西藏野生雞腿菇菌塘土壤微生物群落多樣性*

尹 秀，陳 蕊，常 萌，孫自立，喬旭輝，祿亞洲**

（1.西藏農(nóng)牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學院西南大學藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心，西藏 林芝 860000）

雞腿菇（Copriuns comatus） 隸屬擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （A－garicales） 鬼傘科 （Psathyrellaceae） 鬼傘屬 （Coprinus），學名毛頭鬼傘，其形似雞腿，味近雞絲，因而又名雞腿蘑[1-2]。雞腿菇菌柄與菌蓋均呈圓柱狀，菌蓋包被狀，子實體較大[3]，肉質細嫩爽滑，鮮美可口，營養(yǎng)豐富[4]。其性平味甘，具有健脾助消，降糖消渴，清心安神之功效，亦可用于輔助治療痔瘡和糖尿病等，其多糖具有抗癌、防癌的特性[5-10]。

有植物第二基因組之稱的根際微生物群落，對植物生長有著至關重要的作用[11]，其組成及代謝影響著植物根際養(yǎng)分循環(huán)，可分為有益菌、中性菌和致病菌[12]。目前高通量測序技術日趨成熟，已在植物內生菌群落結構[13-18]和土壤微生物群落結構[19-22]等方面得到廣泛應用，然而在食用菌相關研究中利用極少，也未見利用高通量測序技術研究雞腿菇菌塘土壤微生物群落結構的相關報道。

以西藏林芝市野生雞腿菇菌塘土壤為試驗材料，分析野生雞腿菇菌塘土壤微生物群落結構及多樣性，以期為西藏自治區(qū)野生雞腿菇馴化及土壤有益菌種的分離利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用西藏林芝市 （29°39′15.87″N，94°22′04.84″E，海拔：3 000 m）野生雞腿菇菌塘土壤為試驗材料。手帶無菌手套，選擇10株野生雞腿菇，采集其菌塘深度為0～20 cm土壤樣品（采集時間為2020年7月），將10個土壤樣品混合，過無菌的3 mm孔徑的篩網(wǎng)，置于無菌采樣袋中用低溫采樣箱帶回實驗室，-20℃保存?zhèn)溆?。設3個重復，分別記為菌塘土壤樣本 （S1、S2、S3）。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA及PCR擴增

依據(jù)參考文獻[23-24]，使用土壤DNA提取試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司）提取雞腿菇菌塘土壤樣品總DNA，用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取基因組DNA的濃度和質量。擴增細菌16S rDNA的V3區(qū)～V4區(qū)，引物為341F（5’-CCTAYG GGRBGCASCAG-3’） 與 806R （5’-GG ACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。擴增真菌 ITS區(qū)域，引物為 ITS3F （5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’）和 ITS4R （5’-TCCTCCGCYYATTGATATGC-3’）。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化，隨后送至上海美吉生物科技有限公司測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析及處理

使用FLASH和fastp軟件過濾去除干擾數(shù)據(jù)，優(yōu)化測序數(shù)據(jù)并將高質量數(shù)據(jù)拼接成Tags序列，利用Usearch軟件對上述序列進行聚類分析[25]。按照97%的一致性聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OUT），將OTU與NCBI數(shù)據(jù)庫比對并對OTU進行物種注釋[26-27]。利用QIIME軟件進行 Alpha多樣性分析 Simpson、Shannon、ACE和Chao指數(shù)等[28]。R 3.0軟件繪制稀釋曲線和進行其他數(shù)據(jù)分析[29-30]。

2 結果與分析

2.1 野生雞腿菇菌塘土壤微生物多樣性分析

細菌和真菌稀釋曲線見圖1、圖2。

如圖1和圖2所示，Sobs指數(shù)構建的稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明抽樣足夠充分，可以進行相關數(shù)據(jù)分析。

圖1 細菌的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of bacteria

圖2 真菌的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve of fungi

經(jīng)質控過濾和去除嵌合體，3個樣本共獲得78 869條細菌高質量序列（effective tags），在97%的相似度水平進行聚類，見圖3。

圖3 細菌的維恩圖Fig.3 Veen diagram of bacteria

如圖3所示，從雞腿菇的菌塘土壤中總共獲得了1 899個細菌OUTs，3個樣品分別獲得了1 723個、1 696個和1 736個OUTs。3個雞腿菇的菌塘土壤樣本共有1 444個細菌OUTs，S1樣品特有27個OUTs，S2樣品特有23個OUTs，S3樣品特有37個OUTs。

3個樣本共獲得177 689條真菌高質量序列，其在97%的相似度水平進行聚類，維恩圖見圖4。

如圖4所示，雞腿菇的菌塘土壤中總共獲得871個真菌OUTs，3個樣品分別獲得689個、698個和648個OUTs。3個雞腿菇的菌塘土壤樣本共有492個真菌OUTs，S1樣品特有66個OUTs，S2樣品特有82個OUTs，S3樣品特有51個OUTs。

圖4 真菌的維恩圖Fig.4 Veen diagram of fungi

Alpha多樣性分析結果見表1。

表1 雞腿菇菌塘土壤微生物群落Alpha多樣性分析Tab.1 Alpha diversity analysis of microbial community from rhizosphere soil of Coprinus comatus

如表1所示，各樣品細菌本文庫的覆蓋度均≥99.03%，各樣品真菌本文庫的覆蓋度均≥99.82%，能夠代表相應樣本中細菌或真菌的真實信息。

2.2 野生雞腿菇菌塘土壤微生物群落結構組成

雞腿菇菌塘土壤細菌共鑒定出9個門，分析結果見圖5、圖6。

圖5 根際土壤細菌門水平群落組成Fig.5 The bacteria community composition of rhizosphere soil at phylum level

圖6 細菌群落結構的熱圖分析（屬水平）Fig.6 Heatmap analysis of bacterial community structure at genus level

如圖5所示，放線菌門為優(yōu)勢門，按所占比例依次分別為：放線菌門（Actinobacteriota） 31.52%、變形菌門 （Proteobacteria） 29.05%、綠彎菌門（Chloroflexi）11.58%、酸桿菌門（Acidobacteriota）10.90%、擬桿菌門（Bacteroidota） 6.64%、黏菌門（Myxococcota） 2.39%、芽單胞菌門（Gemmatimonadota） 2.25%、髕骨細菌門（Patescibacteria） 2.13%和厚壁菌門（Firmicutes） 0.61%。

如圖6所示，在屬水平，雞腿菇菌塘土壤細菌群落中67-14_norank（分類學譜系中無該類層級的科學名稱，標記為norank）為優(yōu)勢菌屬，RB41為相對優(yōu)勢屬，占比超過1.00%屬有16屬，分別為：67-14_norank（3.48%）、KD4-96_norank（3.26%）、Vicinamibacterales_norank（2.39%）、RB41（2.18%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，1.98%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，1.93%）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides，1.82%）、Ellin6055（1.78%）、Roseiflexaceae_norank（1.77%）、 IMCC26256_norank（1.67%）、Gaiellales_norank（1.61%）、Gemmatimonadaceae_norank（1.57%）、分枝桿菌屬（Mycobacterium，1.51%）、Vicinamibacteraceae_norank（1.48%）、Xanthobacteraceae_norank（1.45%） 和黃桿菌屬（Flavobacterium，1.42%）。

雞腿菇菌塘土壤真菌共鑒定出4個門，分析結果見圖7、圖8。

圖7 根際土壤真菌門水平群落組成Fig.7 The fungal community composition of rhizosphere soil at phylum level

圖8 真菌群落結構的熱圖分析（屬水平）Fig.8 Heatmap analysis of fungal community structure at genus level

如圖7所示，子囊菌門為該樣品中的優(yōu)勢門，按所占比例依次分別為：子囊菌門（Ascomycota）73.94%、擔子菌門（Basidiomycota） 18.11%、Fungi_unclassified（3.34%）和被孢霉門（Mortierellomycota）3.17%。

如圖8所示，雞腿菇菌塘土壤真菌群落在屬水平以谷菌根菌屬（Archaeorhizomyces） 為優(yōu)勢菌屬，占比超過1.00%屬有13屬（分類學譜系中未分類的科學名稱，標記為unclassified），分別為：谷菌根屬（Archaeorhizomyces，16.50%）、Ascomycota_unclassified（14.51%）、Pezizales_unclassified（8.24%）、Knufia（5.40%）、 Hygrophoraceae_ unclassified（5.05%）、鬼傘屬（Coprinus，4.41%）、枝孢需屬（Cladophialophora，4.02%）、Lasiosphaeriaceae_unclassified（3.53%）、Fungi_unclassified（3.34%）、A－garicales_unclassified（3.17%）、被孢霉屬（Mortierella，3.16%）、外瓶柄霉屬 （Exophiala，3.06%）。

由圖6、圖8可直觀看出，3個樣品微生物物種群落組成在屬水平上的異同及豐富度，無論是土壤細菌還是部分土壤真菌在3個樣品中的分布均存在一定差異。雞腿菇菌塘土壤細菌以67-14_norank為優(yōu)勢菌屬，與上述群落組成結果一致。雞腿菇菌塘土壤真菌以谷菌根菌屬（Archaeorhizomyces）為優(yōu)勢屬，與上述群落組成結果一致。

3 結論與討論

雞腿菇營養(yǎng)豐富、保健功能突出，備受人們青睞，市場前景廣闊，因此進行野生雞腿菇馴化和穩(wěn)產(chǎn)創(chuàng)收的相關研究很有必要。通過采用高通量測序技術解析西藏林芝市野生雞腿菇菌塘土壤微生物群落組成，優(yōu)勢菌屬及有益菌屬，可為西藏自治區(qū)野生雞腿菇的馴化和栽培提供參考。

細菌群落結構分析中，菌塘土壤中RB41為相對優(yōu)勢屬，豐富度較高的菌屬有慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類諾卡氏菌屬 （Nocardioides）、Ellin6055、分枝桿菌屬（Mycobacterium） 和黃桿菌屬（Flavobacterium）。研究表明，慢生根瘤菌屬能夠降低植物體內的乙烯含量，從而促進植物生長[31]。鞘氨醇單胞菌屬是一類可清除土壤有毒物質且廣布于土壤的細菌類群[32-33]，部分菌株能合成分泌有機物，便于植物吸收利用[34-35]。黃桿菌屬部分菌種具有降解無機磷的能力[36]。

真菌群落結構分析表明，菌塘土壤真菌群落中谷菌根菌屬（Archaeorhizomyces） 為優(yōu)勢菌屬，豐富度較高的真菌類群有Knufia、鬼傘屬（Coprinus）、枝孢需屬（Cladophialophora）、被孢霉屬（Mortierella）、外瓶柄霉屬 （Exophiala）。枝孢需屬（Cladophialophora） 中 Cladophialophora chaetospira SK51菌株不僅具有促進植物生長的活性還具有良好的抑病活性[37]。被孢霉屬作為一類解磷真菌，能釋放磷于土壤，且參與土壤碳磷循環(huán)[38-39]。