維生素D干預(yù)四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病骨髓脂肪含量的定量MRI分析研究

閆玉辰，查云飛

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種全身慢性代謝性疾病，在體內(nèi)高糖刺激下，骨髓微環(huán)境改變，促使骨髓間葉組織向脂肪組織轉(zhuǎn)化，抑制成骨細(xì)胞形成，導(dǎo)致骨髓內(nèi)脂肪堆積[1]。骨髓脂肪細(xì)胞是骨髓造血微環(huán)境和能量代謝的調(diào)節(jié)器，糖尿病脂肪堆積和脂質(zhì)代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致骨髓脂肪生成增加及骨髓細(xì)胞組成的改變[2]，骨髓微環(huán)境平衡失調(diào)，與骨質(zhì)疏松癥和脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)等改變密切相關(guān)[3]，是臨床上糖尿病患者致死、致殘的主要原因[4]。

維生素D是一種脂溶性物質(zhì)，對(duì)于脂肪的分化有著調(diào)節(jié)作用[5]；其儲(chǔ)存和代謝的主要場(chǎng)所位于脂肪組織，糖尿病肥胖患者會(huì)使得血清1-25 (OH)D3不足[6]。維生素D對(duì)于調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境，可改善骨髓脂肪堆積及促進(jìn)骨強(qiáng)度[7]；有研究表明維生素D 的補(bǔ)充可以限制糖尿病患者皮下脂肪的再增加，但對(duì)于已生成的脂肪組織尚無(wú)改善作用，并且能促進(jìn)胰島素釋放、改善胰島素的抵抗[8]；同時(shí)，維生素D刺激皮下脂肪細(xì)胞活化，加快體內(nèi)葡萄糖的攝取，改善循環(huán)血糖濃度，對(duì)于維持體內(nèi)鈣、磷平衡及骨微環(huán)境代謝穩(wěn)態(tài)有調(diào)節(jié)作用[5，9]。

定量非對(duì)稱回波的最小二乘估算法迭代水脂分離序列(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation sequence，IDEAL-IQ)結(jié)合了快速三維多回波梯度回波成像序列和增強(qiáng)的圖像重建技術(shù)改善了局部脂肪的檢出，通過(guò)數(shù)據(jù)模型重建、整合水和脂肪多回波的復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)來(lái)估算器官內(nèi)脂肪含量(fat fraction，F(xiàn)F)[10-11]。IDEAL-IQ 序列掃描具有簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好等特點(diǎn)，其中在后處理工作站上可直接計(jì)算出腰椎感興趣區(qū)骨髓脂肪含量百分比，為在活體糖尿病骨髓脂肪含量改變的定量研究中表現(xiàn)出了巨大臨床價(jià)值[12-13]。同樣使用IDEAL-IQ 技術(shù)，胡磊等[14]前期研究結(jié)果顯示糖尿病兔腰椎體骨髓內(nèi)脂肪含量較正常組明顯增多。目前尚未見(jiàn)維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪含量的影像學(xué)研究報(bào)道，本研究旨在探討IDEAL-IQ 技術(shù)下評(píng)價(jià)維生素D對(duì)于糖尿病骨髓脂肪含量改變的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備

本實(shí)驗(yàn)研究從2019 年8 月開(kāi)始，2020 年12 月結(jié)束，武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)所有實(shí)驗(yàn)(第20190421號(hào))。30只28～32周齡健康日本雄性大耳白兔，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供單籠飼養(yǎng)，室溫25 ℃，30 只兔適應(yīng)期間自由攝食、進(jìn)水，于一周后測(cè)得血糖均在正常范圍[(5.5±0.5) mmol/L]。

30 只日本雄性大耳白兔按隨機(jī)分為兩組，其中實(shí)驗(yàn)組20 只；造模前，將四氧嘧啶(Sigma 公司)配制成5%溶液，30 只兔均禁食8～12 h，不禁水；造模時(shí)，由耳緣靜脈按照100 mg/kg 快速注射入實(shí)驗(yàn)組兔體內(nèi)，對(duì)照組10 只給予注射同等量生理鹽水。造模后每小時(shí)用血糖儀(三諾安信血糖儀)測(cè)量耳緣末梢血糖，自由進(jìn)食；對(duì)于血糖＜2.0 mmol/L 或出現(xiàn)嚴(yán)重低血糖表現(xiàn)的大白兔，如抽搐、尖叫、精神不振、不進(jìn)食等表現(xiàn)，通過(guò)給予注射葡萄糖緩解。四氧嘧啶注射48 h 后重新測(cè)量實(shí)驗(yàn)兔末梢血糖濃度，其中測(cè)得血糖值大于14 mmol/L 或不同時(shí)間點(diǎn)血糖值大于11 mmol/L，可認(rèn)定造模成功[15]；若測(cè)得血糖處在正常范圍內(nèi)，則補(bǔ)加50 mg/kg四氧嘧啶，直至血糖水平達(dá)標(biāo)；對(duì)于血糖水平超過(guò)30 mmol/L的嚴(yán)重高血糖水平，通過(guò)皮下注射長(zhǎng)效胰島素，將其控制在30 mmol/L以下。

四氧嘧啶造模成功一周后，隨機(jī)將20 只實(shí)驗(yàn)兔再分為兩組；其中，干預(yù)組10 只每周口服維生素D (400 μg)，連續(xù)給藥4 周；對(duì)照組和單純糖尿病組每周用生理鹽水10 mL灌胃。

1.2 MRI設(shè)備及成像方法

所有兔在第0、4、8、12、16周的時(shí)間點(diǎn)，分別從耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉溶液(3%，2 mL/kg)麻醉，在3.0 T Discovery MR750 Plus 磁共振設(shè)備(GE Healthcare)上，固定于8 通道膝關(guān)節(jié)專用相控陣線圈，擺放體位呈仰臥位、足先進(jìn)；使用常規(guī)腰椎矢狀位FSE-T2WI、FSE-T1WI及腰椎IDEAL-IQ掃描。

矢狀位T1WI 掃描參數(shù)：TR 300 ms，TE Min Full，掃描層厚3 mm，視野16 cm×16 cm，矩陣320×288，激勵(lì)次數(shù)為2，掃描時(shí)間2 min 6 s。矢狀位T2WI 掃描參數(shù)：TR 2500 ms，TE 120.0 ms，掃描層厚3 mm，視野16 cm×16 cm，矩陣320×320，激勵(lì)次數(shù)為4，掃描時(shí)間2 min 45 s。矢狀位IDEAL-IQ 掃描參數(shù)：翻轉(zhuǎn)角6°，TR 17.2 ms，TE 1.2、3.2、5.2、7.2、9.2、11.2 ms。帶寬31.25 kHz，掃描層厚3 mm，視野18 cm×0.8 cm，矩陣192×160，激勵(lì)次數(shù)為3，掃描時(shí)間5 min 37 s。

1.3 兔腰椎IDEAL-IQ骨髓脂肪含量百分比測(cè)定

在AW4.6 后處理工作站上(GE Healthcare)，將對(duì)照組、單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組所有兔的IDEAL-IQ 掃描圖像導(dǎo)入，選取3 組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Fat Fraction 圖像中兔腰椎第5～7 椎體中心層面，由同一觀察者勾畫(huà)感興趣，每1 個(gè)椎體的ROI 要避開(kāi)椎體終板軟骨、邊緣骨皮質(zhì)的干擾，重復(fù)3 次，取平均值。見(jiàn)圖1。

圖1 A～C 分別為矢狀位T1WI、T2WI、FF 圖。紅色區(qū)域?yàn)楣串?huà)的腰7 椎體(白色箭頭)興趣區(qū)Fig.1 A—C showed the T1WI,T2WI,FF,respectively.The red area was the ROIarea of fat fraction of the 7th lumbar vertebra(white arrow).

1.4 兔腰椎骨髓組織病理學(xué)檢查

完成檢查后，在第16 周采取空氣栓塞法處死所有實(shí)驗(yàn)兔，取腰5、6、7椎體作為病理標(biāo)本，10%多聚甲醛固定組織，脫鈣兩周后用石蠟包埋，垂直于椎體蠟塊短軸位作4 μm 切片，行HE 染色。隨機(jī)選取3 個(gè)相互不連續(xù)的區(qū)域，由同一觀察者分別于顯微鏡高倍鏡(×400)視野下統(tǒng)計(jì)脂肪細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0，對(duì)第0、4、8、12 及16 周各時(shí)間點(diǎn)IDEAL-IQ 測(cè)量所得的3 組間腰椎體骨髓脂肪含量，其中空白對(duì)照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組各采用兩兩重復(fù)測(cè)量的方差分析統(tǒng)計(jì)。第16 周IDEAL-IQ 測(cè)量腰椎體脂肪含量FF 與HE 染色切片鏡下脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)采用Pearson 相關(guān)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

因麻醉意外在實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)組共死亡7 只，其中單純糖尿病組剩余6 只，維生素D 干預(yù)組剩余7 只，對(duì)照組死亡1 只，空氣栓塞處死2只，剩余7只。

IDEAL-IQ 測(cè)量單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組各組組內(nèi)在造模后第16 周椎體骨髓脂肪含量FF 值較第0 周明顯增高，且兩時(shí)間點(diǎn)測(cè)得FF 值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.971，P＜0.05；F=3.055，P＜0.01)，兩 組其他時(shí)間點(diǎn)測(cè)得FF 值不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；對(duì)照組椎體各時(shí)間點(diǎn)骨髓脂肪含量百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖2)。

圖2 空白對(duì)照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)IDEAL-IQ椎體脂肪比的趨勢(shì)圖Fig.2 Trend chart of the proportion of vertebral bone marrow fat measured by IDEA-IQ at each time point between the simple diabetes group,vitamin D intervention group and control group.

單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組兩組第16 周椎體IDEAL-IQ 測(cè)量脂肪含量百分比與第16 周對(duì)照組比較，腰椎骨髓FF%差異分別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但是，同一時(shí)間點(diǎn)糖尿病組與維生素D 干預(yù)組組間在第16 周的FF 值差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.390，P=0.06)(表1)。

表1 單純糖尿病組、維生素D干預(yù)組、對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)IDEAL-IQ椎體脂肪比的比較(%)Tab.1 Comparison of IDEAL-IQ values at each time point between the simple diabetes group,vitamin D intervention group and control group(%)

第16周，腰椎骨髓HE染色顯示單純糖尿病組與維生素D干預(yù)組中骨髓脂肪細(xì)胞較空白對(duì)照組相比明顯增多、增大(圖3)；空白對(duì)照組、單純糖尿病組與維生素D干預(yù)組骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)目平均值分別為12.80±5.26/mm2、21.30±6.80/mm2、19.20±5.81/mm2，單 純糖尿病組與維生素D 干預(yù)組骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)值高于空白 對(duì)照 組(t=-19.549，P＜0.05；t=-15.681，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但維生素D 干預(yù)前后，兩實(shí)驗(yàn)組骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)值差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.481，P=0.412)。

圖3 A～C 分別為第16 周空白對(duì)照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組兔腰椎骨髓HE 染色(×400)。黑色箭頭所指為脂肪細(xì)胞Fig.3 A—C showed HE staining of lumbar bone marrow of rabbits in the control group,the simple diabetes group and the vitamin D intervention group at week 16 (×400).The black arrows indicate adipocyte.

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兔糖尿病模型成功后第16周，實(shí)驗(yàn)兔腰椎骨髓脂肪含量(FF)值與HE染色后的脂肪數(shù)目呈正相關(guān)(r=0.828，P＜0.05)(圖4)。

圖4 四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型后第16 周，實(shí)驗(yàn)兔腰椎骨髓FF 值與脂肪數(shù)目呈正相關(guān)Fig.4 FF values of lumbar bone marrow was positively correlated with the number of adipocyte at the 16th week in alloxan-induced diabetic rabbits.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)探討基于IDEAL-IQ 技術(shù)評(píng)估維生素D 干預(yù)前后糖尿病骨髓脂肪含量變化，研究結(jié)果表明，在第16 周單純糖尿病組和維生素D 干預(yù)組骨髓脂肪含量較對(duì)照組脂肪含量增高，其中單純糖尿病組增高較為明顯；第16 周維生素D 干預(yù)組組較第16 周單純糖尿病的脂肪含量差異無(wú)相關(guān)性，但維生素D干預(yù)下骨髓脂肪分?jǐn)?shù)值整體呈下降趨勢(shì)。

多種MRI 定量技術(shù)在評(píng)價(jià)骨髓脂肪含量方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy，MRS)檢測(cè)是一種通過(guò)充分利用化合物間的差別而無(wú)創(chuàng)性的光譜觀察檢測(cè)生物體活體組織中的各種組織新陳代謝、生化變化和對(duì)其化合物進(jìn)行定量檢測(cè)的科學(xué)技術(shù)[16]。Li 等[17]研究結(jié)果表明3.0 T MRS 對(duì)于低骨密度個(gè)體的椎體骨髓脂肪含量的測(cè)定具有可行性；但是，1H-MRS 技術(shù)難點(diǎn)是骨髓磁場(chǎng)譜圖曲線的線寬易直接受到松質(zhì)骨髓的小梁和骨髓磁場(chǎng)不均勻的因素影響，且掃描時(shí)間長(zhǎng)，要求較高、后處理較為復(fù)雜而受到限制。水和脂肪的回波不對(duì)稱迭代分解和最小二乘估計(jì)量化序列(IDEAL-IQ)作為一種新的MR 圖像脂肪含量百分比的量化方法，該方法已被用于估計(jì)多個(gè)器官的脂肪含量[10]。相對(duì)于1H-MRS，IDEAL-IQ 技術(shù)具有用時(shí)短、可重復(fù)性高等優(yōu)勢(shì)，從工作站中可以對(duì)所生成的FF 圖上直接計(jì)算出各組織器官感興趣區(qū)內(nèi)的脂肪含量百分比。Ergen 等[18]首次采用IDEAL-IQ 技術(shù)展示了定量測(cè)量女性椎體脂肪含量的可行性；Hu 等[19]前期實(shí)驗(yàn)首次利用IDEAL-IQ 技術(shù)，揭示四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病兔椎體終板下骨髓腔脂肪含量隨著時(shí)間累積的變化，證實(shí)了IDEAL-IQ 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病模型上定量評(píng)估椎體骨髓脂肪含量是可行的。

目前很多研究都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人體血清中的維生素D 循環(huán)水平濃度(以人體血清中的維生素D3 水平為主要指標(biāo))可能會(huì)與2 型糖尿病患者風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[20]，同樣糖尿病疾病也會(huì)導(dǎo)致鈣、磷及維生素D 水平的減低。維生素D 通過(guò)刺激脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取可改善鈣磷平衡及骨代謝[5]。Shab-Bidar等[8]研究表明血清維生素D 水平可與內(nèi)臟脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，但對(duì)于已經(jīng)生成的脂肪組織尚無(wú)明顯改善作用。長(zhǎng)期給肥胖小鼠補(bǔ)充維生素D，可誘導(dǎo)炎癥趨化因子mRNA 表達(dá)水平降低，有助于肥胖小鼠體內(nèi)減輕脂肪組織炎癥及改善肝臟脂肪變性趨勢(shì)[21]；對(duì)于糖尿病患者的皮下脂肪的累積，補(bǔ)充維生素D可以有效限制皮下脂肪的再增加[8]。本實(shí)驗(yàn)利用IDEAL-IQ技術(shù)快速、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，定量測(cè)定維生素D干預(yù)前后糖尿病兔腰椎骨髓脂肪含量值變化，為揭示維生素D影響早期糖尿病骨病中骨髓微環(huán)境中脂肪代謝的病理生理機(jī)制及未來(lái)為臨床評(píng)估相關(guān)抑脂藥物療效結(jié)果提供了較為可靠的影像學(xué)證據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，維生素D干預(yù)四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型16 周后，兔腰椎骨髓脂肪含量分?jǐn)?shù)值較單純糖尿病組骨髓脂肪分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，但兩組間腰椎脂肪FF 值無(wú)明顯改變，兩者差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。維生素D 作用具有兩重性，合理劑量的1，25-二羥維生素D3 [1，25-(OH)2D3]濃度利于髓內(nèi)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化、成熟，抑制脂肪細(xì)胞的累積，改善骨髓微環(huán)境平衡[22]；超過(guò)生理劑量的1，25-二羥維生素D3 濃度會(huì)改變骨髓微環(huán)境穩(wěn)定，抑制成骨細(xì)胞分化，提高破骨細(xì)胞的活性，從而改變骨髓內(nèi)脂肪含量。本實(shí)驗(yàn)維生素D 按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)之間的劑量轉(zhuǎn)換的簡(jiǎn)單實(shí)踐指南[23]，轉(zhuǎn)化為兔模型生理劑量范圍，推測(cè)在糖尿病16 周病程中，給藥4 周時(shí)間中腰椎骨髓脂肪成分發(fā)生的改變，可能因?yàn)楦深A(yù)時(shí)間過(guò)短，或者是給藥濃度較低，使得體內(nèi)維生素D濃度未達(dá)到閾值或藥物持續(xù)時(shí)間較短未能達(dá)到讓IDEAL-IQ技術(shù)測(cè)得的宏觀脂肪組織改變的表現(xiàn)，這可能是導(dǎo)致維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪含量下降趨勢(shì)不明顯的重要原因之一。未來(lái)的研究應(yīng)更多地從維生素D 干預(yù)時(shí)間及干預(yù)劑量上評(píng)價(jià)IDEAL-IQ測(cè)量兔糖尿病模型中骨髓脂肪含量分?jǐn)?shù)值的變化。

本實(shí)驗(yàn)的局限性：(1)本實(shí)驗(yàn)研究的樣本量較少，維生素D 對(duì)于糖尿病骨髓脂肪含量改變的變化機(jī)制仍需要大樣本予以證實(shí)；(2)干預(yù)組給予維生素D 的劑量及給藥時(shí)間較短，對(duì)于長(zhǎng)期、大劑量維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪改變是否存在相同效果仍需要后續(xù)研究進(jìn)一步觀察；(3)糖尿病動(dòng)物模型的發(fā)生發(fā)展和臨床患者糖尿病慢性自然病程存在差異。

綜上所述，IDEAL-IQ技術(shù)評(píng)價(jià)維生素D干預(yù)四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型骨髓脂肪含量變化是可行的，維生素D 干預(yù)16 周內(nèi)，骨髓脂肪含量改變呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無(wú)利益沖突。