薄皮甜瓜品種翡翠的SSR快速鑒定技術(shù)的應(yīng)用

鄧竹根，夏偉偉，倪婷婷，楊卓，喬宇，賈永靜，李曼

（1.安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司，合肥，230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學）

甜瓜（Cucumis mel oL.），又稱香瓜，是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓性草本植物，是人們喜愛的十大水果之一[1]。薄皮甜瓜又稱中國甜瓜，可連皮食用，薄皮甜瓜品種翡翠品質(zhì)佳、抗逆性好、含糖量高，推廣面積大，深受消費者喜愛。

農(nóng)作物品種的快速鑒定技術(shù)不僅可以保護種子生產(chǎn)企業(yè)的權(quán)益，還是凈化種業(yè)市場的種業(yè)保障[2]。SSR標記，也稱簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）[3]，因具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富等特點，而成為有價值的遺傳標記被廣泛應(yīng)用[4]，同時SSR檢測標記技術(shù)對樣品DNA質(zhì)量要求極低，用普通的堿煮法提取即可，甚至幾分鐘便可提取，可實現(xiàn)種子純度快速鑒定[5，6]。與傳統(tǒng)田間鑒定相比，其不僅不受天氣影響，而且不受時間空間限制，可以隨時隨地地對樣本進行室內(nèi)檢測鑒定，廣泛應(yīng)用于多種作物雜交種純度鑒定和指紋圖譜建立[7～12]。SSR分子標記法是通過雙親本基因上的差異來鑒定雜交種純度，而大田則以表型鑒定為依據(jù)，如果分子鑒定和表型鑒定不一致就會導致鑒定誤差。

本研究利用甜瓜8對特異性SSR分子標記對薄皮甜瓜品種翡翠進行鑒定，通過田間人為摻雜試驗和對往年田間鑒定的翡翠進行鑒定試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中1對特異性SSR分子標記可以用于薄皮甜瓜品種翡翠的純度鑒定。

本研究的目的是利用SSR分子標記篩選出可以進行室內(nèi)純度鑒定的引物，并利用該引物，對實際樣品進行快速檢測，實現(xiàn)室內(nèi)檢測的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

翡翠品種的親本由安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司親本資源庫提供，翡翠F1代商品種由該公司質(zhì)保部提供。

1.2 試驗設(shè)計

首先，對翡翠親本及F1代種子進行SSR引物篩選，確定親本差異、能用于F1代鑒定的SSR引物；其次，開展田間人為摻雜試驗，進行室內(nèi)與大田一一對應(yīng)鑒定，驗證室內(nèi)分子純度鑒定的準確性；最后，將往年翡翠F1代田間鑒定的樣本進行室內(nèi)分子鑒定，驗證符合率，確定薄皮甜瓜品種翡翠的SSR快速鑒定技術(shù)的實際應(yīng)用。

室內(nèi)分子鑒定，于2020年4月在合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)橋沖村江淮園藝示范園分子實驗室完成；大田鑒定，于2020年4～5月在合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)橋沖村江淮園藝示范園示范大棚內(nèi)完成。

1.3 藥品及生化試劑

試驗過程中用到的化學藥品均購自國藥公司；Taq酶、dNTPs、DNA Marker購自康為世紀生物科技有限公司，PCR所用的SSR引物[7，13～15]由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其他試劑由合肥化學試劑公司提供。

1.4 本文所選鑒定SSR引物信息

翡翠純度鑒定SSR引物信息見表1。

表1 甜瓜翡翠純度鑒定SSR引物信息

1.5 DNA提取

①CTAB法 用CTAB法提取甜瓜親本材料葉片總DNA。用超微量濃度測定儀檢測DNA的濃度和質(zhì)量，并根據(jù)檢測濃度的結(jié)果將DNA稀釋到50～100 ng/L。

②熱堿法 根據(jù)農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程選取翡翠F1代種子250粒左右，浸種催芽后，待芽長至1 cm左右時，置于96孔板中，共2板，加入100μL NaOH溶液（0.2 mol/L），100℃加熱60 min，冷卻后加入10μL Tris-HCl溶液（pH值6.0），混勻短暫離心，上清液即為DNA模板。

1.6 PCR擴增

PCR反應(yīng)體積為20μL：其中ddH2O為13.5μL，10×PCR緩沖液（含Mg2+）為2.0μL，dNTPs為0.5μL，上、下游引物各1μL，模板DNA為2μL，Taq酶為0.1μL。在基因擴增儀上進行片段擴增。反應(yīng)的步驟為：94℃預(yù)變性3 min，94℃45 s，53℃30 s，72℃30 s，32個循環(huán)，最后72℃3 min，25℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 電泳拍照

電泳采用3%（w）濃度的瓊脂糖，電泳方法為電壓220 V、電流100 A、電泳40 min，結(jié)束后置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

以篩選出來的SSR分子標記為擴增引物，對送檢樣本進行PCR擴增，通過帶型統(tǒng)計，用具有該品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣本種子粒數(shù)的百分率表示純度。對未擴增出條帶的樣本需從待檢樣本總數(shù)中扣除，計算公式如下：純度（%）=（具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)/出現(xiàn)帶型的樣本總數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本材料引物篩選

利用甜瓜8對SSR引物對翡翠品種親本及F1代進行篩選，篩選出4對有差異的引物（圖1），分別為TG1、TG4、TG5和TG7。

從圖1可知，引物TG1顯示父母本差異明顯，但是純度鑒定時父本條帶不易區(qū)別，因為父本條帶在F1中沒有體現(xiàn)出來。引物TG5顯示父母本與F1差異明顯，但是父母本差異微弱。引物TG4和TG7顯示父母本條帶差異明顯，而且能夠在F1代中體現(xiàn)。綜合考慮，筆者選用引物TG4對翡翠品種進行室內(nèi)分子純度鑒定。

圖1 翡翠品種親本及F1代引物篩選PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.2 田間人為摻雜鑒定結(jié)果

田間鑒定于2020年4～5月在合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)橋沖村江淮園藝示范園示范大棚內(nèi)完成。為了驗證室內(nèi)鑒定的準確性，公司生產(chǎn)人員在大田定植時，人為添加母本材料在商品種內(nèi)一同定植并編號記錄，2周后室內(nèi)按照定植順序采樣檢測，為與生產(chǎn)編號保持一致，按照定植間距，判斷植株死亡情況，分子檢測結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，室內(nèi)鑒定出8株雜株，編號為：4、13、17、21、27、32、36和42號。其中，5、9、37和39號植株田間死亡，與生產(chǎn)人員人為摻雜編號相同，符合率100%。另外，如圖2所示，41號顯示為父本條帶，在生產(chǎn)制種過程中，不可能出現(xiàn)父本雜株，室內(nèi)標記為異株。結(jié)果表明，甜瓜SSR引物TG4室內(nèi)分子純度鑒定與田間實際鑒定結(jié)果相符。

圖2 田間人為摻雜后鑒定結(jié)果

2.3 室內(nèi)鑒定應(yīng)用

為了進一步驗證室內(nèi)純度檢測的可靠性，公司將往年銷售的翡翠品種合格的種子（田間鑒定結(jié)果為98.4%）安排室內(nèi)檢測。根據(jù)農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程選取192粒種子的芽進行純度檢測，檢測結(jié)果如圖3所示，在192個芽中，鑒定有效數(shù)為187個，其中雜株5個（圖3、4紅色橢圓圈），純度為97.3%，與大田往年鑒定結(jié)果符合率高達99%以上。結(jié)果表明，該SSR引物的純度鑒定結(jié)果真實、快速、可靠，可以替代大田鑒定。

圖4 第二板翡翠品種室內(nèi)檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

對比試驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)鑒定結(jié)果與田間鑒定存在一定的誤差，原因可能有2點：①田間鑒定株數(shù)在70株左右，而實驗室鑒定種子數(shù)為192粒，導致最后統(tǒng)計結(jié)果有偏差；②田間鑒定主要由有經(jīng)驗的農(nóng)藝師依據(jù)品種的主要田間表型進行鑒定，而SSR分子標記法未能準確定位相關(guān)表型，導致結(jié)果偏差。

本研究利用8對甜瓜SSR引物對翡翠品種的親本進行篩選，篩選出4對有差異的引物，再結(jié)合商品F1代進行驗證得到最優(yōu)引物（引物編號TG4）。結(jié)合田間一一對應(yīng)鑒定試驗和對比往年田間鑒定試驗發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)快速鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果符合率高達99%以上。從鑒定時間和成本角度考慮，室內(nèi)鑒定明顯優(yōu)于大田鑒定。該技術(shù)現(xiàn)已在本公司開展實際應(yīng)用。