黃傘栽培菌棒的真菌類雜菌多樣性研究*

高 琳，王守現(xiàn)，劉 宇，榮成博，宋慶港，廖燕玲，3，馮巧麗，秦文韜**

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所北京市食用菌工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西 百色 533000）

食用菌兼具食用和藥用價(jià)值，現(xiàn)已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的第五大作物，在脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[1]。近年來(lái)，隨著食用菌生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，食用菌菌種退化嚴(yán)重，生產(chǎn)中出菇設(shè)施、廠房老舊等問(wèn)題凸顯，食用菌病害發(fā)生日益嚴(yán)重[2]。真菌類雜菌是食用菌生產(chǎn)過(guò)程中的重要影響因素，污染普遍發(fā)生于食用菌制種期和發(fā)菌期，嚴(yán)重影響食用菌生長(zhǎng)發(fā)育，造成其減產(chǎn)，現(xiàn)已成為制約食用菌產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要瓶頸[3]。

在食用菌制種期和發(fā)菌期發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的真菌類雜菌，主要來(lái)源于青霉屬（Penicillium）、木霉屬（Trichoderma）、毛霉屬（Mucor）、鏈孢霉屬（Neurospora）、曲霉屬 （Aspergillus）、根霉屬 （Rhizopus）等[3-5]。這些真菌類雜菌與食用菌菌絲競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生存空間，進(jìn)而影響食用菌菌絲在培養(yǎng)料上的正常生長(zhǎng)，病害發(fā)生較輕時(shí)可導(dǎo)致局部范圍出菇少或形成斑點(diǎn)菇，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整批菌種或整床培養(yǎng)料報(bào)廢，損失嚴(yán)重。因此，明確食用菌生產(chǎn)過(guò)程中真菌類雜菌的多樣性至關(guān)重要[2，6]。

黃傘（Pholiota adiposa） 又稱多脂鱗傘、肥鱗傘、柳黃菇、柳蘑等，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales）球蓋菇科（Strophariaceae） 鱗傘屬（Pholiota），是一種食藥兼優(yōu)且具有較高商品價(jià)值的珍稀食用菌[7]。黃傘色澤鮮艷、肉質(zhì)滑嫩、香味濃郁，含有豐富的粗蛋白、粗多糖、氨基酸、維生素、微量元素及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且脂肪含量較低，是理想的綠色食品，具有很好的商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值[8]。但與其他食用菌相比，黃傘生產(chǎn)過(guò)程中更易受雜菌污染，特別是在發(fā)菌期間，菇房不潔凈、濕度大易導(dǎo)致真菌類雜菌污染的發(fā)生。當(dāng)前，關(guān)于導(dǎo)致黃傘栽培菌棒污染的真菌類雜菌多樣性的研究不足，缺乏抗雜性強(qiáng)的黃傘優(yōu)良品種，缺少有效的綜合防控措施。

通過(guò)對(duì)黃傘栽培生產(chǎn)過(guò)程中導(dǎo)致菌棒污染的真菌類雜菌進(jìn)行分離、純化、鑒定，明確不同黃傘菌株的抗雜性和其污染栽培菌棒上真菌類雜菌的多樣性，以期為黃傘生產(chǎn)過(guò)程中真菌類雜菌的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

研究收集了課題組前期制作的25株黃傘菌株的污染栽培菌棒。黃傘菌株栽培菌棒的配方為棉籽殼50%、木屑30%、麥麩18%、石灰2%，含水量為67%。

1.2 主要試劑

真菌基因組DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖凝膠電泳DNA Marker（1 kb Plus DNA Ladder），天根生化科技（北京）有限公司；PCRMix聚合酶，日本Takara公司；瓊脂糖，美國(guó)Life Technologies公司。

1.3 主要儀器

DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；S1000TM PCR擴(kuò)增儀、凝膠呈像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.4 培養(yǎng)基

PDA綜合培養(yǎng)基：去皮土豆200 g煮熟取濾液，葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、無(wú)水硫酸鎂1.5 g、蛋白胨5 g、維生素B110 mg，去離子水定容至1 L。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 不同黃傘菌株栽培菌棒污染情況調(diào)查

課題組前期制作了25株黃傘菌株的栽培菌棒，每個(gè)菌株30棒，共計(jì)750棒，在黃傘栽培菌棒菌絲生長(zhǎng)12 d后檢查污染情況。污染率（P，%）的計(jì)算公式為：

P=N/M×100%

式中：N為污染的菌棒數(shù)量（棒）；M為該菌株栽培菌棒總數(shù)量（棒）。

1.5.2 不同黃傘菌株污染菌棒上真菌類雜菌的分離與純化

挑選黃傘栽培污染菌棒31棒，使用75%酒精擦拭菌棒表面，用無(wú)菌手術(shù)刀于污染部位劃開(kāi)小口，挑取適量真菌類雜菌置于PDA綜合培養(yǎng)基上，置于25℃黑暗培養(yǎng)；待菌落長(zhǎng)至合適大小時(shí)挑取部分菌絲置于新的PDA綜合培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)，用于后續(xù)的DNA提取及菌株保藏。

1.5.3 不同黃傘菌株污染栽培菌棒上真菌類雜菌的多樣性分析

根據(jù)基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取真菌類雜菌的基因組DNA，并以此作為模板，采用通用引物 ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 和ITS5 （5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’） 對(duì)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（50 μL）：DNA模板2 μL，2×PCR Mix 25 μL，引物（10 μmol·L-1）各 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物5 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將合格PCR產(chǎn)物送至北京諾賽公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，相似度高于97%則認(rèn)為是同一個(gè)種[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃傘菌株栽培菌棒污染情況

為明確不同黃傘菌株栽培菌棒的污染情況，評(píng)價(jià)不同黃傘菌株的抗雜性，各菌株污染率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖1。

圖1 25個(gè)黃傘菌株栽培菌棒的污染情況Fig.1 Contamination of the artificial bed-logs of 25 Pholiota adiposa strains

由圖1結(jié)果顯示，25個(gè)黃傘菌株的栽培菌棒發(fā)生真菌類雜菌污染的情況存在較大差異，說(shuō)明不同黃傘菌株的抗雜性存在差異，其中菌株JZB2116049栽培菌棒的污染率最高，達(dá)93.55%；其次是菌株JZB2116060、PW007、JZB2116056、JZB2116004 的栽培菌棒，污染率為83.33%；菌株JZB2116061和菌株JZB2116016栽培菌棒的污染率最低，說(shuō)明這兩個(gè)菌株抗雜性最強(qiáng)，可在后期黃傘優(yōu)異種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與黃傘的工廠化生產(chǎn)中重點(diǎn)考察。

2.2 不同黃傘菌株栽培菌棒真菌類雜菌的分離與鑒定

利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對(duì)不同黃傘菌株栽培菌棒上的真菌類雜菌進(jìn)行分離、純化，從25株黃傘菌株的31個(gè)污染栽培菌棒中共分離出純培養(yǎng)菌株67株，其形態(tài)學(xué)特征和ITS序列信息統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，真菌類雜菌中青霉屬的分離比例最高，為41.53%（27株）；曲霉屬的分離比例為38.46%（25株）；木霉屬的分離比例為12.31%（8株）；阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）、耐鹽枝孢菌 （Cladosporium halotolerans）、輪枝菌（Lecanicillium sp.）、疣孢籃狀菌（Talaromyces verruculosus） 等各1株～2株。

表1 供試黃傘菌株及其栽培菌棒上分離得到的真菌類雜菌信息Tab.1 Information of the tested Pholiota adiposa strains and their contaminated fungi isolated from the artificial bed-logs of the tested Pholiota adiposa strain

2.3 不同黃傘菌株栽培菌棒真菌類雜菌的多樣性

不同黃傘菌株栽培菌棒真菌類雜菌的多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，不同黃傘菌株污染栽培菌棒上真菌類雜菌的種類存在差異。在眾多真菌類雜菌中，青霉屬造成的黃傘栽培菌棒污染具有普遍性，如桔青霉（P.citrinum） 可污染JZB216030、JZB216011、JZB216016等黃傘菌株，而曲霉屬和木霉屬僅對(duì)部分黃傘菌株栽培菌棒的污染率較高，如黃曲霉（A.flavus）對(duì)JZB216049菌株的污染率高達(dá)93.55%；赭曲霉（A.ochraceus） 對(duì)PW007菌株的污染率高達(dá)83.33%?？闺s性較強(qiáng)的菌株JZB216061和JZB216016均只被桔青霉（P.citrinum）污染。

表2 分離得到的主要真菌類雜菌對(duì)不同黃傘菌株栽培菌棒的污染情況Tab.2 Aggressiveness of contaminated fungi isolated to the artificial bed-logs of different Pholiota adiposa strains

從黃傘JZB216003菌株污染栽培菌棒上分離出的真菌類雜菌最多，共分離得到了4種青霉，其株數(shù)與種類均多于其他24個(gè)黃傘菌株；污染率較高的4個(gè)黃傘菌株（JZB2116060、PW007、JZB2116056、JZB2116004）污染栽培菌棒上分離得到的真菌類雜

菌多為曲霉和木霉，如菌株JZB21160污染菌棒上分離得到的真菌類雜菌來(lái)自于2個(gè)屬，曲霉屬的A.westerdijkiae、Aspergillus sp.以及籃狀菌屬中的疣孢籃狀菌（T.verruculosus），菌株P(guān)W007污染菌棒上分離得到的真菌類雜菌為曲霉屬中的赭曲霉（A.ochraceus）和未鑒定種（Aspergillus sp.），菌株JZB2116056污染菌棒上分離得到的真菌類雜菌為曲霉屬中的聚多曲霉（A.sydowii）和A.westerdijkiae，菌株JZB2116004污染菌棒上分離得到的真菌類雜菌為木霉屬的未鑒定種（Trichoderma sp.）。

不同真菌類雜菌對(duì)黃傘菌株栽培菌棒的污染能力存在較大差異。青霉屬中，桔青霉（P.citrinum）在10株不同黃傘菌棒上均能分離得到，短密青霉（P.brevicompactum） 在3株不同黃傘菌棒上分離得到，咖啡青霉（P.coffeae）、草酸青霉（P.oxalicum）和奧爾森青霉（P.olsonii）均只在黃傘菌株JZB2116003的栽培菌棒中分離得到，產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum）只在黃傘菌株JZB2116063的栽培菌棒中分離得到；曲霉屬中，聚多曲霉（A.sydowii）在4株不同黃傘菌棒上分離得到，A.westerdijkiae在3株不同黃傘的栽培菌棒上分離得到，黃曲霉（A.flavus） 在2株不同黃傘菌棒上分離得到，赭曲霉（A.ochraceus） 只在黃傘菌株P(guān)W007的栽培菌棒中分離得到、孔曲霉（A.ostianus） 只在黃傘菌株JZB2116046的栽培菌棒中分離得到，爪甲曲霉（A.unguis） 只在黃傘菌株JZB2116036的栽培菌棒中分離得到；木霉屬中，深綠木霉（T.atroviride） 在2株不同黃傘菌株（JZB2116034和JZB2116055） 的栽培菌棒上分離得到，哈茨木霉（T.harzianum） 只在黃傘菌株JZB2116034的栽培菌棒中分離得到。

此外，由于真菌類雜菌形態(tài)復(fù)雜，且單基因序列信息存在局限性，部分菌株很難鑒定到種，需要進(jìn)一步結(jié)合多基因序列分析確定其分類地位。

3 討論

通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法研究了不同黃傘菌株污染栽培菌棒上真菌類雜菌的多樣性，結(jié)果顯示，發(fā)菌期間發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的真菌類雜菌主要有木霉屬、青霉屬及曲霉屬三大類，這與前人研究結(jié)果表明食用菌生產(chǎn)上主要的真菌類雜菌包括木霉屬、青霉屬和曲霉屬相吻合[3-4，10-11]。目前已知的能引起食用菌病害的木霉主要有8種[2，12-13]、青霉有13種[14-15]、曲霉有 8 種[2，4-5，16-18]；對(duì)黃傘菌株污染栽培菌棒上真菌類雜菌的研究結(jié)果顯示，能夠污染黃傘栽培菌棒的主要真菌類雜菌有2種木霉、6種青霉、7種曲霉，且不同真菌類雜菌對(duì)黃傘菌株栽培菌棒的污染能力存在差異，如桔青霉（P.citrinum） 在黃傘栽培菌棒中污染最普遍，可污染10個(gè)不同黃傘菌株的栽培菌棒。因此在真菌類雜菌防控時(shí)應(yīng)考慮雜菌的種類，對(duì)癥采取措施，避免延誤防控時(shí)機(jī)，造成損失。

4 結(jié)論

不同黃傘菌株的抗雜性存在差異，其中菌株JZB216061和菌株JZB216016的抗雜性較強(qiáng)，具有開(kāi)發(fā)潛力；菌株JZB216003抗雜性最差，分離獲得的真菌類雜菌的株數(shù)與種類最多。青霉屬、曲霉屬和木霉屬是造成黃傘栽培菌棒污染的主要真菌類雜菌，其中青霉污染最為普遍，曲霉和木霉僅對(duì)部分黃傘菌株栽培菌棒的污染率很高。不同真菌類雜菌對(duì)黃傘菌株栽培菌棒的污染能力存在較大差異。因此，在黃傘栽培過(guò)程中，應(yīng)差異化防控相應(yīng)的真菌類雜菌，重點(diǎn)防控污染普遍的真菌類雜菌。在本研究中，桔青霉（Penicillum citrinum） 在黃傘栽培菌棒中的污染最普遍，甚至抗雜性較強(qiáng)的菌株JZB216061和菌株JZB216016也被其污染。因此，在栽培過(guò)程中應(yīng)重點(diǎn)防護(hù)，但這兩株黃傘的抗雜機(jī)制及其與桔青霉的互作機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本文的研究結(jié)果將為黃傘安全生產(chǎn)及其栽培菌棒上真菌類雜菌的防控及黃傘的工廠化生產(chǎn)提供理論數(shù)據(jù)。