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    維生素D干預(yù)四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病骨髓脂肪含量的定量MRI分析研究

    2021-10-13 08:14:12閆玉辰查云飛
    磁共振成像 2021年8期
    關(guān)鍵詞:骨髓椎體腰椎

    閆玉辰,查云飛

    糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種全身慢性代謝性疾病,在體內(nèi)高糖刺激下,骨髓微環(huán)境改變,促使骨髓間葉組織向脂肪組織轉(zhuǎn)化,抑制成骨細(xì)胞形成,導(dǎo)致骨髓內(nèi)脂肪堆積[1]。骨髓脂肪細(xì)胞是骨髓造血微環(huán)境和能量代謝的調(diào)節(jié)器,糖尿病脂肪堆積和脂質(zhì)代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致骨髓脂肪生成增加及骨髓細(xì)胞組成的改變[2],骨髓微環(huán)境平衡失調(diào),與骨質(zhì)疏松癥和脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)等改變密切相關(guān)[3],是臨床上糖尿病患者致死、致殘的主要原因[4]。

    維生素D是一種脂溶性物質(zhì),對(duì)于脂肪的分化有著調(diào)節(jié)作用[5];其儲(chǔ)存和代謝的主要場(chǎng)所位于脂肪組織,糖尿病肥胖患者會(huì)使得血清1-25 (OH)D3不足[6]。維生素D對(duì)于調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境,可改善骨髓脂肪堆積及促進(jìn)骨強(qiáng)度[7];有研究表明維生素D 的補(bǔ)充可以限制糖尿病患者皮下脂肪的再增加,但對(duì)于已生成的脂肪組織尚無(wú)改善作用,并且能促進(jìn)胰島素釋放、改善胰島素的抵抗[8];同時(shí),維生素D刺激皮下脂肪細(xì)胞活化,加快體內(nèi)葡萄糖的攝取,改善循環(huán)血糖濃度,對(duì)于維持體內(nèi)鈣、磷平衡及骨微環(huán)境代謝穩(wěn)態(tài)有調(diào)節(jié)作用[5,9]。

    定量非對(duì)稱回波的最小二乘估算法迭代水脂分離序列(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation sequence,IDEAL-IQ)結(jié)合了快速三維多回波梯度回波成像序列和增強(qiáng)的圖像重建技術(shù)改善了局部脂肪的檢出,通過(guò)數(shù)據(jù)模型重建、整合水和脂肪多回波的復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)來(lái)估算器官內(nèi)脂肪含量(fat fraction,F(xiàn)F)[10-11]。IDEAL-IQ 序列掃描具有簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好等特點(diǎn),其中在后處理工作站上可直接計(jì)算出腰椎感興趣區(qū)骨髓脂肪含量百分比,為在活體糖尿病骨髓脂肪含量改變的定量研究中表現(xiàn)出了巨大臨床價(jià)值[12-13]。同樣使用IDEAL-IQ 技術(shù),胡磊等[14]前期研究結(jié)果顯示糖尿病兔腰椎體骨髓內(nèi)脂肪含量較正常組明顯增多。目前尚未見(jiàn)維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪含量的影像學(xué)研究報(bào)道,本研究旨在探討IDEAL-IQ 技術(shù)下評(píng)價(jià)維生素D對(duì)于糖尿病骨髓脂肪含量改變的價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物模型制備

    本實(shí)驗(yàn)研究從2019 年8 月開(kāi)始,2020 年12 月結(jié)束,武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)所有實(shí)驗(yàn)(第20190421號(hào))。30只28~32周齡健康日本雄性大耳白兔,體質(zhì)量3.0~3.5 kg,由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供單籠飼養(yǎng),室溫25 ℃,30 只兔適應(yīng)期間自由攝食、進(jìn)水,于一周后測(cè)得血糖均在正常范圍[(5.5±0.5) mmol/L]。

    30 只日本雄性大耳白兔按隨機(jī)分為兩組,其中實(shí)驗(yàn)組20 只;造模前,將四氧嘧啶(Sigma 公司)配制成5%溶液,30 只兔均禁食8~12 h,不禁水;造模時(shí),由耳緣靜脈按照100 mg/kg 快速注射入實(shí)驗(yàn)組兔體內(nèi),對(duì)照組10 只給予注射同等量生理鹽水。造模后每小時(shí)用血糖儀(三諾安信血糖儀)測(cè)量耳緣末梢血糖,自由進(jìn)食;對(duì)于血糖<2.0 mmol/L 或出現(xiàn)嚴(yán)重低血糖表現(xiàn)的大白兔,如抽搐、尖叫、精神不振、不進(jìn)食等表現(xiàn),通過(guò)給予注射葡萄糖緩解。四氧嘧啶注射48 h 后重新測(cè)量實(shí)驗(yàn)兔末梢血糖濃度,其中測(cè)得血糖值大于14 mmol/L 或不同時(shí)間點(diǎn)血糖值大于11 mmol/L,可認(rèn)定造模成功[15];若測(cè)得血糖處在正常范圍內(nèi),則補(bǔ)加50 mg/kg四氧嘧啶,直至血糖水平達(dá)標(biāo);對(duì)于血糖水平超過(guò)30 mmol/L的嚴(yán)重高血糖水平,通過(guò)皮下注射長(zhǎng)效胰島素,將其控制在30 mmol/L以下。

    四氧嘧啶造模成功一周后,隨機(jī)將20 只實(shí)驗(yàn)兔再分為兩組;其中,干預(yù)組10 只每周口服維生素D (400 μg),連續(xù)給藥4 周;對(duì)照組和單純糖尿病組每周用生理鹽水10 mL灌胃。

    1.2 MRI設(shè)備及成像方法

    所有兔在第0、4、8、12、16周的時(shí)間點(diǎn),分別從耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉溶液(3%,2 mL/kg)麻醉,在3.0 T Discovery MR750 Plus 磁共振設(shè)備(GE Healthcare)上,固定于8 通道膝關(guān)節(jié)專用相控陣線圈,擺放體位呈仰臥位、足先進(jìn);使用常規(guī)腰椎矢狀位FSE-T2WI、FSE-T1WI及腰椎IDEAL-IQ掃描。

    矢狀位T1WI 掃描參數(shù):TR 300 ms,TE Min Full,掃描層厚3 mm,視野16 cm×16 cm,矩陣320×288,激勵(lì)次數(shù)為2,掃描時(shí)間2 min 6 s。矢狀位T2WI 掃描參數(shù):TR 2500 ms,TE 120.0 ms,掃描層厚3 mm,視野16 cm×16 cm,矩陣320×320,激勵(lì)次數(shù)為4,掃描時(shí)間2 min 45 s。矢狀位IDEAL-IQ 掃描參數(shù):翻轉(zhuǎn)角6°,TR 17.2 ms,TE 1.2、3.2、5.2、7.2、9.2、11.2 ms。帶寬31.25 kHz,掃描層厚3 mm,視野18 cm×0.8 cm,矩陣192×160,激勵(lì)次數(shù)為3,掃描時(shí)間5 min 37 s。

    1.3 兔腰椎IDEAL-IQ骨髓脂肪含量百分比測(cè)定

    在AW4.6 后處理工作站上(GE Healthcare),將對(duì)照組、單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組所有兔的IDEAL-IQ 掃描圖像導(dǎo)入,選取3 組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Fat Fraction 圖像中兔腰椎第5~7 椎體中心層面,由同一觀察者勾畫(huà)感興趣,每1 個(gè)椎體的ROI 要避開(kāi)椎體終板軟骨、邊緣骨皮質(zhì)的干擾,重復(fù)3 次,取平均值。見(jiàn)圖1。

    圖1 A~C 分別為矢狀位T1WI、T2WI、FF 圖。紅色區(qū)域?yàn)楣串?huà)的腰7 椎體(白色箭頭)興趣區(qū)Fig.1 A—C showed the T1WI,T2WI,FF,respectively.The red area was the ROIarea of fat fraction of the 7th lumbar vertebra(white arrow).

    1.4 兔腰椎骨髓組織病理學(xué)檢查

    完成檢查后,在第16 周采取空氣栓塞法處死所有實(shí)驗(yàn)兔,取腰5、6、7椎體作為病理標(biāo)本,10%多聚甲醛固定組織,脫鈣兩周后用石蠟包埋,垂直于椎體蠟塊短軸位作4 μm 切片,行HE 染色。隨機(jī)選取3 個(gè)相互不連續(xù)的區(qū)域,由同一觀察者分別于顯微鏡高倍鏡(×400)視野下統(tǒng)計(jì)脂肪細(xì)胞數(shù)目,取平均值。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0,對(duì)第0、4、8、12 及16 周各時(shí)間點(diǎn)IDEAL-IQ 測(cè)量所得的3 組間腰椎體骨髓脂肪含量,其中空白對(duì)照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組各采用兩兩重復(fù)測(cè)量的方差分析統(tǒng)計(jì)。第16 周IDEAL-IQ 測(cè)量腰椎體脂肪含量FF 與HE 染色切片鏡下脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)采用Pearson 相關(guān)分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    因麻醉意外在實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)組共死亡7 只,其中單純糖尿病組剩余6 只,維生素D 干預(yù)組剩余7 只,對(duì)照組死亡1 只,空氣栓塞處死2只,剩余7只。

    IDEAL-IQ 測(cè)量單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組各組組內(nèi)在造模后第16 周椎體骨髓脂肪含量FF 值較第0 周明顯增高,且兩時(shí)間點(diǎn)測(cè)得FF 值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.971,P<0.05;F=3.055,P<0.01),兩 組其他時(shí)間點(diǎn)測(cè)得FF 值不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);對(duì)照組椎體各時(shí)間點(diǎn)骨髓脂肪含量百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

    圖2 空白對(duì)照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)IDEAL-IQ椎體脂肪比的趨勢(shì)圖Fig.2 Trend chart of the proportion of vertebral bone marrow fat measured by IDEA-IQ at each time point between the simple diabetes group,vitamin D intervention group and control group.

    單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組兩組第16 周椎體IDEAL-IQ 測(cè)量脂肪含量百分比與第16 周對(duì)照組比較,腰椎骨髓FF%差異分別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是,同一時(shí)間點(diǎn)糖尿病組與維生素D 干預(yù)組組間在第16 周的FF 值差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.390,P=0.06)(表1)。

    表1 單純糖尿病組、維生素D干預(yù)組、對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)IDEAL-IQ椎體脂肪比的比較(%)Tab.1 Comparison of IDEAL-IQ values at each time point between the simple diabetes group,vitamin D intervention group and control group(%)

    第16周,腰椎骨髓HE染色顯示單純糖尿病組與維生素D干預(yù)組中骨髓脂肪細(xì)胞較空白對(duì)照組相比明顯增多、增大(圖3);空白對(duì)照組、單純糖尿病組與維生素D干預(yù)組骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)目平均值分別為12.80±5.26/mm2、21.30±6.80/mm2、19.20±5.81/mm2,單 純糖尿病組與維生素D 干預(yù)組骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)值高于空白 對(duì)照 組(t=-19.549,P<0.05;t=-15.681,P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但維生素D 干預(yù)前后,兩實(shí)驗(yàn)組骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)值差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.481,P=0.412)。

    圖3 A~C 分別為第16 周空白對(duì)照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組兔腰椎骨髓HE 染色(×400)。黑色箭頭所指為脂肪細(xì)胞Fig.3 A—C showed HE staining of lumbar bone marrow of rabbits in the control group,the simple diabetes group and the vitamin D intervention group at week 16 (×400).The black arrows indicate adipocyte.

    Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兔糖尿病模型成功后第16周,實(shí)驗(yàn)兔腰椎骨髓脂肪含量(FF)值與HE染色后的脂肪數(shù)目呈正相關(guān)(r=0.828,P<0.05)(圖4)。

    圖4 四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型后第16 周,實(shí)驗(yàn)兔腰椎骨髓FF 值與脂肪數(shù)目呈正相關(guān)Fig.4 FF values of lumbar bone marrow was positively correlated with the number of adipocyte at the 16th week in alloxan-induced diabetic rabbits.

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)探討基于IDEAL-IQ 技術(shù)評(píng)估維生素D 干預(yù)前后糖尿病骨髓脂肪含量變化,研究結(jié)果表明,在第16 周單純糖尿病組和維生素D 干預(yù)組骨髓脂肪含量較對(duì)照組脂肪含量增高,其中單純糖尿病組增高較為明顯;第16 周維生素D 干預(yù)組組較第16 周單純糖尿病的脂肪含量差異無(wú)相關(guān)性,但維生素D干預(yù)下骨髓脂肪分?jǐn)?shù)值整體呈下降趨勢(shì)。

    多種MRI 定量技術(shù)在評(píng)價(jià)骨髓脂肪含量方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy,MRS)檢測(cè)是一種通過(guò)充分利用化合物間的差別而無(wú)創(chuàng)性的光譜觀察檢測(cè)生物體活體組織中的各種組織新陳代謝、生化變化和對(duì)其化合物進(jìn)行定量檢測(cè)的科學(xué)技術(shù)[16]。Li 等[17]研究結(jié)果表明3.0 T MRS 對(duì)于低骨密度個(gè)體的椎體骨髓脂肪含量的測(cè)定具有可行性;但是,1H-MRS 技術(shù)難點(diǎn)是骨髓磁場(chǎng)譜圖曲線的線寬易直接受到松質(zhì)骨髓的小梁和骨髓磁場(chǎng)不均勻的因素影響,且掃描時(shí)間長(zhǎng),要求較高、后處理較為復(fù)雜而受到限制。水和脂肪的回波不對(duì)稱迭代分解和最小二乘估計(jì)量化序列(IDEAL-IQ)作為一種新的MR 圖像脂肪含量百分比的量化方法,該方法已被用于估計(jì)多個(gè)器官的脂肪含量[10]。相對(duì)于1H-MRS,IDEAL-IQ 技術(shù)具有用時(shí)短、可重復(fù)性高等優(yōu)勢(shì),從工作站中可以對(duì)所生成的FF 圖上直接計(jì)算出各組織器官感興趣區(qū)內(nèi)的脂肪含量百分比。Ergen 等[18]首次采用IDEAL-IQ 技術(shù)展示了定量測(cè)量女性椎體脂肪含量的可行性;Hu 等[19]前期實(shí)驗(yàn)首次利用IDEAL-IQ 技術(shù),揭示四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病兔椎體終板下骨髓腔脂肪含量隨著時(shí)間累積的變化,證實(shí)了IDEAL-IQ 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病模型上定量評(píng)估椎體骨髓脂肪含量是可行的。

    目前很多研究都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人體血清中的維生素D 循環(huán)水平濃度(以人體血清中的維生素D3 水平為主要指標(biāo))可能會(huì)與2 型糖尿病患者風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[20],同樣糖尿病疾病也會(huì)導(dǎo)致鈣、磷及維生素D 水平的減低。維生素D 通過(guò)刺激脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取可改善鈣磷平衡及骨代謝[5]。Shab-Bidar等[8]研究表明血清維生素D 水平可與內(nèi)臟脂肪含量呈負(fù)相關(guān),但對(duì)于已經(jīng)生成的脂肪組織尚無(wú)明顯改善作用。長(zhǎng)期給肥胖小鼠補(bǔ)充維生素D,可誘導(dǎo)炎癥趨化因子mRNA 表達(dá)水平降低,有助于肥胖小鼠體內(nèi)減輕脂肪組織炎癥及改善肝臟脂肪變性趨勢(shì)[21];對(duì)于糖尿病患者的皮下脂肪的累積,補(bǔ)充維生素D可以有效限制皮下脂肪的再增加[8]。本實(shí)驗(yàn)利用IDEAL-IQ技術(shù)快速、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn),定量測(cè)定維生素D干預(yù)前后糖尿病兔腰椎骨髓脂肪含量值變化,為揭示維生素D影響早期糖尿病骨病中骨髓微環(huán)境中脂肪代謝的病理生理機(jī)制及未來(lái)為臨床評(píng)估相關(guān)抑脂藥物療效結(jié)果提供了較為可靠的影像學(xué)證據(jù)。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,維生素D干預(yù)四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型16 周后,兔腰椎骨髓脂肪含量分?jǐn)?shù)值較單純糖尿病組骨髓脂肪分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì),但兩組間腰椎脂肪FF 值無(wú)明顯改變,兩者差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。維生素D 作用具有兩重性,合理劑量的1,25-二羥維生素D3 [1,25-(OH)2D3]濃度利于髓內(nèi)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化、成熟,抑制脂肪細(xì)胞的累積,改善骨髓微環(huán)境平衡[22];超過(guò)生理劑量的1,25-二羥維生素D3 濃度會(huì)改變骨髓微環(huán)境穩(wěn)定,抑制成骨細(xì)胞分化,提高破骨細(xì)胞的活性,從而改變骨髓內(nèi)脂肪含量。本實(shí)驗(yàn)維生素D 按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)之間的劑量轉(zhuǎn)換的簡(jiǎn)單實(shí)踐指南[23],轉(zhuǎn)化為兔模型生理劑量范圍,推測(cè)在糖尿病16 周病程中,給藥4 周時(shí)間中腰椎骨髓脂肪成分發(fā)生的改變,可能因?yàn)楦深A(yù)時(shí)間過(guò)短,或者是給藥濃度較低,使得體內(nèi)維生素D濃度未達(dá)到閾值或藥物持續(xù)時(shí)間較短未能達(dá)到讓IDEAL-IQ技術(shù)測(cè)得的宏觀脂肪組織改變的表現(xiàn),這可能是導(dǎo)致維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪含量下降趨勢(shì)不明顯的重要原因之一。未來(lái)的研究應(yīng)更多地從維生素D 干預(yù)時(shí)間及干預(yù)劑量上評(píng)價(jià)IDEAL-IQ測(cè)量兔糖尿病模型中骨髓脂肪含量分?jǐn)?shù)值的變化。

    本實(shí)驗(yàn)的局限性:(1)本實(shí)驗(yàn)研究的樣本量較少,維生素D 對(duì)于糖尿病骨髓脂肪含量改變的變化機(jī)制仍需要大樣本予以證實(shí);(2)干預(yù)組給予維生素D 的劑量及給藥時(shí)間較短,對(duì)于長(zhǎng)期、大劑量維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪改變是否存在相同效果仍需要后續(xù)研究進(jìn)一步觀察;(3)糖尿病動(dòng)物模型的發(fā)生發(fā)展和臨床患者糖尿病慢性自然病程存在差異。

    綜上所述,IDEAL-IQ技術(shù)評(píng)價(jià)維生素D干預(yù)四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型骨髓脂肪含量變化是可行的,維生素D 干預(yù)16 周內(nèi),骨髓脂肪含量改變呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

    作者利益沖突聲明:全體作者均聲明無(wú)利益沖突。

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