硒代半胱氨酸的研究進(jìn)展

董澤云

（天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

硒（Se）是動(dòng)物和人類都必需的微量元素，可從包括谷物和蔬菜在內(nèi)的飲食中獲得。在1950 年代，德國科學(xué)家克勞斯·施瓦茨（Klaus Schwarz）首次發(fā)現(xiàn)硒作為必需微量元素而存在，可以防止大鼠肝臟壞死[1]。硒缺乏與多種疾病有關(guān)，包括中國農(nóng)村地區(qū)多發(fā)的地方性心肌病克山?。↘eshan）和慢性骨軟骨病卡申-貝克病（Kashin-Beck），還會影響個(gè)體藥物代謝的能力，并且可能與某些藥物毒性增加和藥效降低有關(guān)[2]。硒在細(xì)胞中的功能，主要通過硒代半胱氨酸的形式并入多種硒蛋白的活性位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)。硒代半胱氨酸是遺傳密碼中的第21 個(gè)氨基酸，在蛋白合成中由UGA 密碼子編碼。硒代半胱氨酸存在于多種硒蛋白和硒酶中，例如谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶，它們在氧化還原、氧化還原信號和抗氧化防御中具有重要的生物學(xué)功能。因此，硒蛋白是生命體中必不可少的。但研究表明，硒蛋白的活性中心硒代半胱氨酸分子本身對多種癌細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性作用，因此，其作為具有廣譜抗腫瘤活性的潛在藥物被廣泛研究。本文對硒代半胱氨酸的生物合成路徑的研究進(jìn)展，硒代半胱氨酸參與的硒蛋白的功能以及硒代半胱氨酸分子作為抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性及其機(jī)理研究進(jìn)行了綜述，為硒蛋白作為一些疾病治療研究靶標(biāo)和硒代半胱氨酸分子作為抗腫瘤藥物的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 硒代半胱氨酸的生物合成

對于普通氨基酸而言，氨基酸分子通常在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成，然后通過相應(yīng)的氨酰-tRNA 合成酶偶聯(lián)到同源tRNA 上。而硒代半胱氨酸的合成路徑不同于普通氨基酸。 硒代半胱氨酸具有同源tRNASec，但由于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中不存在游離的硒代半胱氨酸，也沒有相應(yīng)的硒代半胱氨酰-tRNA 合成酶，硒代半胱氨酸的合成并非始于硒代半胱氨酸與同源tRNASec 的連接，而是絲氨酰-tRNA 合成酶首先將絲氨酸（Ser）連接到非同源tRNASec 上形成絲氨酰-tRNASec（Ser-tRNASec）（圖1）[3]。在真核生物和古生菌中，絲氨酰-tRNASec 通過磷酸絲氨酰-tRNASec 激酶（PSTK） 轉(zhuǎn)化為磷酸化的絲氨酰-tRNASec（pSer-tRNASec）。而后，該中間體在硒代半胱氨酸合成酶（SecS）的作用下，接受活化的硒供體分子硒代磷酸鹽，從而產(chǎn)生最終產(chǎn)物硒代半胱氨酰-tRNASec（Sec-tRNASec）（圖1）。硒代磷酸鹽由硒化氫在ATP 和硒代磷酸鹽合成酶2（SPS2）的共同作用下生成[4，5]。硒代半胱氨酸在細(xì)菌中的合成路徑與在真核生物和古生菌中不完全相同。在細(xì)菌中，硒代半胱氨酸合成酶（在細(xì)菌中為SelA）直接作用于絲氨酰-tRNASec（Ser-tRNASec），并去除絲氨?；鶊F(tuán)中的羥基形成中間體。隨后，中間體接受接收活化的硒代磷酸鹽最終產(chǎn)生硒代半胱氨酰-tRNASec（Sec-tRNASec）。此處的硒代磷酸鹽在細(xì)菌中的硒代磷酸鹽合成酶SelD 的作用下產(chǎn)成[6，7]。

硒代半胱氨酸由密碼子UGA 進(jìn)行編碼，而UGA 通常是決定蛋白質(zhì)合成停止的終止密碼子。將UGA 識別為硒代半胱氨酸密碼子而不是終止密碼子的關(guān)鍵為硒蛋白mRNA 上具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的SECIS 元件，稱為硒代半胱氨酸插入元件。在細(xì)菌中，SECIS 元件出現(xiàn)在UGA 密碼子下游的編碼區(qū)內(nèi)，作為與Sec-tRNASec 結(jié)合為復(fù)合物的特定延伸因子SelB 的結(jié)合位點(diǎn)。在古生菌和真核生物中，SECIS 元件通常位于硒蛋白mRNA 3' 端的非翻譯區(qū), 它與SECIS 結(jié)合蛋白2（SBP2）形成的復(fù)合物能夠與特定的延伸因子EFSec 與Sec-tRNASec 形成的復(fù)合物結(jié)合，從而將硒代半胱氨酸插入到硒蛋白中（圖1）[8]。

圖1 硒代半胱氨酸在真核生物內(nèi)的合成路徑Fig.1 Biosynthesis pathway of selenocysteine in eukaryote

2 硒代半胱氨酸參與的硒蛋白及其功能

硒代半胱氨酸通過特殊的生物合成途徑插入多種硒蛋白的活性位點(diǎn)。由于硒代半胱氨酸的pKa值較低，在生理?xiàng)l件下，硒代半胱氨酸中的硒幾乎被完全離子化，因此，可以作為一種極其有效的生物催化劑。研究表明，哺乳動(dòng)物中可能存在多達(dá)100 種硒蛋白。人類的25 種硒蛋白中大約有一半硒蛋白已經(jīng)能夠被純化和克隆，其功能也被進(jìn)一步研究表征。這些硒蛋白大多通過硒代半胱氨酸表現(xiàn)出酶促氧化還原功能，從而具有催化或抗氧化活性[5，9，10]。谷胱甘肽過氧化物酶通過催化H2O2和其他過氧化物的還原而保護(hù)細(xì)胞不受自由基和過氧化物類活性氧的損害，硫氧還蛋白還原酶在其代謝活動(dòng)中通過催化硫氧還蛋白還原而起調(diào)節(jié)作用。由于硫氧還蛋白可刺激正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，并在腫瘤細(xì)胞中以高濃度形式存在，抑制硫氧還蛋白還原酶的活性可以在癌癥的預(yù)防和治療中起到重要作用[11，12]。甲狀腺激素脫碘酶將硒代半胱氨酸與甲狀腺激素的代謝聯(lián)系起來，3 種不同的甲狀腺激素脫碘酶可催化甲狀腺激素的還原去碘化，從而使其活化或失活，對于胎兒的正常生長發(fā)育必不可少[10]。此外，還有許多其他功能已知或未知的硒蛋白在生物體調(diào)節(jié)中起到重要作用。

3 硒代半胱氨酸的毒性及機(jī)理

研究表明，游離的硒代半胱氨酸分子對多種癌細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性作用，其半數(shù)致死量范圍為1.7～37.0μM[13-16]。因此，硒代半胱氨酸作為具有廣譜抗腫瘤活性的潛在藥物被廣泛研究。目前，已經(jīng)提出了幾種硒代半胱氨酸作為抗癌活性藥物的可能機(jī)制，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、破壞細(xì)胞氧化還原平衡、引發(fā)DNA 損傷等[13，17，18]。

細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS），包括超氧陰離子、H2O2和羥基自由基，是在細(xì)胞內(nèi)正常有氧條件下產(chǎn)生。但在外部刺激的影響下，細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度會升高，可能會攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，并引發(fā)氧化損傷。ROS 引發(fā)的DNA 損傷反應(yīng)會激活共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因（ATM）和Rad-3 相關(guān)蛋白（ATR），并將DNA 損傷信號傳遞到下游靶蛋白和抑癌基因p53。p53 是細(xì)胞凋亡的主要參與者，它可以誘導(dǎo)促凋亡因子的轉(zhuǎn)錄激活以及對促存活因子的抑制。Chen T.等研究結(jié)果顯示，硒代半胱氨酸在A375、HepG2 和MCF7 細(xì)胞系中可以誘導(dǎo)劑量依賴性的細(xì)胞凋亡作用，且引起細(xì)胞內(nèi)的ROS 濃度的顯著提高。此外，在HepG2 和MCF7 細(xì)胞中也觀察到DNA 鏈的斷裂[13]。他們對硒代半胱氨酸引起MCF7 細(xì)胞凋亡作用的進(jìn)一步研究表明，硒代半胱氨酸通過ROS 的產(chǎn)生介導(dǎo)線粒體功能障礙和p53 磷酸化誘導(dǎo)MCF7 細(xì)胞凋亡[17]。通過ROS 抑制劑谷胱甘肽（glutathione, GSH））抑制ROS可有效減少硒代半胱氨酸引發(fā)的細(xì)胞氧化損傷并減慢細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)一步證實(shí)了ROS 在硒代半胱氨酸參與的抗癌機(jī)制中的重要性[13]。研究發(fā)現(xiàn)，硒代半胱氨酸還可以通過觸發(fā)對硫氧還蛋白還原酶的抑制作用，介導(dǎo)氧化損傷的細(xì)胞凋亡來抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長[19]。另外，Bcl-2 蛋白家族對線粒體膜電位具有調(diào)節(jié)作用，降低其表達(dá)量會影響胞內(nèi)氧化還原平衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。硒代半胱氨酸通過調(diào)節(jié)Bcl-2 蛋白家族的表達(dá)和磷酸化導(dǎo)致線粒體膜電位流失，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞色素C 和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）從線粒體中釋放，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并誘導(dǎo)染色質(zhì)濃縮和DNA 降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17，18]。

硒代半胱氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與半胱氨酸類似，唯一不同的是半胱氨酸中的硫原子在硒代半胱氨酸中由硒原子取代。因此，在蛋白質(zhì)合成過程中，如果細(xì)胞中存在游離的硒代半胱氨酸，當(dāng)半胱氨酰-tRNA識別錯(cuò)誤導(dǎo)致硒代半胱氨酸取代半胱氨酸插入蛋白質(zhì)中時(shí)，就會導(dǎo)致蛋白沒有辦法正確折疊，進(jìn)一步導(dǎo)致未折疊蛋白效應(yīng)（unfolded protein response, UPR）的產(chǎn)生。UPR 致使未折疊蛋白被降解，蛋白合成減慢，蛋白質(zhì)功能受損，細(xì)胞凋亡蛋白基因生成，促使合成細(xì)胞凋亡蛋白酶，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡蛋白酶抑制劑可抑制由細(xì)胞凋亡蛋白酶引起的細(xì)胞凋亡反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了硒代半胱氨酸可導(dǎo)致由未折疊蛋白效應(yīng)引起的細(xì)胞凋亡[20]。

除細(xì)胞凋亡途徑外，研究顯示，經(jīng)過硒代半胱氨酸處理的稀細(xì)胞中，大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白發(fā)生改變，且伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡的形成。這表明細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞自體吞噬[20]。

4 結(jié)語

硒代半胱氨酸被認(rèn)為是核糖體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成中的第21 個(gè)氨基酸，其復(fù)雜的特異性插入系統(tǒng)由UGA 密碼子指導(dǎo)?；旧纤幸驯碚鞯奈鞍锥际茄趸€原酶，其中硒代半胱氨酸位于催化活性位點(diǎn)并顯示出氧化還原活性。顯然，硒代半胱氨酸獨(dú)特的催化性質(zhì)是這些蛋白中使用硒的原因，包括硒代半胱氨酸的親核性，與半胱氨酸相比較低的pKa值，其作為離去基團(tuán)的能力以及氧化還原電勢。這些特性可以通過半胱氨酸進(jìn)行部分補(bǔ)償，例如大多數(shù)硒蛋白的硒代半胱氨酸被半胱氨酸取代時(shí)，會保留約1%的活性。但相比較而言，硒代半胱氨酸的活性顯示出了更強(qiáng)的優(yōu)越性[21]。

硒蛋白在生命體調(diào)節(jié)中起到重要作用，例如硫氧還蛋白還原酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞不受ROS 損傷中具有關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，硫氧還蛋白還原酶在癌細(xì)胞中濃度顯著升高，與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性有關(guān)。因此，硫氧還蛋白還原酶可作為癌癥治療的靶標(biāo)，抑制其活性可以在癌癥的預(yù)防和治療中起到重要作用。而硒代半胱氨酸作為硫氧還蛋白還原酶的活性中心，可以作為抑制酶活性的反應(yīng)中心。例如Pan S.等開發(fā)了含有兩個(gè)Se-N 鍵的含硒小分子，在還原條件下，兩個(gè)Se-N 鍵可以與硫氧還蛋白還原酶中硒代半胱氨酸和半胱氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)Se-H 鍵和S-H 鍵反應(yīng)，分別形成Se-Se 鍵和Se-S鍵。而新鍵的形成可以破壞硫氧還蛋白還原酶的還原催化，從而抑制硫氧還蛋白還原酶的活性，導(dǎo)致ROS 水平升高，引發(fā)癌細(xì)胞的凋亡[12]。

硒代半胱氨酸分子對多種癌細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性作用，作為潛在藥物分子，硒代半胱氨酸對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞毒性機(jī)理以及在藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用已經(jīng)被廣泛研究。He L.等開發(fā)了多孔氧化硅納米粒子作為硒代半胱氨酸分子的藥物遞送載體，此多功能納米粒子的表面連接TAT 細(xì)胞穿透肽和轉(zhuǎn)鐵蛋白，顯著增強(qiáng)了其進(jìn)入HeLa 細(xì)胞的特異性，并且在酸性條件下，硒代半胱氨酸能夠被有效釋放且發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用[22]。Wang S.等將非病毒蛋白衣殼作為新型的硒代半胱氨酸的藥物遞送載體，硒代半胱氨酸分子通過共價(jià)鍵連接到蛋白衣殼內(nèi)部，在細(xì)胞中由GSH 等還原劑的作用下被完全釋放，并在多個(gè)癌細(xì)胞系中發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用[14]。硒代半胱氨酸還可以敏化HepG2 人肝癌細(xì)胞，與阿霉素共同使用并在體內(nèi)外實(shí)現(xiàn)抗癌協(xié)同作用[23]。正是由于硒代半胱氨酸分子引起廣泛的細(xì)胞毒性作用，使其成為潛在的抗癌藥物。因此，我們需要對其細(xì)胞毒性及毒性機(jī)理有更全面的理解，在不影響其有效性的前提下，提高細(xì)胞特異性及靶向性，更有針對性的將其作為抗癌藥物進(jìn)行研究。

總的來說，硒代半胱氨酸分子作為硒原子在體內(nèi)的主要存在形式，擁有復(fù)雜的生物合成系統(tǒng)，其參與的硒蛋白具有重要的生物調(diào)節(jié)作用且可作為潛在的癌癥治療靶標(biāo)，并且硒代半胱氨酸分子本身也是潛在的抗癌分子藥物。但是其毒性機(jī)理還需要進(jìn)一步深入系統(tǒng)的研究，成為硒代半胱氨酸分子進(jìn)一步作為抗癌藥物研究的基礎(chǔ)。