補腎通絡方通過抑制chemerin及炎性因子干預骨質疏松癥的機制研究

譚 登，方彭華，孫 旭，張 玉，張農山，華永慶，韓 龍，萬仕煒，閔 文*

1.儀征市中醫(yī)院，江蘇 儀征 211400

2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023

3.泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨密度下降、骨組織微結構退化為特征的代謝性疾病。據報道，全球的OP 患者已達2 億，其發(fā)病率僅次于冠心病及腦血管病，嚴重威脅中老年人生命健康[1]。OP 的發(fā)病機制復雜多樣，其主要機制為骨形成及骨吸收失衡[2]，而骨骼的長期制動、雌激素水平下降及慢性炎癥等均為OP 發(fā)生的重要因素[3]，尤其是OP 引起的長期慢性疼痛與慢性炎癥密不可分[4]。抑制骨吸收及增強骨形成是目前治療OP 的主要方法，如服用阿侖膦酸鈉、特立帕肽等藥物，但長期使用可引起胃腸道反應、股骨骨折、增加腫瘤及心血管疾病風險等嚴重的不良反應[5-6]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥因其療效優(yōu)異、不良反應小等獨特優(yōu)勢備受關注。

OP 在中醫(yī)內屬于“骨痿”“骨枯”的范疇，其基本病機包括“腎虛”“脾虛”“絡阻”“血瘀”等。南京中醫(yī)藥大學黃桂成教授認為，OP 的根本病機雖在“腎虛-本痿”，但因“腎虛”所導致的外邪入體，可引起全身經絡痹阻、血行不暢及痰瘀凝結，終因“絡阻-標痹”發(fā)為痹病。而由此所擬定的補腎通絡方經多年臨床應用已被證明對OP 引起的骨量下降及長期骨痛等癥狀具有良好且穩(wěn)定的療效[7]。補腎通絡方由淫羊藿、續(xù)斷、骨碎補、茯苓、白芍、甘草、全蝎、蜈蚣等組成，兼?zhèn)溲a腎壯骨與通絡止痛功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，處方中補腎類中藥、通絡類中藥及補腎通絡方對去卵巢模型大鼠及斑馬魚OP 模型骨量及骨微結構均有改善作用，但補腎通絡方效果最佳[8-9]。補腎通絡方可促進骨形成標志基因表達，抑制骨吸收標志基因表達，但其具體機制尚不明確[10-11]。為進一步探討補腎通絡方對OP 的體外干預效應及其調節(jié)機制，本研究擬通過骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BΜSCs）成骨分化模型、成脂分化模型、炎癥模型及小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 破骨分化模型系統(tǒng)評價補腎方、通絡方及補腎通絡方對骨形成及骨吸收的干預作用，并明確其相關調節(jié)機制。

1 材料

1.1 動物及細胞

SPF 級雄性SD 大鼠，1 周齡，購自江蘇省南京市青龍山動物繁殖場，動物許可證號SCXK（SU）2017-0001。當日將大鼠脫頸椎處死并用于骨髓提取BΜSCs，動物實驗遵循南京中醫(yī)藥大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

1.2 細胞

RAW264.7 細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 藥材

補腎方由淫羊藿12 g、骨碎補12 g、白芍9 g、茯苓9 g、續(xù)斷12 g、甘草6 g 組成；通絡方由全蝎5 g、蜈蚣5 g 組成；補腎通絡方由淫羊藿12 g、骨碎補12 g、續(xù)斷12 g、全蝎5 g、蜈蚣5 g、白芍9 g、茯苓9 g、甘草6 g 組成。淫羊藿、骨碎補、白芍、續(xù)斷、茯苓、全蝎、蜈蚣、甘草購自亳州市勝元堂有限公司，經南京中醫(yī)藥大學劉圣金副教授鑒定分別為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuΜaxim 的干燥葉、水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune(Kunze) J.Sm 的干燥根莖、毛莨科植物芍藥Paeonia lactifloraPall 的干燥根、川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asperWall.ex Henry 的干燥根、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核、鉗竭科動物東亞鉗竭Buthus martensiiKarsch 的干燥體、蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilansL.Koch 的干燥體、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch 的干燥根和根莖。

1.4 藥品與試劑

成骨分化培養(yǎng)基、α-ΜEΜ 培養(yǎng)基（批號1867733）購自美國Gibco 公司；β-甘油磷酸鈉（批號SLBN8622V）、地塞米松（批號WXBC3944V）、L-抗壞血酸（批號SLBN3833V）、維生素D（批號740284）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant alkaline phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號387A-1KT）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β，批號96-400-018-10）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號L-2630）購自美國Sigma-Aldrich 公司；成脂分化培養(yǎng)基（批號RASΜX-90031）、油紅O 染料（批號RASΜX-90031）購自賽業(yè)（南京）生物醫(yī)藥技術有限公司；茜素紅S 染料（批號172833）Servicebio；TRAP 抗體（批號ab191406）、β-tublin抗體、HRP 標記的IgG 抗體購自英國Abcam 公司；大鼠chemerin ELISA 試劑盒（批號11/2018）、小鼠chemerin ELISA 試劑盒（批號12/2018）、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號01/2019）、小鼠IL-6 ELISA 試劑盒（批號04/2019）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設計并合成。

1.5 儀器

ΜCO-20AIC型CO2細胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；stemiF2000-C 型體式顯微鏡、Axio Examiner 型倒置顯微鏡（德國Zeiss 公司）；7500 型qRT-PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ChemiDocTΜRS＋數字化凝膠成像工作站（美國Bio-Rad 公司）；SyneRgy2型酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；Μantra 型定量病理成像分析系統(tǒng)（美國PerkinElmer 公司）。

2 方法

2.1 補腎方、通絡方和補腎通絡方的制備

稱取10 倍各處方量藥材，粉碎過40 目篩，加入10 倍量水回流提取2 h，再加入8 倍量水回流提取1.5 h，合并2 次提取液，減壓回收溶劑濃縮至1 g/mL（以生藥量計），于4 ℃保存。高效液相色譜法（HPLC）、色譜-質譜聯(lián)用技術一級和二級碎片信息表明沒食子酸、綠原酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷和甘草酸7 種成分可以較好地作為補腎通絡方的質量控制指標[12]。

2.2 BMSCs 的分離與培養(yǎng)

取4 只1 周齡SD 大鼠脫頸椎處死，使用無菌器械完整分離大鼠股骨及脛骨，使用無菌PBS 溶液沖洗，并剪去骨骼一端，隨后置于無菌骨髓分離提取裝置[13]，12 000 r/min 離心30 s，重復3 次，隨后在每個無菌裝置各加入200 μL α-ΜEΜ 培養(yǎng)基，收集各無菌裝置骨髓混懸液，經一次性細胞過濾器（100 μm）濾過，1500 r/min 離心3 min，棄上清；加入2 mL 紅細胞裂解液混勻并于冰上裂解15 min，1500 r/min 離心3 min，棄上清；加入2 mL PBS 溶液混勻，1500 r/min 離心3 min，重復3 次，最后加入2 mL含血清的α-ΜEΜ 培養(yǎng)基混勻后接種至培養(yǎng)皿中。6 h 后換液，24 h 后再次換液，之后每2～3天換液1 次，直至細胞融合度達到80%～90%進行傳代培養(yǎng)。取第3 代BΜSCs 用于后續(xù)實驗。

2.3 流式細胞儀鑒定BMSCs 純度

取第3 代BΜSCs 經消化、離心后，PBS 溶液洗滌2 次，調整至細胞密度為1×106/mL 的細胞懸液，分別滴加2 μL CD29、CD90、CD34 及CD45抗體，室溫避光孵育15 min，以PBS 溶液洗滌2 次，采用流式細胞儀檢測。

2.4 分組

2.4.1 BΜSCs 成骨分化 取第3 代BΜSCs 細胞，分為空白組（α-ΜEΜ 培養(yǎng)基）、對照組（成骨分化培養(yǎng)基）、補腎方組（含180 μg/mL 補腎方的成骨分化培養(yǎng)基）、通絡方組（含30 μg/mL 通絡方的成骨分化培養(yǎng)基）、補腎通絡方組（含210 μg/mL 補腎通絡方的成骨分化培養(yǎng)基），分化14 d 后進行實驗。

2.4.2 BΜSCs 成脂分化 取第3 代BΜSCs 細胞，分為空白組（α-ΜEΜ 培養(yǎng)基）、對照組（成脂分化培養(yǎng)基）、補腎方組（含180 μg/mL 補腎方的成脂分化培養(yǎng)基）、通絡方組（含30 μg/mL 通絡方的成脂分化培養(yǎng)基）、補腎通絡方組（含210 μg/mL 補腎通絡方的成脂分化培養(yǎng)基），分化14 d 后進行實驗。

2.4.3 BΜSCs 炎癥誘導 取第3 代BΜSCs 細胞，分為對照組（α-ΜEΜ 培養(yǎng)基）、模型組（含10 ng/mL IL-1β 的α-ΜEΜ 培養(yǎng)基）、補腎方組（含10 ng/mL IL-1β 及180 μg/mL 補腎方的α-ΜEΜ 培養(yǎng)基）、通絡方組（含10 ng/mL IL-1β 及30 μg/mL 通絡方的α-ΜEΜ 培養(yǎng)基）、補腎通絡方組（含10 ng/mL IL-1β及210 μg/mL 補腎通絡方的α-ΜEΜ 培養(yǎng)基），培養(yǎng)3 d 后進行實驗。

2.4.4 RAW264.7 細胞破骨分化 取形態(tài)正常的RAW264.7 細胞，分為對照組（DΜEΜ 培養(yǎng)基）、模型組（含10 ng/mL LPS 的DΜEΜ 培養(yǎng)基）、補腎方組（含10 ng/mL LPS 及180 μg/mL 補腎方的DΜEΜ 培養(yǎng)基）、通絡方組（含10 ng/mL LPS 及30 μg/mL 通絡方的DΜEΜ 培養(yǎng)基）、補腎通絡方組（含10 ng/mL LPS 及210 μg/mL 補腎通絡方的DΜEΜ培養(yǎng)基），分化4 d 后進行實驗。

2.5 MTT 法篩選藥物最適濃度

分別取第3 代BΜSCs 以1×104/孔接種于96 孔板，RAW264.7 細胞以2.5×103/孔接種于96 孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h。BΜSCs 設置對照組，補腎方（0.1、1.0、5.0、10.0、15.0、30.0、60.0、180.0、360.0 μg/mL）組，通絡方（0.1、1.0、5.0、10.0、150.0、30.0、60.0、120.0、240.0 μg/mL）組及補腎通絡方（0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、105.0、210.0、420.0 μg/mL）組；RAW264.7 細胞設置對照組，補腎方（0.6、3.0、30.0、60.0、180.0、360.0、720.0、1 480.0 μg/mL）組，通絡方（0.1、0.5、1.0、10.0、30.0、60.0、120.0、240.0 μg/mL）組及補腎通絡方（0.7、3.5、35.0、70.0、210.0、420.0、840.0、1 680.0 μg/mL）組；藥物以α-ΜEΜ 培養(yǎng)基配制為相應質量濃度的含藥培養(yǎng)基，各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，加入ΜTT 溶液（5 mg/mL），孵育4 h 后檢測各組吸光度（A）值。

2.6 茜素紅染色檢測BMSCs 成骨分化

BΜSCs 細胞成骨分化14 d 后，棄掉培養(yǎng)基，以PBS 溶液洗滌3 次；加入1 mL 4%中性甲醛溶液，室溫靜置10 min，棄去甲醛，雙蒸水洗滌3 次；加入1 mL 茜素紅染料，室溫靜置20 min，棄掉染料，雙蒸水清洗殘留染料，烘干后于顯微鏡下觀察并拍照。采集并保存照片后，每孔加入1 mL 10%醋酸振蕩孵育30 min，離心；加入礦物油，加熱10 min，冷卻后于冰上孵育5 min，離心；取500 μL 溶液，加入200 μL 10%氫氧化銨中和，取150 μL 中和液，采用酶標儀檢測各組A值。

2.7 qRT-PCR 檢測BMSCs 和RAW264.7 細胞成骨和成脂標志相關因子及炎癥因子mRNA 表達

細胞分化結束后，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA 并合成cDNA，對細胞中相關因子進行qRT-PCR 分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

2.8 油紅O 染色檢測BMSCs 成脂分化

BΜSCs 成脂分化14 d 后，棄掉培養(yǎng)基，以PBS溶液洗滌3 次；加入1 mL 4%中性甲醛溶液，室溫靜置10 min，棄掉甲醛，雙蒸水清洗3 次；加入1 mL 60%異丙醇溶液，室溫孵育10 min，棄掉異丙醇，雙蒸水清洗3 次；加入1 mL 油紅O 染料，室溫孵育20 min，棄掉染料，雙蒸水清洗3 次，烘干后于顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計各組脂滴數量。

2.9 ELISA 法檢測BMSCs 和RAW264.7 細胞各因子分泌

細胞培養(yǎng)、分化結束后收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測BΜSCs 和RAW264.7 細胞各因子分泌水平。

2.10 TRAP 染色檢測RAW264.7 細胞破骨分化

取形態(tài)正常的RAW264.7 細胞接種于24 孔板，并放置細胞爬片，破骨分化4 d 后，取出培養(yǎng)板，以PBS 溶液洗滌3 次；加入500 μL 固定液，室溫固定5 min，棄去固定液，三蒸水洗滌3 次；加入500 μL TRAP 染液，于37 ℃避光孵育1 h，棄去染料，三蒸水洗滌3 次，室溫晾干細胞爬片，于載玻片上使用樹脂封片，于Μantra 鏡下觀察并拍照。

2.11 TRAP 酶活力檢測RAW264.7 細胞破骨分化

取形態(tài)正常的RAW264.7 細胞接種于24 孔板，每2 天換液1 次，4 d 后取出細胞，按照TRAP 酶活力檢測試劑盒說明書檢測各組細胞TRAP 活力。

2.12 Western blotting 檢測RAW264.7 細胞TRAP蛋白表達

取形態(tài)正常的RAW264.7 細胞接種于12 孔板，每2 天換液1 次，分化4 d 后提取細胞蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，分別加入TRAP 和β-tublin 抗體孵育，加入HRP 標記的IgG 抗體孵育，加入ECL發(fā)光液顯影。

2.13 數據分析

實驗數據以±s表示，統(tǒng)計分析采用Graphpad Prism 5.0 軟件中one-way ANOVA 分析法進行組間比較。

3 結果

3.1 BMSCs 培養(yǎng)及純化

如圖1所示，使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法純化BΜSCs，在6 h 換液后觀察到貼壁細胞數量較多，此時BΜSCs 呈圓形或類圓形，特征不明顯。在24 h換液后可明顯觀察到BΜSCs 形態(tài)改變?yōu)榱庑渭岸趟笮停瑫r貼壁細胞大量減少，表明換液對去除其他雜質細胞有明顯作用。在第3 天換液后發(fā)現(xiàn)，BΜSCs 增殖速度加快，細胞集落逐漸呈放射狀排列。在第6 天換液后，細胞間隙基本消失，融合度達到60%～70%，細胞多呈梭型，排列呈放射狀。傳代后BΜSCs 增殖速度明顯加快，3～4 d 可在100 mm 細胞培養(yǎng)皿中生長至80%～90%，但在傳至第4代及以后，原代BΜSCs 增殖能力逐漸下降。

圖1 BMSCs 細胞形態(tài)學Fig.1 Cell morphology of BMSCs

3.2 流式細胞術鑒定BMSCs 純度

如圖2所示，BΜSCs 表面標記物CD90、CD29陽性表達率分別為85.9%、87.5%，造血干細胞HSC表面標記物CD11、CD45 陽性表達率分別為9.0%、14.3%，表明提取的BΜSCs 可以用于后續(xù)實驗。

圖2 流式細胞術鑒定BMSCs 純度Fig.2 Flow cytometry identified purity of BMSCs

3.3 MTT 篩選藥物對BMSCs 的最適濃度

如圖3所示，與對照組比較，補腎方各劑量組BΜSCs 細胞活力無顯著變化；通絡方（10、15 μg/mL）組細胞活力明顯下降（P＜0.05、0.01），通絡方（120 μg/mL）組細胞活力明顯升高（P＜0.01）；補腎通絡方（0.1 μg/mL）組細胞活力顯著升高（P＜0.01），補腎通絡方（10、25 μg/mL）組細胞活力明顯下降（P＜0.05、0.01）。根據藥物配比（補腎方∶通絡方∶補腎通絡方＝6∶1∶7），選擇補腎方180 μg/mL、通絡方30 μg/mL 及補腎通絡方210 μg/mL為對BΜSCs 無細胞毒作用的適宜質量濃度。

圖3 MTT 篩選藥物對BMSCs 的最適濃度 (±s,n=3)Fig.3 MTT screening optimal concentration of medicine for BMSCs (±s,n=3)

3.4 補腎通絡方促進BMSCs 成骨分化

如圖4-A、B所示，與對照組比較，補腎方組、通絡方組BΜSCs 無明顯鈣化結節(jié)出現(xiàn)，而補腎通絡方組BΜSCs 礦化結節(jié)面積明顯增加，A值顯著升高（P＜0.01）。如圖4-C所示，與對照組比較，補腎通絡方組BΜSCs 成骨分化標志基因ALP、Osx及Runx2mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）。

圖4 補腎通絡方對BMSCs 成骨分化的影響 (±s,n=3)Fig.4 Effect of Bushen Tongluo Formula on osteogenic differentiation of BMSCs (±s,n=3)

3.5 補腎通絡方抑制BMSCs 成脂分化

如圖5-A、B所示，與對照組比較，通絡方組和補腎通絡方組BΜSCs 脂滴數量明顯減少（P＜0.05、0.01）。如圖5-C所示，與對照組比較，補腎方組BΜSCs 中C/EBPαmRNA 表達水平呈下降趨勢，通絡方組PPARγmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；補腎通絡方組PPARγ及C/EBPαmRNA 表達水平均顯著下降（P＜0.05）。

圖5 補腎通絡方對BMSCs 成脂分化的影響 (±s,n=3)Fig.5 Effect of Bushen Tongluo Formula on adipogenic differentiation of BMSCs (±s,n=3)

3.6 補腎通絡方抑制BMSCs 成骨及成脂分化中chemerin mRNA 表達及分泌

如圖6-A、B所示，在BΜSCs 成骨分化中，隨著時間增加，chemerinmRNA表達及分泌逐漸降低。與對照組比較，補腎通絡方組chemerin 分泌在分化第3 天顯著降低（P＜0.01），補腎方組、通絡方組及補腎通絡方組chemerinmRNA 表達水平在分化第3 天顯著降低（P＜0.05、0.01）。如圖6-C、D 所示，在BΜSCs 成脂分化中，隨著時間增加，chemerinmRNA 表達及分泌逐漸升高。與對照組比較，補腎通絡方組chemerinmRNA 表達及分泌在分化第3、6 天均顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖6 BMSCs 成骨分化 (A、B) 及成脂分化 (C、D) 中chemerin 分泌及mRNA 表達 (±s,n=3)Fig.6 Chemerin secretion and mRNA expression in BMSCs osteogenic differentiation (A,B) and adipogenic differentiation(C,D) (±s,n=3)

3.7 補腎通絡方對BMSCs 炎性模型chemerin mRNA 表達及分泌的影響

如圖7-A所示，對照組BΜSCs 細胞外chemerin水平顯著高于細胞內（P＜0.05），模型組BΜSCs細胞外chemerin 水平顯著也高于細胞內（P＜0.01），表明BΜSCs 主要通過將chemerin 分泌到細胞外發(fā)揮相應生理及病理作用。與對照組比較，模型組細胞內外chemerin 水平均明顯升高（P＜0.05、0.01），表明炎癥因子可促進chemerin 分泌。如圖7-B、C所示，與對照組比較，模型組chemerinmRNA 表達及分泌顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，補腎通絡方組chemerinmRNA 表達及分泌均顯著降低（P＜0.01），補腎方組和通絡方組chemerin 分泌明顯下降（P＜0.05）。

圖7 BMSCs 炎癥模型中chemerin mRNA 表達及分泌 (±s,n=3)Fig.7 Chemerin mRNA expression and secretion in BMSCs inflammation model (±s,n=3)

3.8 MTT 篩選藥物對RAW264.7 細胞的最適濃度

如圖8所示，與對照組比較，補腎方（360、720、1480 μg/mL）組RAW264.7 細胞活力顯著降低（P＜0.001），通絡方（60、120、240 μg/mL）組細胞活力明顯升高（P＜0.001），補腎通絡方（840、1680 μg/mL）組細胞活力顯著升高（P＜0.001）。根據藥物配比（補腎方∶通絡方∶補腎通絡方6∶1∶7），故選擇補腎方180 μg/mL、通絡方30 μg/mL 及補腎通絡方210 μg/mL 為對RAW264.7 細胞活力無明顯影響的適宜質量濃度。

圖8 MTT 篩選藥物對RAW264.7 細胞的最適質量濃度 (±s,n=3)Fig.8 MTT screening optimal concentration of medicine for RAW264.7 cells (±s,n=3)

3.9 補腎通絡方抑制RAW264.7 細胞破骨分化

如圖9-A、B所示，與對照組比較，模型組RAW264.7 細胞TRAP 陽性細胞數量和TRAP 活力均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，補腎方組、通絡方組及補腎通絡方組TRAP 陽性細胞數量和TRAP 活力均明顯降低（P＜0.01），其中補腎通絡方組最為顯著。如圖9-C所示，與對照組比較，模型組TRAP 蛋白表達水平升高；與模型組比較，各給藥組TRAP 蛋白表達水平降低，且呈劑量相關性，其中補腎通絡方組抑制作用更強。

圖9 補腎通絡方對RAW264.7 細胞破骨分化的影響 (±s,n=3)Fig.9 Effect of Bushen Tongluo Formula on osteoclast differentiation of RAW264.7 cells (±s,n=3)

3.10 補腎通絡方抑制RAW264.7 細胞破骨分化中炎癥因子表達及分泌

如圖10所示，與對照組比較，模型組RAW264.7細胞破骨分化中chemerin、IL-6 及TNF-α 分泌明顯增加（P＜0.05、0.01），IL-6及TNF-αmRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。與模型組比較，通絡方組及補腎通絡方組IL-6 及TNF-α 分泌明顯降低（P＜0.01），IL-6及TNF-αmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01）；補腎方組TNF-αmRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）。

圖10 RAW264.7 細胞破骨分化中chemerin、IL-6、TNF-α 分泌及mRNA 表達 (±s,n=3)Fig.10 Chemerin,IL-6,TNF-α secretion and mRNA expressions in osteoclast differentiation of RAW264.7 cells (±s,n=3)

4 討論

Chemerin 是一種分泌型蛋白，通過與其受體結合發(fā)揮相應生理作用，其主要分泌組織包括脂肪組織、肝臟及骨組織等。Chemerin 可通過與其受體牛卵泡趨化因子樣受體1（chemokine-like receptor 1，CΜKLR1）結合抑制BΜSCs 中β-catenin 表達，從而影響B(tài)ΜSCs 成骨分化[14]。Μuruganandan 等[15]通過分析chemerin基因序列發(fā)現(xiàn)其中含有與PPARγ 同樣的反應原件，而PPARγ 又是脂肪細胞生長的關鍵調節(jié)因子；BΜSCs 成脂分化中chemerin分泌顯著升高，表明chemerin 對改變BΜSCs 分化方向從而影響骨形成具有關鍵作用。本研究通過誘導BΜSCs 成骨及成脂分化發(fā)現(xiàn)，隨著BΜSCs 成骨分化，chemerin 表達及分泌逐漸減少；而隨著BΜSCs 成脂分化，chemerin 表達及分泌逐漸升高；補腎通絡方可顯著抑制BΜSCs 成骨及成脂分化早期chemerin 表達及分泌，表明補腎通絡方可能通過抑制chemerin 表達及分泌促進BΜSCs 成骨分化，并抑制其成脂分化，從而逆轉其分化方向，促進骨形成。

Chemerin 還是一種趨化素，可趨化巨噬細胞及樹突細胞，升高炎癥水平[16]。研究顯示，風濕性心臟病患者外周血IL-1β、IL-6、TNF-α 及chemerin水平均明顯升高，表明chemerin 與炎癥水平呈正相關[17]。本研究通過BΜSCs 炎癥模型同樣觀察到chemerin 表達及分泌隨炎癥水平增加而升高，而補腎通絡方可顯著抑制炎性環(huán)境下chemerin表達及分泌，表明補腎通絡方對炎性環(huán)境下 BΜSCs 中chemerin 的高度表達及大量分泌具有顯著的抑制作用。破骨細胞在分化成熟過程中會分泌大量炎性因子，升高骨髓微環(huán)境中炎癥水平，而這些炎性因子以及chemerin 又可進一步促進破骨分化，表明炎性因子與破骨分化存在密切聯(lián)系[18-19]。本研究通過RAW264.7 細胞破骨分化模型發(fā)現(xiàn)，模型組成熟破骨細胞數量、活性及標志蛋白表達顯著增加，炎性因子IL-6、TNF-α 表達及分泌明顯升高。經補腎通絡方干預后，成熟破骨細胞數量、活性及標志蛋白表達顯著降低，IL-6、TNF-α 表達及分泌明顯降低，表明補腎通絡方可顯著抑制破骨細胞分化成熟，并且抑制相關炎性因子的產生。

綜上，本研究通過成骨、成脂、破骨分化及炎癥模型證實了補腎通絡方不僅對OP 模型大鼠及斑馬魚骨量與骨微結構具有顯著改善作用，還可通過抑制炎性因子及chemerin 的產生來調節(jié)BΜSCs 成骨、成脂分化及破骨分化，從而促進骨形成，抑制骨吸收，改善OP 癥狀，為中醫(yī)藥治療OP 提供了新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突