竹節(jié)香附素A通過JAK/STAT3通路抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖和侵襲的實驗研究

樊素珍，趙書君，秦巧紅，郜翔，王寶金，李紅雨

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院 婦科，河南 鄭州 450000)

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率次于子宮頸癌、子宮內膜癌而列居第三位，但其死亡率卻高居婦科惡性腫瘤首位[1-2]。卵巢癌發(fā)病隱匿且病情進展迅速，大多數(shù)患者確診時已是晚期，此時臨床治療困難，預后差，患者長期生存率低，對婦女生命健康造成極大威脅[3]。竹節(jié)香附為多被銀蓮花的干燥根莖，具有明顯的抗腫瘤、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛等作用，其中竹節(jié)香附素A(RA) 的抗腫瘤活性成分可抑制胃癌細胞株BGC-823 的增殖、遷移侵襲[4]，并可誘導肝癌細胞凋亡、抑制肝癌細胞血管生成，增強其化療敏感性[5]，因而RA可能對卵巢癌SKOV3 細胞增殖及侵襲具有抑制作用。JAK/STAT3 通路在多種癌癥中處于異常的高激活狀態(tài)，且與臨床的不良預后有關，因此抑制該通路激活，可直接抑制腫瘤細胞生長，增強抗腫瘤免疫功能，進而提高臨床療效[6]。另外，JAK/STAT3 通路還與化療藥物耐藥性相關，抑制其激活，可降低乳腺癌細胞的耐藥性[7]。在對胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，RA 抑制胃癌細胞BGC-823 中STAT3 信號的激活[4]，但RA 對卵巢癌SKOV3 細胞中JAK/STAT3 通路的影響目前尚不清楚，本文通過體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3 細胞，研究RA 是否通過JAK/STAT3通路抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖和侵襲。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

卵巢癌細胞SKOV3，上海賓穗生物科技有限公司，貨號：BS-C00767533；竹節(jié)香附素A(RA)，中國藥品生物制品檢定所，批號：141113；順鉑( 純度：98.5%)，上海恒斐生物科技有限公司，批號：D8810；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液、PBS 緩沖液、胰蛋白酶-EDTA 消化液，美國Solarbio公司，貨號分別為：31800、11011-8611、P1400、P1022、T1300；AnnexinV/PI 凋亡檢測試劑盒，美國BD 公司，貨號：556547；兔源GAPDH 一抗、兔源Bax一抗、鼠源Bcl-2 一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗，美國Cell Singaling Technology 公司，貨號分別為：PA5-85082、PA5-11378、13-8800、A-11029、A-11034； 兔源E-cadherin、Vimentin、JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3一抗，美國Abcam 公司，貨號分別為：ab76319、ab193555、ab133666、ab138005、ab68153、ab76315；結晶紫染色液、蛋白裂解液、CK-8 試劑盒、BCA 試劑盒，上海碧云天公司，貨號分別為：C0121、P0013K、C0037、P0011 等。

1.2 主要儀器

Elx800酶標儀購自美國Bio-Rad 公司；Olympus CKX41顯微鏡購自德國Leica 公司；IBright CL 1500凝膠成像系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CytoFLEX流式細儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Centrifuge 5424R 低溫高速離心機購自德國Eppendorf 股份公司；Mini-PROTEAN Tetra 蛋白電泳儀、Trans-Blot Turbo 轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司等。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

向RPMI-1640 基礎培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素溶液，上下顛倒混勻得完全培養(yǎng)基，將購買的卵巢癌細胞SKOV3 解凍復蘇，以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)重懸后，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞在瓶底長至80%左右時，胰酶消化后，以1∶3 的比例傳代培養(yǎng)。

1.3.2 CK-8 實驗

將RA 以RPMI-1640 基礎培養(yǎng)基溶解后配制為濃度90 μmol/L 的儲備液備用。使用1.3.1 中的傳代細胞接種于96 孔板中，密度約為0.6×105個/mL，培養(yǎng)24 h 后參照文獻[8]，以0、2、4、8、16 μmol/L 濃度的RA 處理，每個濃度設置5 個孔作為重復，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h 后每孔加入CK-8 試劑，采用全自動酶標儀檢測450 nm 波長下各孔吸光度值，計算每個濃度的RA對SKOV3 細胞的增殖抑制率，實驗重復3 次。公式：細胞增殖抑制率(%)=(NC 組吸光度- 實驗組吸光度)/NC組吸光度×100%。

1.3.3 細胞活力檢測

取1.3.1 中的傳代細胞接種在96 孔板中，密度約為0.6×105個/mL，培養(yǎng)24 h 后隨機分為三組：不做任何處理(NC 組)、RA 組、順鉑組(PDD 組)，分別以16 μmol/LRA、5 μmol/LPDD[9]處 理48 h，按 照1.3.2中的方法測定各組吸光度，計算各組細胞的細胞活力，公式：細胞活力(%)= 藥物處理組吸光度/NC 組吸光度×100%，實驗重復三次。

1.3.4 細胞凋亡檢測

取1.3.1 中的傳代細胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理48 h 后收集各組細胞，以PBS 重懸后計數(shù)，取約含有1×106個細胞的細胞懸液至做好組別標記的無菌EP 管中，轉速1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，以PBS 溶液漂洗細胞沉淀2 次，加 入500 μL Binding Buffer、10 μL AnnexinV-FITC 及5 μL PI 后，輕輕吹打細胞使之充分混勻，室溫，避光反應15 min，轉速1 000r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，細胞沉淀以PBS 溶液漂洗2 次后以PBS 重懸，輕輕吹打成為均勻的單細胞懸液，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，以Muticycle AV 軟件分析所得數(shù)據(jù)，實驗重復三次。

1.3.5 細胞遷移侵襲檢測

取1.3.1 中傳代細胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理12 h 后收集各組細胞，以細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移力，各組細胞以完全培養(yǎng)基分別重懸后計數(shù)，以5×105個/mL 的密度接種于6 孔板中，使用無菌直尺做標尺，以200 μL 槍頭在6 孔板中心劃一條直線，以PBS 漂洗干凈劃痕中的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在顯微鏡隨機選取5 個視野觀察并拍照，計數(shù)遷移細胞數(shù)目，取平均值，實驗重復三次。

取1.3.1 中的傳代細胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理12 h 后收集各組細胞，以Transwell侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲力，各組細胞經無血清的RPMI-1640 基礎培養(yǎng)基分別重懸后計數(shù)，調整密度為5×105個/mL，Transwell 上室以基質膠包被后加入200 μL 上述細胞懸液，下室中加入完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，以PBS 漂洗后加入4% 多聚甲醛固定下室細胞，以結晶紫染液染色，在顯微鏡隨機選取5 個視野觀察并拍照，計數(shù)穿膜細胞數(shù)目，取平均值，實驗重復三次。

1.3.6 免疫印跡實驗

取1.3.1 中的傳代細胞接種在12 孔板中，參照1.3.3 中的方法分組處理48 h 后收集各組細胞，加蛋白裂解液( 含有蛋白酶抑制劑) 在冰浴中裂解2 h，轉速3 000 r/min，溫度為4℃，離心20 min，取上清提取總蛋白，以BCA 試劑盒測定蛋白濃度，具體按照說明書操作，調整各組細胞樣品液使蛋白濃度相同，各組細胞分別取20 μL 做SDS-凝膠電泳，轉移蛋白至硝酸纖維膜上，用5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，以相應一抗、二抗孵育，以增強型化學發(fā)光法顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察蛋白條帶并拍照，采用Image Lab 軟件分析數(shù)據(jù)得出蛋白相對表達量，實驗重復三次。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)數(shù)據(jù)以n(%) 表示；計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 RA 對SKOV3 細胞增殖的影響

RA 對SKOV3 細胞增殖有抑制作用，并隨著藥物濃度升高、藥物作用時間增長而增強，在藥物濃度為16 μmol/L，作用48、72 h 后，抑制作用不再增強，趨于穩(wěn)定。48 h 與72 h 相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結果顯示，16 μmol/L 的RA 處理SKOV3 細胞48 h 后，增殖抑制率達(56.87±6.38)%。見圖1。因此，本實驗選擇16 μmol/L 的RA 處理SKOV3 細胞48 h 來進行增殖、凋亡實驗；RA 對SKOV3 細胞增殖的抑制作用可能干擾對其遷移侵襲能力的檢測，為保證實驗結果盡量準確，選擇RA 處理SKOV3 細胞12 h 進行遷移侵襲能力的檢測。

圖1 RA 對SKOV3 細胞增殖抑制率的影響

2.2 RA 對SKOV3 細胞活力的影響

以16 μmol/L 的RA、5 μmol/L 的PDD 處 理SKOV3細胞48 h，RA 組與PDD 組細胞活力顯著低于NC組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 RA 對SKOV3 細胞活力的影響

2.3 RA 對SKOV3 細胞凋亡的影響

RA 組及PDD 組SKOV3 細胞凋亡率顯著高于NC組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖3、圖4。

圖3 RA 對SKOV3 細胞凋亡的影響

圖4 RA 對SKOV3 細胞凋亡的影響

2.4 RA 對SKOV3 細胞遷移的影響

RA 組及PDD 組遷移的SKOV3 細胞數(shù)目顯著低于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖5、圖6。

圖5 RA 對SKOV3 細胞遷移的影響

圖6 RA 對SKOV3 細胞遷移的影響

2.5 RA 對SKOV3 細胞侵襲的影響

與NC 組相比，RA 組和PDD 組侵出transwell 小室的SKOV3 細胞數(shù)目明顯降低(P＜0.05)，RA 組和PDD組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖7、圖8。

圖7 RA 對SKOV3 細胞侵襲的影響

圖8 RA 對SKOV3 細胞侵襲的影響

2.6 RA 對SKOV3 細胞凋亡及EMT 相關蛋白的影響

RA 組 和PDD 組SKOV3 細胞Vimentin、Bcl-2 表達顯著低于NC 組(P＜0.05)，E-cadherin、Bax 表達顯著高于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖9。

圖9 RA 對SKOV3 細胞凋亡及EMT 相關蛋白表達的影響

2.7 RA 對SKOV3 細胞JAK/STAT3 通路相關蛋白的影響

RA組和PDD組SKOV3 細胞p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3 表達顯著低于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖10。

圖10 RA 對SKOV3 細胞JAK/STAT3 通路相關蛋白表達的影響

3 討 論

卵巢癌作為婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐漸上升，且患者也越來越趨于年輕化[10]，腫瘤細胞減滅手術后以紫杉醇聯(lián)合鉑類為主聯(lián)合化療是臨床中治療卵巢癌的標準治療方案，但因大多數(shù)患者已到腫瘤中晚期，易產生化療耐藥性，并復發(fā)轉移，治愈率及患者生存率均很低，因此尋找新的安全有效的藥物具有重要的臨床意義[11]。研究表明，中藥可通過多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用，且毒副作用低、不易產生耐藥性，是近年來研究的熱點[12]，多被銀蓮花的干燥根莖竹節(jié)香附具有明顯的抗腫瘤效應，RA 是其主要的有效活性成分，可通過下調長鏈非編碼RNA HOTAIR 表達抑制胃癌細胞增殖[13]，還可抑制人結腸癌細胞HCT-116 增殖、遷移及侵襲，促進其凋亡[14]，但其對卵巢癌細胞SKOV3 增殖及侵襲轉移能力的影響目前尚不清楚。本文通過以RA處理體外培養(yǎng)的卵巢癌SKOV3 細胞對此進行研究，PDD可與細胞DNA 鏈交叉連接，殺傷細胞，具有明顯的抗腫瘤作用，是臨床上常用的廣譜抗癌藥[15]，因而本文使用PDD 作為陽性藥物，抑凋亡蛋白Bcl-2 與促凋亡蛋白Bax 是細胞凋亡過程中起到重要調節(jié)作用的關鍵蛋白[16]，結果顯示，RA 組與PDD 組SKOV3 細胞活力、Bcl-2 表達顯著低于NC 組，凋亡率、Bax 表達顯著高于NC 組，RA 組和PDD 組相比，各指標無明顯變化，表明RA 可抑制SKOV3 細胞增殖，促進其凋亡；上皮細胞向間質細胞的轉化過程(EMT) 是腫瘤細胞向機體別處遷移侵襲的關鍵步驟，在此過程中，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達下調，間質細胞標志蛋白Vimentin 表達上調[17]，SKOV3 細胞經RA 及PDD 處理后，其侵襲遷移能力、Vimentin 表達明顯降低，E-cadherin 表達明顯增加，RA組和PDD 組相比，各指標無明顯變化，表明RA 可降低SKOV3 細胞遷移侵襲力。

JAK/STAT3 信號通路對腫瘤增殖、凋亡、腫瘤免疫具有重要的調節(jié)作用，卵巢癌組織中JAK/STAT3 信號處于激活狀態(tài)，并促進癌細胞增殖、誘導癌組織中免疫抑制分子PD-L1 的表達，促使卵巢癌細胞免疫逃逸[18]，而陳悅群[19]等發(fā)現(xiàn)，RA 可通過抑制JAK/STAT3 信號通路而抑制人子宮內膜癌HEC-1-B 細胞的侵襲轉移，因而可推測抑制JAK/STAT3 信號激活可能是RA 抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖和侵襲的作用機制，本文研究結果顯示，SKOV3 細胞經RA 及PDD 處理后，細胞p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3 明顯降低，RA 組和PDD 組相比，無明顯變化，表明RA 可抑制卵巢癌SKOV3 細胞JAK/STAT3信號磷酸化激活，揭示RA 抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖和侵襲的作用機制可能是下調JAK/STAT3 信號。

綜上所述，RA 可抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖、體外侵襲轉移，促進其凋亡，為臨床治療卵巢癌提供了新的參考，抑制JAK/STAT3 信號磷酸化激活可能是其作用機制，但本文并未使用JAK/STAT3 通路抑制劑及激活劑對其進行NC 驗證，還存在不足，起確切的分子機制需要進一步的深入研究。