平菇病害調(diào)查及病原菌分離鑒定*

華 蓉，李建英，劉紹雄，羅孝坤，王小艷，劉春麗，張麗英，孫達(dá)鋒**

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省供銷(xiāo)合作社科學(xué)研究所，云南 昆明 650221；3.陸良爨鄉(xiāng)綠圓菇業(yè)有限公司，云南 曲靖 655601）

平菇 （Pleurotus ostreatus） 中文學(xué)名糙皮側(cè)耳，又名北風(fēng)菌、凍菌、蠔菇等，隸屬于擔(dān)子菌門(mén) （Basidiomycota） 層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 側(cè)耳科 （Plenrotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus）[1]，其因價(jià)格低廉、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。平菇中蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低，氨基酸含量豐富、種類(lèi)齊全，膳食纖維、碳水化合物和礦質(zhì)元素豐富，同時(shí)幾丁質(zhì)多糖、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸、多酚等生物活性物質(zhì)含量較高，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降膽固醇、增強(qiáng)免疫力、護(hù)肝、促進(jìn)大腦發(fā)育等多種醫(yī)療保健功效[2-7]。

我國(guó)是認(rèn)識(shí)平菇最早的國(guó)家，南宋時(shí)期的陳玉卓在《菌譜》中寫(xiě)到的“天花蕈”就是平菇[8]。平菇產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本較低，售價(jià)也相對(duì)較低。由于平菇市場(chǎng)需求量大，因此栽培面積較廣，產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度較快，目前已成為我國(guó)產(chǎn)量最大的四大食用菌栽培品種之一，也是我國(guó)經(jīng)濟(jì)效益較高的食用菌品種，具有較好的產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景[9]。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2019年平菇產(chǎn)量686.47萬(wàn)噸，比2018年增加42.95萬(wàn)噸[10]。平菇因其栽培技術(shù)門(mén)檻相對(duì)較低，適用的栽培基質(zhì)較多，栽培規(guī)模需求靈活，成為發(fā)展“一縣一業(yè)”和“一村一品”中的重點(diǎn)栽培品種，也是食用菌產(chǎn)業(yè)助推鄉(xiāng)村振興的主要品種。

陸良縣是云南省第一大高原平壩，水資源豐富，屬北亞熱帶冬干夏濕氣候，適合食用菌生長(zhǎng)，是云南省的食用菌大縣[11]。陸良縣平菇栽培規(guī)模位居全省首位，被中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)評(píng)為“平菇生產(chǎn)基地”，是云南省綠色食品牌-食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)縣，被列為“高原特色食用菌產(chǎn)業(yè)大縣”[12-13]。陸良縣平菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展優(yōu)勢(shì)明顯，但目前其平菇產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化生產(chǎn)程度不高，栽培技術(shù)規(guī)范化不夠，產(chǎn)業(yè)技術(shù)集成創(chuàng)新不足，菌種生產(chǎn)和管理技術(shù)參差不齊，栽培過(guò)程中問(wèn)題較多，且隨著栽培年限增加，病蟲(chóng)害問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，制約了平菇產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。通過(guò)對(duì)云南陸良縣平菇栽培過(guò)程中病害嚴(yán)重地區(qū)常見(jiàn)的病害及病原菌進(jìn)行研究，調(diào)查了病害發(fā)生的原因，并對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，以期能為云南陸良縣平菇栽培管理及病害防治提供理論依據(jù)，為平菇菌種選育過(guò)程中篩選抗病性強(qiáng)的優(yōu)良菌株提供供試菌株材料。

1 材料與方法

1.1 平菇病害調(diào)查和樣品采集

1.1.1 樣地概況

以云南省平菇栽培產(chǎn)量最大的陸良縣內(nèi)病害發(fā)生情況較為嚴(yán)重的地區(qū)，作為平菇病害調(diào)查地和樣品采集地。具體采樣地點(diǎn)為：馬街鎮(zhèn)趙官壩村（103°44′12.94″E，24°55′46.45″N，海拔 1 818 m），三岔河鎮(zhèn)黃家圩村 （103°43′42.27″E，25°1′36.83″N，海拔 1 804 m），板橋鎮(zhèn)河西堡村 （103°46′24.09″E，25°5′27.47″N，海拔 1 805 m），三岔河鎮(zhèn)三岔子村（103°44′1.50″E，25°2′44.45″N，海拔 1 799 m），小百戶(hù)鎮(zhèn)上壩村 （103°35′25.36″E，25°6′34.73″N，海拔1 933 m）。

1.1.2 病害調(diào)查和樣品采集

調(diào)查時(shí)間為2020年9月27日～28日，采集感染雜菌的平菇菌包。詳細(xì)記錄樣品采集地平菇栽培情況、發(fā)病時(shí)間、病害發(fā)生規(guī)律、病害癥狀特點(diǎn)和樣品采集時(shí)間等，并進(jìn)行編號(hào)。樣品裝入樣品采集袋中后，用冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

1.2 平菇病原菌分離鑒定

從病害情況調(diào)查結(jié)果可知，平菇病害主要由真菌引起，因此本次研究主要針對(duì)真菌進(jìn)行分離鑒定。

1.2.1 培養(yǎng)基制備

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、瓊脂1.5%～2.0%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、氯霉素0.01%、1/3 000孟加拉紅溶液10%，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖 2%、瓊脂1.5%～2.0%，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 病原菌分離與純化

在超凈工作臺(tái)進(jìn)行無(wú)菌操作，從染病的菌包上直接挑取小部分雜菌菌絲，接種在孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，置于24℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d～6 d后，挑取病原菌菌落邊緣部分菌絲或帶菌絲的培養(yǎng)基至PDA平板上進(jìn)行純化，重復(fù)操作直至獲得單一的菌落，于3℃～5℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株鑒定

采用rDNA ITS序列分析法[14-16]對(duì)純化的病原菌菌株進(jìn)行分析鑒定，樣品送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行DNA提取和測(cè)序，序列經(jīng)過(guò)DNASTAR軟件進(jìn)行拼接處理后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，下載與樣品序列相似度較高的序列，用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的系統(tǒng)學(xué)發(fā)育地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇常見(jiàn)病害調(diào)查結(jié)果與分析

陸良縣作為平菇栽培重點(diǎn)縣，栽培多年后病害問(wèn)題日益凸顯，通過(guò)本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陸良縣平菇病害主要以真菌感染為主。不同的管理方式和不同的栽培場(chǎng)所病害發(fā)生程度差異較大。調(diào)查結(jié)果詳見(jiàn)圖1和表1。

由圖1和表1可知，此次陸良縣平菇病害調(diào)查，共采集病害樣品8份，采集地5個(gè)，其中4份樣品（4號(hào)～7號(hào)）采集自同一個(gè)采集地的3家栽培戶(hù)和1家菌包生產(chǎn)公司（陸良爨鄉(xiāng)綠圓菇業(yè)有限公司）栽培基地。從調(diào)查結(jié)果可知，平菇病害在菌絲培養(yǎng)階段和出菇階段都有發(fā)生，主要癥狀是菌包內(nèi)部或出菇后的包口有雜菌感染，影響平菇產(chǎn)量。

圖1 平菇病害癥狀Fig.1 Symptoms of disease of Pleurotus ostreatus

從表1中可以看出，樣品1號(hào)和2號(hào)采集地的菌包由自己生產(chǎn)，常壓滅菌，菌絲培養(yǎng)階段開(kāi)始發(fā)生病害，且開(kāi)始感染的部位在菌包內(nèi)部，說(shuō)明感染是由菌包內(nèi)部滅菌不徹底引起的。樣品1號(hào)采集地病害發(fā)生很?chē)?yán)重，樣品2號(hào)采集地病害較輕。栽培戶(hù)自己進(jìn)行常壓滅菌有一定風(fēng)險(xiǎn)，如果滅菌不徹底，菌包內(nèi)部引起感染，感染情況較重的會(huì)嚴(yán)重影響出菇產(chǎn)量。樣品3號(hào)～8號(hào)菌包均來(lái)自正規(guī)廠(chǎng)家，高壓滅菌，菌絲培養(yǎng)階段不易發(fā)生病害，病害主要在出菇后產(chǎn)生。說(shuō)明公司統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)更能保障菌包的質(zhì)量，減少污染率。發(fā)生病害部位主要從包口開(kāi)始，說(shuō)明病害是從環(huán)境中感染引起。樣品7號(hào)為菌種生產(chǎn)公司的栽培基地，水分管理較差，病害為中度，其余5個(gè)栽培戶(hù)管理較為精細(xì)，病害均較輕。說(shuō)明在平菇栽培過(guò)程中，在保障菌包品質(zhì)的前提下，管理水平不足是造成病害加劇的主要原因。樣品1號(hào)采集地使用的品種平菇89是多年來(lái)平菇栽培中使用最多的品種，栽培戶(hù)自己進(jìn)行菌種多代轉(zhuǎn)接，可能導(dǎo)致了菌種的退化，抗病性降低，也是導(dǎo)致病害嚴(yán)重的原因之一。樣品2號(hào)采集地用的品種平菇9號(hào)是自己多年馴化選育出來(lái)的新品種，樣品3號(hào)～8號(hào)都是菌種公司集中生產(chǎn)使用的新品種平菇灰2，從調(diào)查結(jié)果來(lái)看，平菇9號(hào)和平菇灰2的抗病性都較好。

表1 平菇病害調(diào)查結(jié)果Tab.1 Investigation results of diseases of Pleurotus ostreatus

根據(jù)病害調(diào)查結(jié)果分析發(fā)生病害的主要原因有4種。

1） 常壓滅菌有一定風(fēng)險(xiǎn)，滅菌不徹底，有蟲(chóng)卵、雜菌殘留。加之夏季溫度高，在菌絲培養(yǎng)階段若翻堆不及時(shí)會(huì)導(dǎo)致菌包內(nèi)料溫升高，平菇菌絲抗病能力下降，雜菌就會(huì)從菌包內(nèi)部開(kāi)始發(fā)生，蔓延至整個(gè)菌棒。并且蟲(chóng)害還會(huì)加速整個(gè)場(chǎng)地菌包感染的蔓延速度，從而極大地影響產(chǎn)量。

2）正規(guī)廠(chǎng)家統(tǒng)一生產(chǎn)的菌包，有標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的操作流程和高壓滅菌設(shè)施，能夠在一定程度上保障菌包的品質(zhì)。但是在后期管理階段如果對(duì)水分的管理掌握不好，包口產(chǎn)生積水，也會(huì)導(dǎo)致菌包感染。在出菇后期，菌絲抵抗力變?nèi)?，感染就?huì)加劇。

3）栽培戶(hù)常年自己進(jìn)行菌包制作，如果菌種轉(zhuǎn)接次數(shù)過(guò)多，可能存在菌種退化的問(wèn)題。品種本身對(duì)病害的抗性變?nèi)?，也?huì)導(dǎo)致感染加劇。

4）平菇栽培一般可以采收三潮～五潮，從采收第一潮后，包口部位對(duì)外界病原菌的抵抗力會(huì)變?nèi)?。且隨著采菇潮數(shù)的增加菌絲抗感染能力會(huì)越來(lái)越弱，在采菇二潮～三潮后感染率就會(huì)增加。

2.2 平菇病原菌分離

從采集到的病害樣品中分離出優(yōu)勢(shì)病原菌，編號(hào)為PGB-1～PGB-8，分離結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。

由圖2、表2可知，從陸良縣5個(gè)地方8個(gè)樣地采集到的8份病害樣品中分離得到10個(gè)病原菌菌株。其中，5號(hào)和6號(hào)樣品中分別分離到2個(gè)菌株。

表2 病原菌分離情況Tab.2 Isolation of pathogenic fungi

圖2 病原菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of pathogenic fungi

2.3 基于rDNA序列的病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將 PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-5、PGB-5-1、PGB-6、PGB-6-1、PGB-7、PGB-8 十個(gè)病原菌菌株的rDNA ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，下載相似度較高且已在期刊發(fā)表的序列，同時(shí)下載了8個(gè)已發(fā)表的同屬序列作為對(duì)比序列，選取米根霉（Rhizopus oryzae）作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的系統(tǒng)學(xué)分類(lèi)地位，詳見(jiàn)圖3、表3。

由圖3和表3可知，PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8病原菌菌株與木霉屬的平菇木霉（T.pleuroti）ITS序列相似度達(dá)到100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上也聚在同一支系上，結(jié)合菌落形態(tài)可確定從6個(gè)樣品中分離到的病原菌菌株P(guān)GB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8均為平菇木霉（T.pleuroti）。PGB-5和PGB-6菌株與椰青霉菌（P.copticola）的序列相似度達(dá)100%，且系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚在同一支系，結(jié)合菌落形態(tài)可確定從5號(hào)樣品和6號(hào)樣品中分離到的PGB-5、PGB-6兩個(gè)菌株為椰青霉菌。PGB-5-1菌株與歧皺青霉（P.steckii）的序列相似度為99.83%，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚在同一支系上，結(jié)合菌落形態(tài)可確定菌株P(guān)GB-5-1為歧皺青霉（P.steckii）。菌株P(guān)GB-6-1與T.patella的序列相似度為99.64%，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚在同一支系上，結(jié)合菌落形態(tài)可確定菌株P(guān)GB-6-1為T(mén).patella。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

表3 基于ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表Tab.3 Phylogenetic tree analysis table based on ITS sequences

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

云南陸良縣平菇栽培過(guò)程中菌包感染是最為常見(jiàn)的病害癥狀，也是影響最為嚴(yán)重的問(wèn)題，主要發(fā)生在菌絲培養(yǎng)階段和第二潮菇采收后。菌絲培養(yǎng)階段發(fā)生病害的栽培地菌包基本是家庭式生產(chǎn)，常壓滅菌，病害發(fā)生原因?yàn)闇缇粡氐?，發(fā)生感染的初期雜菌與平菇菌絲一同生長(zhǎng)，后期雜菌逐漸覆蓋平菇菌絲，蔓延至整個(gè)菌包，菌包變軟、腐爛。

采收第二潮菇后開(kāi)始發(fā)生病害的栽培地菌包基本為公司集中生產(chǎn)，高溫高壓滅菌，相對(duì)而言菌包品質(zhì)更有保障。夏季氣溫升高、采菇后水分管理不當(dāng)?shù)那闆r下，易產(chǎn)生病害，多發(fā)生在包口，競(jìng)爭(zhēng)性真菌感染后逐漸向包內(nèi)蔓延至整個(gè)菌包。公司集中生產(chǎn)的菌包在不同的栽培基地表現(xiàn)出的污染情況有差異，說(shuō)明同樣的出菇包，后期產(chǎn)量和污染率與出菇階段的管理技術(shù)關(guān)系較大。因此，在平菇栽培過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)化的菌包制作和規(guī)范化的栽培管理能有效減少病害發(fā)生。

通過(guò)對(duì)分離純化后的病原菌進(jìn)行rDNA序列分析，結(jié)果表明導(dǎo)致平菇菌包感染的病原菌菌株P(guān)GB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8 均為木霉屬的平菇木霉（T.pleuroti），病原菌菌株P(guān)GB-5、PGB-6為青霉屬的椰青霉菌（P.copticola），菌株P(guān)GB-5-1為歧皺青霉（P.steckii），菌株P(guān)GB-6-1為 T.patella。

3.2 討論

通過(guò)本次研究，共從8個(gè)陸良縣平菇栽培地感染菌包中分離到10個(gè)病原菌菌株，其中樣品1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)和8號(hào)中均分離到木霉屬的平菇木霉（T.pleuroti），說(shuō)明平菇木霉是陸良縣平菇病害的主要病原菌，在病害發(fā)生后作為優(yōu)勢(shì)菌造成大面積危害，后期病害防治中應(yīng)對(duì)該種進(jìn)行針對(duì)性防御。樣品5號(hào)和6號(hào)中分別分離到2個(gè)菌株，有木霉屬真菌和青霉屬真菌，這兩個(gè)栽培場(chǎng)地病害較輕，尚未形成優(yōu)勢(shì)病原菌產(chǎn)生較大的危害。

不同地區(qū)的病原菌菌株可能有所差異，曹現(xiàn)濤[17]、崔紅麗[18]、顏一紅[19]、劉正慧[20]等的研究表明，木霉屬的長(zhǎng)枝木霉 （T.longibrachiatum）和側(cè)耳木霉（T.pleuroticola）、節(jié)從孢屬 （Arthrobotrys）、尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）是平菇、杏鮑菇、香菇、木耳等食用菌栽培生產(chǎn)中的主要病原真菌?？梢源_定的是，木霉屬真菌是平菇等食用菌栽培中的主要病原菌，且一旦發(fā)展為優(yōu)勢(shì)菌株產(chǎn)生大面積污染，將造成較大的損失，因此在實(shí)際生產(chǎn)和栽培中應(yīng)根據(jù)木霉屬真菌的生長(zhǎng)特性進(jìn)行針對(duì)性的防治。