巨大革耳子實體不同發(fā)育階段化學(xué)成分的比較*

劉 靜，李維煥，王華麗，劉 偉，吳其平，程顯好**

（1.魯東大學(xué)后勤處，山東 煙臺 264025；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東省食用菌技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺264025；3.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院科技處，山東 威海 264210；4.山東利農(nóng)菌業(yè)有限公司，山東 東營 257442）

巨大革耳 [Panus giganteus(Berk.)Comer.]又名豬肚菇、大杯香菇、大杯傘、大漏斗菇、大杯蕈等，是一種高溫菇[1]，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes） 多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）革耳屬（Panus Fr.）。

巨大革耳的營養(yǎng)成分已由部分研究報道。其蛋白質(zhì)含量同香菇相近，氨基酸含量高于一般食用菌，特別是其中的異亮氨酸和亮氨酸含量突出；其子實體菌蓋因蛋白質(zhì)含量高且纖維素含量低，并含有 Na、Mg、Ca、K、Fe、Cu、Mn 和 Zn，以及 S、P等元素[2]，食用價值更高，而菌柄纖維化程度較高，食用價值受到影響[3-6]。戚夢等[7]的研究結(jié)果表明，巨大革耳子實體多糖是由甘露糖、葡萄糖等7種單糖組成的雜多糖，其中葡萄糖含量最多。陳睿等[8]研究認(rèn)為其子實體多糖由摩爾比不同的糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成。巨大革耳子實體中還含有阿魏酸酯[9]、凝集素[10]等物質(zhì)。干玉娟等[11]從巨大革耳中分離得到過氧麥角甾醇等4個化合物。其他藥理試驗研究表明，巨大革耳具有抗腫瘤活性[12-13]、抗氧化活性[14-16]、保肝護(hù)肝活性[17]和調(diào)節(jié)血脂等功能[18]。

在巨大革耳的生長發(fā)育過程中，子實體的不同發(fā)育階段物質(zhì)積累和化學(xué)成分含量會產(chǎn)生變化，目前相關(guān)研究較少。為確保巨大革耳的品質(zhì)，需要明確巨大革耳子實體不同生長期化學(xué)成分的變化，以確定采收時機(jī)。

選擇巨大革耳4個典型生長發(fā)育時期（棒形期、釘頭期、杯形期、折卷期）的子實體，對其醇提物進(jìn)行分析，探討其小分子成分的變化規(guī)律，為巨大革耳規(guī)范化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

Waters ACQUITY UPLC-Vion IMS Q-TOF超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、北京賽多利斯CPA225D型分析天平、Millipore超純水儀、湖南湘儀臺式高速離心機(jī)。Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，美國沃特世公司。

色譜純甲醇/乙腈購自美國Thermo Fisher公司，色譜純甲酸購自德國Fluka公司。

1.2 樣品及處理方法

巨大革耳4個典型生長發(fā)育時期的子實體樣品，從乳山市鑫寶食用菌專業(yè)合作巨大革耳栽培大棚中采集。每個時期樣品采集鮮重1 000 g以上，分別編號為1號～4號。樣品采集后，置于干燥箱60℃烘干至恒重。粉碎后過80目篩備用。

分別取樣品1號～4號的粉末各20 mg，各加入甲醇1 mL，置于60℃溫水中，超聲提取60 min，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

1.3 定性分析色譜條件

柱溫40℃，流動相A為0.1%甲酸的超純水，流動相B為乙腈，流速為0.3 mL·min-1，梯度洗脫模式色譜分離，其程序見表1。

表1 LC/MS-Q-TOF梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution in LC/MS-Q-TOF

1.4 定性分析質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子化方式（ESI）、負(fù)離子采集方式，以MSE模式全掃描分析，離子掃描范圍（m/z）為 50～1 000；采用6 eV的低能電壓、20 eV～50 eV的高能電壓模式；離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為400℃；脫溶劑氣流速為800 L·h-1；毛細(xì)管電壓為2.5 kV。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC/Q-TOF MSE） 模式采集數(shù)據(jù)，UNIFI軟件對結(jié)果進(jìn)行精確質(zhì)量篩查（accurate mass screening）分析。檢索文獻(xiàn)，建立樣品成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，保存化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式為.mol格式文件，導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，UNIFI軟件自動篩查鑒定。結(jié)合理論精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子、相對保留時間和匹配軟件元素構(gòu)成、質(zhì)量碎片及有關(guān)文獻(xiàn)做最終確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體成分分析

采集的巨大革耳4個典型的生長發(fā)育時期的子實體樣品見圖1。

由圖1所示，巨大革耳的子實體4個典型生長發(fā)育時期的形態(tài)有顯著區(qū)別。棒形期呈保齡球狀，菌傘尚未發(fā)育；釘頭期呈釘子狀，菌傘剛剛發(fā)育形成；杯形期的菌傘呈漏斗狀或杯狀；折卷期的菌傘出現(xiàn)了折卷、扭曲現(xiàn)象，各樣品總離子流色譜圖見圖2。

圖1 巨大革耳子實體不同發(fā)育階段Fig.1 Different developmental stages of Panus giganteus fruit body

圖2所示，4個不同發(fā)育時期的成分（出峰時間） 對應(yīng)關(guān)系明顯，分離度較好。在15 min、27 min、31 min、45 min出現(xiàn)的特征峰，都呈現(xiàn)出明顯的消長規(guī)律。共鑒定出63種化學(xué)成分，氨基酸類15種、核苷酸類4種、脂肪酸類8種、糖類4種、有機(jī)酸8種、酚類10種、醌類6種、甾體類3種、其他成分5種。

圖2 樣品總離子流色譜圖Fig.2 Sample total ion chromatogram

2.2 氨基酸類成分分析

游離氨基酸是食物呈味的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，游離氨基酸中，谷氨酸、天門冬氨酸可以構(gòu)成食物的鮮味；甘氨酸、丙氨酸和色氨酸具有甜味[19]。巨大革耳子實體氨基酸類成分色譜峰面積比較結(jié)果見表2。

由表2所示，4個發(fā)育時期中，游離氨基酸總量在棒形期、釘頭期較高，這是子實體發(fā)育最快的階段，組織代謝旺盛，表現(xiàn)在游離氨基酸含量更高。杯形期和折卷期游離氨基酸含量開始降低，表明子實體生理代謝的速率呈逐漸下降趨勢。

表2 氨基酸類成分色譜峰面積比較Tab.2 Comparison of chromatographic peak areas of amino acid

巨大革耳子實體中，鮮味氨基酸（谷氨酸、焦谷氨酸和天門冬氨酸）含量在不同發(fā)育階段均較高，其中谷氨酸在釘頭期最高，天門冬氨酸在杯狀期最高，焦谷氨酸在棒狀期最高，谷氨酸和天門冬氨酸總含量在杯狀期最高，到折卷期鮮味成分含量明顯衰減。而甜味氨基酸（甘氨酸、丙氨酸和色氨酸）含量在4個發(fā)育時期均不高，表明氨基酸對巨大革耳的甜味貢獻(xiàn)度不高。

游離氨基酸中含量最突出的是脯氨酸，在4個發(fā)育時期中均為含量最高的游離氨基酸，明顯高于其他氨基酸幾倍到幾十倍。這可能與巨大革耳的耐高溫出菇特性有關(guān)。研究表明，生物在脅迫條件下會發(fā)生相應(yīng)的復(fù)雜應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生脯氨酸是常見應(yīng)激反應(yīng)之一[20]。作為一種小分子滲透保護(hù)物質(zhì)，脯氨酸在抵御逆境脅迫中可以作為滲透調(diào)節(jié)劑[20]、活性氧清除劑[21]、氧化還原平衡劑[22]及蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑[23-24]等。植物受到重金屬脅迫[25]、堿脅迫[26]、鹽脅迫[27]和高溫干旱[28]等脅迫時都會積累大量脯氨酸。巨大革耳作為一種于盛夏季節(jié)出菇的高溫品種，進(jìn)化出耐受高溫脅迫的能力，脯氨酸的大量產(chǎn)生可能與此相關(guān)。

與其他游離氨基酸在4個發(fā)育時期變化規(guī)律不同的是鳥氨酸，其在后2個時期含量更高，含量最高的是杯形期。L-鳥氨酸是一種非蛋白類氨基酸參與尿素代謝及生物多胺類的合成，其對人體具有治療肝臟疾病、增強(qiáng)免疫力等作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品等領(lǐng)域[29]。

2.3 核苷酸類成分分析

4種核苷酸類成分在巨大革耳不同發(fā)育時期的含量變化情況見表3。

表3 核苷酸類成分色譜峰面積比較Tab.3 Comparison of chromatographic peak areas of nucleotide components

由表3可知，除尿苷酸外，其他3種核苷酸在最后階段都有顯著增加，可能與細(xì)胞衰老后核酸成分的自降解有關(guān)。

2.4 脂肪酸類成分分析

8種脂肪酸在巨大革耳不同發(fā)育時期的含量變化情況見表4。

由表4可知，無論是飽和脂肪酸（二十酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸）還是不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸、亞麻酸），隨著子實體的發(fā)育，都呈現(xiàn)累積增多的趨勢。在8種脂肪酸種，油酸和亞油酸含量在4個發(fā)育時期中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它脂肪酸含量。

表4 脂肪酸類成分色譜峰面積比較Tab.4 Comparison of chromatographic peak areas of fatty acid components

2.5 糖類成分分析

4種小分子糖類成分在巨大革耳不同發(fā)育時期的含量變化情況見表5。

表5 糖類成分色譜峰面積比較Tab.5 Comparison of chromatographic peak areas of sugar components

由表5可知，甘露糖和木糖在巨大革耳棒狀期子實體中含量最高，隨著子實體的發(fā)育和衰老，逐漸呈降低趨勢；果糖和海藻糖含量則隨著子實體的發(fā)育逐漸累積。尤其是海藻糖在子實體4個發(fā)育時期中含量均最為突出。海藻糖具有保濕和細(xì)胞保護(hù)功能，能幫助有機(jī)體對抗各種嚴(yán)酷環(huán)境以保持有機(jī)體的生物活性，如干燥、冰凍、高溫、高滲等狀態(tài)[30]。巨大革耳在其子實體中大量積累海藻糖，也是其應(yīng)對高溫脅迫的重要生理生化手段。

2.6 有機(jī)酸類成分分析

有機(jī)酸類在巨大革耳不同發(fā)育時期的含量變化情況見表6。

表6 有機(jī)酸類色譜峰面積比較Tab.6 Comparison of chromatographic peak areas of other organic acids

由表6可知，檢測到的8種有機(jī)酸中，含量較高的是檸檬酸和蘋果酸，其中檸檬酸在釘頭期最高，蘋果酸在杯狀期最高。這2種有機(jī)酸是食品飲料中最常用的酸味調(diào)節(jié)劑，也是參與三羧酸循環(huán)中的2種有機(jī)酸，對食物的營養(yǎng)及風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[31]。

4-羥基苯甲酸有抑菌效果，另外咖啡酸、沒食子酸、烏頭酸，都是首次在巨大革耳子實體中檢出，這幾種有機(jī)酸均在子實體最后的衰老階段積累最多，作為次生產(chǎn)代謝產(chǎn)物，和衰亡相關(guān)[32]。

2.7 酚類成分分析

多酚類成分是一類次級代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的抗氧化性，對預(yù)防心血管疾病等慢性疾病有一定的作用，并且能作為抗氧化劑廣泛應(yīng)用于食品、藥品等眾多領(lǐng)域[33]。多酚化合物含有多個羥基，而羥基是清除自由基的主要基團(tuán)，羥基越多，清除自由基活性的能力越強(qiáng)[34]。大型真菌的次級代謝產(chǎn)物一般伴隨有性生殖過程發(fā)生[35]。有機(jī)酸類在巨大革耳不同發(fā)育時期的含量變化情況見表7。

表7 酚類成分色譜峰面積比較Tab.7 Comparison of chromatographic peak areas of phenolic components

由表7可知，結(jié)果分析檢測出10種多酚類產(chǎn)物，不同產(chǎn)物在4個發(fā)育時期的變化規(guī)律不同，在所檢測到的10種多酚類成分中，在釘頭期和杯狀期檢測到了所有成分，種類最全；棒形期有4種成分未檢測到，折卷期有5種成分未檢測到。

巨大革耳中的多酚類成分相關(guān)研究尚缺乏報道。Bai等[36]從紫色絲膜菌（Cortinarius purpuascens） 的乙酸乙酯提取物中分離到4個具DPPH自由基清除活性的聚酮類化合物rufoolivacin、rufoolivacin C、rufoolivacin D和leucorufoolivacin。試驗在巨大革耳子實體中也檢測到了rufoolivacin C和rufoolivacin D兩種成分，rufoolivacin C隨著子實體發(fā)育過程減少，而rufoolivacin D隨發(fā)育過程累積。二者是否存在相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

楊梅素可用于預(yù)防關(guān)節(jié)炎和治療各種炎癥[37]；蕓香苷（蘆?。?有抗氧化、抗炎等多種生物活性[38]；原兒茶酸、兒茶素可抗菌、祛痰、平喘、抗腫瘤[39]，這些成分的分析，也為巨大革耳的生物活性研究提供了化學(xué)成分參考。

2.8 醌類成分分析

6種醌類成分在巨大革耳子實體不同發(fā)育時期的含量變化情況見表8。

由表8可知，除芥子醌外，其他5種醌類成分在最后階段均有顯著增加，特別是（3S，3’S，P） anthydrophlegmacin-9，10-quinone8’-O-methyl ether、verbindung cr11、verbindung cr60三種成分在衰老時增加明顯。這些成分的變化以及生理活性研究缺乏報道，其代謝累積是否和有機(jī)體衰老相關(guān)需要進(jìn)一步研究。

表8 醌類成分色譜峰面積比較Tab.8 Comparison of chromatographic peak areas of terpenoids

2.9 甾體類成分分析

3種甾體類成分在巨大革耳不同發(fā)育時期的含量變化情況見表9。

表9 甾體類成分色譜峰面積比較Tab.9 Comparison of chromatographic peak areas of steroidal components

由表9可知，除了（24R） -麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇在最后時期爆發(fā)性累積之外，另外2種成分在不同發(fā)育階段基本保持平衡。（24R） -麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇在衰亡期顯著增加，其原因需進(jìn)一步探討。

2.10 其他類成分分析

巨大革耳不同發(fā)育時期其他類成分含量變化情況見表10。

表10 其他類成分色譜峰面積比較Tab.10 Comparison of chromatographic peak areas of other components

由表10可知，腦苷脂B在巨大革耳子實體發(fā)育的杯狀期含量最高，且子實體中含量豐富。腦苷脂B有重要的生物學(xué)功能，如促進(jìn)細(xì)胞膜建成、胎兒大腦發(fā)育等[40]，為巨大革耳的子實體應(yīng)用價值提供了理論依據(jù)。維生素C在生長發(fā)育后期含量更高，可能與抗氧化活性相關(guān)。維生素B2在發(fā)育最后階段大量累積，也可能與細(xì)胞衰亡相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

采取超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對巨大革耳子實體不同發(fā)育階段的成分進(jìn)行分析，與其風(fēng)味和營養(yǎng)相關(guān)的成分既有初級代謝產(chǎn)物，又有次級代謝產(chǎn)物。從含量方面分析，多在釘頭期和杯型期階段更高。而巨大革耳作為一種食品，其風(fēng)味應(yīng)首先考慮，也需兼顧產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，因此采收期應(yīng)為杯形期。一旦進(jìn)入折卷期，機(jī)體開始衰老，有效成分迅速降低，個別次級代謝產(chǎn)物則大量積累，造成產(chǎn)品品質(zhì)劣化。試驗結(jié)果為巨大革耳的采收時間的確定提供了理論參考。

值得注意的是，部分企業(yè)通過品種選育，獲得了專門在棒狀期收獲的品種，商品名為“白蘆菇”[2]。棒狀期并非巨大革耳適宜的收獲期，但因其形態(tài)的獨特性和差異性，可以在市場上實現(xiàn)差異化競爭，獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益。

巨大革耳化學(xué)成分非常復(fù)雜，此研究僅針對該次檢測得到的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析，并未涉及大分子成分，如蛋白質(zhì)、多糖等。這些大分子成分的變化情況有待于進(jìn)一步的研究。