紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用*

陳翠翠，方 曄，鞏玉輝，莊繼文，張 軍

（貴州金蟾大山生物科技有限責(zé)任公司，貴州 畢節(jié) 553300）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvata），屬于鬼筆科 （Phallaceae） 竹蓀屬 （Dictyophora）[1]。子實體具有氣息清香、味道鮮美、肥厚脆嫩、久煮不爛等特點，深受廣大消費者的喜愛，市場需求量巨大。目前，常規(guī)紅托竹蓀菌種的生產(chǎn)多采用固體培養(yǎng)基，而該菌種的生物學(xué)特性決定了其生長周期較長，一般母種、原種、栽培種三級培養(yǎng)周期需7個月[2-3]，導(dǎo)致生產(chǎn)效率不高，菌齡難以調(diào)整一致，在培養(yǎng)過程中往往存在瓶（袋）內(nèi)底部菌種還未長滿、上部菌種就已經(jīng)開始老化萎縮的現(xiàn)象。

在規(guī)?；a(chǎn)中，受菌種擴繁代數(shù)的影響，母種可能源于不同子實體分離的菌株，造成同批次菌袋出菇差異大等問題。另外，由于固體菌種生長周期長，菌種污染率也會隨著培養(yǎng)期延長而上升，生產(chǎn)中常因菌種挑選鑒別不細致，導(dǎo)致接種后菌袋污染率居高不下，造成嚴重經(jīng)濟損失。

紅托竹蓀液體菌種成功應(yīng)用于菌包工廠化生產(chǎn)，并于2020年生產(chǎn)工藝取得突破，經(jīng)不斷改進成熟，可將菌種培養(yǎng)周期縮短到50 d內(nèi)，接種成本降低近90%。目前，已利用此項技術(shù)生產(chǎn)菌包3 500多萬袋，并通過了大田出菇驗證。此技術(shù)的利用不僅大幅度提高了紅托竹蓀菌種生產(chǎn)效率，其生物轉(zhuǎn)化率也得到了明顯提高，為今后紅托竹蓀的工廠生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。以下將對該技術(shù)流程進行介紹。

1 紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)

1.1 菌種來源

選用金蟾大山生物科技有限責(zé)任公司選育的JCZS-14-33優(yōu)良紅托竹蓀菌種。

1.2 液體菌種生產(chǎn)過程

紅托竹蓀液體菌種常規(guī)的生產(chǎn)工藝流程見圖1。

圖1 紅托竹蓀液體菌種常規(guī)的生產(chǎn)工藝流程Fig.1 Production process of Dictyophora rubrovolvata liquid spawn

由圖1所示，紅托竹蓀液體菌種的制作包括母種的篩選、分離純化后母種的純培養(yǎng)、搖瓶擴大培養(yǎng)、發(fā)酵擴大培養(yǎng)、接種后菌包工廠化培養(yǎng)，直至菌絲長滿菌包用于栽培。

1.3 母種分離

紅托竹蓀母種培養(yǎng)是至關(guān)重要環(huán)節(jié)，母種品質(zhì)的優(yōu)劣，會直接影響產(chǎn)量高低和栽培成敗。母種分離主要包括子實體選擇、培養(yǎng)基制備、純種分離、轉(zhuǎn)管擴繁、菌絲培養(yǎng)、保存及使用等環(huán)節(jié)。

1.3.1 子實體選擇

選擇抗病性強、豐產(chǎn)、商品性狀好的優(yōu)良菌株作分離用種，子實體應(yīng)選擇無病害，近六成、七成熟，個體肥大、結(jié)實、頂端無凸起，包被無裂縫，內(nèi)部未分化的菌蕾（竹蛋）。菌蕾不可過大或者過小，采集適齡期的竹蛋利于分離出活力強、健壯的母種[1-4]。

1.3.2 菌種分離

采用組織分離法獲得母種菌絲體[3-4]。將選擇好的菌蕾，先用清水洗去表面泥土，再用75%酒精進行表面消毒后，于超凈工作臺紫外燈下照射15 min～20 min，對菌蕾進行表面滅菌和水分去除。后用無菌手術(shù)刀在無菌操作臺的酒精燈下，沿菌蕾表皮劃十字，露出子實層托，并將其切成0.2 cm～0.3 cm左右的小方塊（約如黃豆粒大?。杆俎D(zhuǎn)接到無菌平板培養(yǎng)皿或試管斜面培養(yǎng)基中，封口。

1.3.3 菌絲培養(yǎng)

將分離好的培養(yǎng)皿或試管放入22℃～25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d～3 d，待菌絲生長至直徑約3 cm，選取菌絲生長規(guī)則的培養(yǎng)皿或試管，挑取尖端內(nèi)部0.5 cm處的菌絲進行轉(zhuǎn)接純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接方法同常規(guī)[5]。紅托竹蓀菌絲生長較慢，生長速度每天約1.8 mm，一般長滿直徑9 cm的平板約需22 d～25 d，培養(yǎng)期間要定期檢查，及時挑選出污染和發(fā)菌慢的菌塊[6]。

1.3.4 菌種檢測

轉(zhuǎn)接純化的培養(yǎng)皿或試管的菌絲長滿培養(yǎng)基后，挑取未感染、菌絲生長均勻的培養(yǎng)皿或試管菌種，立即進行菌種的轉(zhuǎn)接擴繁，對分離菌種進行出菇測試。經(jīng)過出菇試驗后的菌種稱為一代菌種，保存作為生產(chǎn)擴繁菌種使用[7，9]。經(jīng)過經(jīng)驗總結(jié)，一代菌種感官檢測標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 一代母種感官檢測標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Sensory test standard of the first generation stock culture

由表1可知，在制作一代母種時培養(yǎng)基較一般食用菌厚度偏厚，菌絲要求生長均勻，具有無角變、生長不規(guī)則、無感染等特點，菌絲潔白、濃密，不會出現(xiàn)生長過快或者過慢的現(xiàn)象，具有穩(wěn)定性。

一代母種再經(jīng)一次提純擴繁后，稱為二代母種，是可供生產(chǎn)使用的主要菌種[5]。經(jīng)過經(jīng)驗總結(jié)，二代母種感官檢測標(biāo)準(zhǔn)及不同培養(yǎng)時間生長情況見表2、圖2。

由表2、圖2可知，優(yōu)質(zhì)二代母種培養(yǎng)20 d～25 d時菌絲可以長滿平板，菌絲生長均勻，生長速度穩(wěn)定、無角變、無感染、無顆粒狀、無刺激變紅菌絲，菌絲潔白、濃密，具有穩(wěn)定性。

圖2 不同培養(yǎng)時間生長情況Fig.2 Growth with different cultivation time

表2 二代母種感官檢測標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Sensory test standard of the second generation stock culture

1.3.5 菌種擴繁

由于食用菌菌種的生長特性，因此生產(chǎn)中要注意菌種的穩(wěn)定性[8-9]，注意觀察菌落形態(tài)是否正常，整批次培養(yǎng)時菌絲生長是否均勻，生長速度是否異常，有無雜菌污染、角變、色素產(chǎn)生、粉孢子產(chǎn)生等現(xiàn)象。因此，只有每個批次的二代菌種及N代菌種的感官標(biāo)準(zhǔn)均符合二代母種感官檢測標(biāo)準(zhǔn)，才能進行菌種擴繁，否則不可用于生產(chǎn)。

2 菌種培養(yǎng)基的制作

2.1 固體培養(yǎng)基的配方

土豆100 g（煮水過濾）、葡萄糖5 g、果糖25 g、蛋白胨5 g、硫酸銨2.5 g、雜木屑70 g（粒徑100目）、瓊脂粉18 g，水1 000 mL。

2.2 液體培養(yǎng)基的配方

葡萄糖5 g、果糖25 g、酵母粉1 g、硫酸銨2.5 g、磷酸二氫鉀1 g、玉米粉8 g、木屑80 g（粒徑100目，煮水過濾），水1 000 mL。

3 液體菌種制作

3.1 母種轉(zhuǎn)接

液體培養(yǎng)基裝入250 mL玻璃三角瓶內(nèi)封口，經(jīng)常規(guī)高壓滅菌冷卻后，連同經(jīng)挑選合格的母種一起，進行表面消毒后放置超凈工作臺上。按照無菌操作在工作臺酒精燈下，選取距離老菌塊中心2 cm～3 cm的菌絲，用解剖刀或打孔器，切成2 mm×2 mm小菌塊，迅速接入三角瓶中并封口。

3.2 搖瓶培養(yǎng)

將接種后的三角瓶放在恒溫搖床上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時間14 d。使用菌種前3 d時，在無菌環(huán)境下，接種菌種每瓶用移液槍取2 mL液體，平均接種到3個平板培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)，3 d后觀察菌絲萌發(fā)與污染情況，將經(jīng)檢測菌絲萌發(fā)不合格、有感染、生長狀態(tài)不佳等的菌種全部剔除。對檢測合格后的菌種進行平板拍照、搖瓶狀態(tài)拍照備案，即可供后續(xù)接種使用。

3.3 營養(yǎng)液制備與滅菌

按照2.2配方準(zhǔn)備所需的營養(yǎng)料用水稀釋，并充分溶于水中，倒入培養(yǎng)罐內(nèi)用凈化水補足至培養(yǎng)罐規(guī)定的水位。再經(jīng)通氣攪拌均勻后，取樣測定其理化指標(biāo)是否在規(guī)定范圍內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)后蓋上罐蓋并擰緊螺絲，啟動加熱進行滅菌。當(dāng)天配好的發(fā)酵液必須當(dāng)天滅菌。滅菌時要求培養(yǎng)罐內(nèi)液體溫度達到121℃～122℃，滅菌時間50 min～60 min[7]。滅菌結(jié)束后要盡快對培養(yǎng)罐進行降溫，以避免罐內(nèi)培養(yǎng)基繼續(xù)保持高溫導(dǎo)致水分過度揮發(fā)。在滅菌結(jié)束冷卻后嚴禁培養(yǎng)罐產(chǎn)生負壓，使罐壓保持在0.03 MPa～0.05 MPa以防止罐內(nèi)液體倒流發(fā)生污染。

3.4 接種

當(dāng)培養(yǎng)罐內(nèi)液體溫度冷卻至25℃～26℃時即可接種，接種時嚴格按照培養(yǎng)罐操作規(guī)程執(zhí)行。采用火焰接種法，將檢測好的搖瓶菌種接入培養(yǎng)罐中，接種完畢將罐壓調(diào)至0.02 MPa～0.03 MPa，溫度調(diào)至26℃進行通氣培養(yǎng)。根據(jù)實際生產(chǎn)要求，液體菌種在使用之前48 h、24 h必須進行取樣檢測分析，確保無任何雜菌感染后，方可應(yīng)用到生產(chǎn)中。

3.5 發(fā)酵培養(yǎng)

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，每天早上用二氧化碳測定儀檢測培養(yǎng)罐排氣口內(nèi)的二氧化碳含量，同時根據(jù)生產(chǎn)需求，調(diào)節(jié)通氣量、培養(yǎng)溫度等控制菌球大小。通氣量大時，菌球會不斷被打散變小；溫度低時，菌球生長慢、菌球大；溫度高時，菌球生長快、菌球小。檢測時應(yīng)對異常培養(yǎng)罐進行取樣分析，判斷是否污染。由于每種食用菌均有獨特的氣味，因此在檢測中凡是出現(xiàn)酸味、臭味，均視為已被細菌、霉菌等感染，應(yīng)立即停止培養(yǎng)罐工作，并取樣檢測分析原因。對感染的培養(yǎng)罐需經(jīng)過滅菌之后再進行清理，清理后要檢查、更換所有培養(yǎng)罐的配件，經(jīng)空消后才能使用。

3.6 液體菌種的使用

經(jīng)驗總結(jié)，當(dāng)培養(yǎng)罐內(nèi)營養(yǎng)液由濃稠變清透，菌球密度達到90%以上，二氧化碳處于上升階段，一般不超過0.3%，液體種產(chǎn)生小氣泡時說明菌絲發(fā)酵培養(yǎng)已經(jīng)成熟，經(jīng)檢測無污染即可用于生產(chǎn)。將接種管道按照無菌操作規(guī)程連接到培養(yǎng)罐，然后調(diào)整罐壓打開接種閥，通過人工或者液體接種機接至滅菌冷卻好的菌包中，接種量約40 mL～50 mL。接種后要立即轉(zhuǎn)入長菌室進行恒溫培養(yǎng)，前3天溫度為23℃～26℃，從第4天開始下調(diào)溫度為22℃～25℃，持續(xù)培養(yǎng)至菌絲長滿菌袋為止。紅托竹蓀液體菌種接種后，菌絲萌發(fā)時間為24 h～48 h，但萌發(fā)時間受培養(yǎng)室溫度、培養(yǎng)料水分和培養(yǎng)基pH等因素影響，會存在一定的差別。一般16.5 cm×35.0 cm×0.006 cm的栽培袋，從接種到菌絲發(fā)滿菌袋僅需70 d左右，菌種長滿袋后5 d～10 d即可用于栽培。

4 紅托竹蓀固體菌種與液體菌種的對比分析

4.1 生產(chǎn)工藝對比分析

紅托竹蓀固體菌種與液體菌種的生產(chǎn)工藝有很明顯的差異，固體生產(chǎn)與液體生產(chǎn)的具體工藝對照見圖3。

圖3 液體菌種與固體菌種工藝生產(chǎn)對比圖Fig.3 Production comparison of liquid spawn and solid spawn

由圖3可知，液體菌種的生產(chǎn)工藝與固體菌種的生產(chǎn)工藝相比省卻了原種、栽培種的生產(chǎn)、培養(yǎng)時間以及固定資產(chǎn)投入，減少了約6個月的制種周期。

4.2 菌種品質(zhì)對比分析

1） 周期短

液體菌種具有生產(chǎn)周期短、菌絲生長快的優(yōu)勢，紅托竹蓀的培養(yǎng)罐液體菌種培養(yǎng)7 d即可使用，而固體菌種則需要培養(yǎng)90 d以上。

2）菌齡一致且菌種活力高

紅托竹蓀的菌絲生長速度較慢，每天約生長1.8 mm～2.2 mm，因此傳統(tǒng)固體菌種生長到后期會存在底部菌種未長滿而上部菌種已出現(xiàn)老化、萎縮等現(xiàn)象。菌齡不一致，二者菌齡會相差3月～4月，由于菌種活力不一致，擴繁后差異會逐級擴大，導(dǎo)致最終的產(chǎn)量差異。液體菌種則可成功解決此難題，液體菌種培養(yǎng)時間一致，在菌種最佳活力期（二氧化碳未處于下降狀態(tài)，菌種濃度達標(biāo)）用于接種，接種后24 h～48 h可見萌發(fā)，解決了菌齡不一致的問題。

3） 污染率低

紅托竹蓀的菌絲活力很強，在生產(chǎn)中若挑選不及時會出現(xiàn)紅托竹蓀菌絲將雜菌覆蓋的現(xiàn)象，與其他食用菌不同，紅托竹蓀與雜菌間不會出現(xiàn)明顯的拮抗線，因此隱形污染率較大，且培養(yǎng)周期長又增加了菌種感染的風(fēng)險，在菌種使用過程中會逐級擴大污染[8]。傳統(tǒng)的固體菌種的污染率一般都在10%以上，但使用液體菌種在生產(chǎn)中若嚴格按照無菌操作，培養(yǎng)罐感染的風(fēng)險非常低，而且通過檢測可很快查出風(fēng)險培養(yǎng)罐，因此液體菌種的菌種純度可達100%，提升了紅托竹蓀菌種品質(zhì)。

5 結(jié)論

長期以來紅托竹蓀的菌種生產(chǎn)均采用固體菌種，但其菌絲生長速度慢的特性決定了其生長周期較長，造成生產(chǎn)效率不高，菌齡難以控制。在規(guī)模化生產(chǎn)中，受菌種擴繁倍數(shù)的影響，母種可能由不同竹蓀子實體的分離，造成遺傳基因多樣，同批次菌棒出菇差異大等問題，導(dǎo)致接種后菌棒污染率居高不下，造成嚴重經(jīng)濟損失[8，12-14]。而采用液體菌種生產(chǎn)方式制作紅托竹蓀出菇菌棒，可以極大地減少固體菌種的生長周期；液體菌種擴繁倍數(shù)的加大解決了固體菌種擴繁倍數(shù)小，母種需求量大的問題，液體菌種制作的所有菌包、菌種均為同一菌株，遺傳性狀穩(wěn)定。因此，紅托竹蓀液體菌種的應(yīng)用，將為紅托竹蓀大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供保障。