn)一步探索獅頭柑中總黃酮的提取工藝，避免資源的浪費(fèi)，為獅頭柑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供新的方法，有利于增加獅頭柑的附加值。但對(duì)提取后果皮殘?jiān)睦眠€需進(jìn)一步探索，可考慮果膠、多糖和揮發(fā)油以及β-胡蘿卜素等有效成分的提取工藝研究，建立連續(xù)提取體系，對(duì)揮發(fā)油的利用可考慮羥丙基-β-環(huán)糊精包合工藝，對(duì)β-胡蘿卜素的利用可考慮微膠囊包埋技術(shù)。雖對(duì)果皮總黃酮提取工藝做了優(yōu)化，但對(duì)于所提取的總黃酮類型還不明確，需要進(jìn)一步進(jìn)行分離和鑒定。