日糧添加尿素對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖、凋亡以及吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響

陸鐘巖，張?chǎng)┹?，阿合拉·托留?/p>

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)試驗(yàn)室，江蘇南京 210095

2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095

0 引言

反芻動(dòng)物（如奶牛、綿羊和山羊等）是重要的農(nóng)用動(dòng)物，它們依靠瘤胃共生微生物分解植物蛋白和非蛋白氮源（尿素），并將分解產(chǎn)物合成反芻動(dòng)物可以利用的微生物蛋白，為動(dòng)物體提供營(yíng)養(yǎng)。在目前的大規(guī)模集約化畜牧生產(chǎn)中，大多數(shù)養(yǎng)殖者通過(guò)飼喂高精料日糧來(lái)提高動(dòng)物的肉、奶產(chǎn)量。豆粕是反芻動(dòng)物飼養(yǎng)中常用和主要的蛋白來(lái)源，在第三世界國(guó)家中，大豆也是人類(lèi)消費(fèi)的重要糧食之一，同時(shí)養(yǎng)豬業(yè)和家禽養(yǎng)殖業(yè)也將大豆作為飼料的主要蛋白成分。加之新冠肺炎疫情的影響和過(guò)去幾年的中美貿(mào)易爭(zhēng)端，造成了主要農(nóng)業(yè)國(guó)減產(chǎn)，國(guó)際市場(chǎng)的大豆價(jià)格可能會(huì)大幅提高。而我國(guó)作為主要的大豆進(jìn)口國(guó)，進(jìn)口的大豆主要制造動(dòng)物飼料，大豆價(jià)格上漲無(wú)形中提高了動(dòng)物飼養(yǎng)的成本。因此，研究在反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中的替代氮源，包括植物蛋白氮和非蛋白氮，將有助于降低飼養(yǎng)成本，減少對(duì)大豆進(jìn)口的依賴(lài)。

尿素是一種參與反芻動(dòng)物蛋白代謝的非蛋白氮源之一，氮含量高且價(jià)格低廉。反芻動(dòng)物自身的尿素在肝臟中通過(guò)鳥(niǎo)氨酸-尿素循環(huán)產(chǎn)生，并通過(guò)肝靜脈進(jìn)入血液。肝臟合成的尿素可以再循環(huán)回消化道或排泄到尿液中[1，2]。在反芻動(dòng)物的消化道中，瘤胃是最大、最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收室。在瘤胃中，無(wú)論是日糧中或者是循環(huán)回消化道的尿素都會(huì)被微生物分解生成氨（NH3）[3]，并將其作為合成微生物蛋白的原料，從而促進(jìn)微生物生長(zhǎng)[4]。瘤胃微生物與消化液混合后流入小腸。在小腸中，微生物蛋白通過(guò)酶解釋放氨基酸和核酸[5]。通過(guò)這種方式，將反芻動(dòng)物無(wú)法利用的日糧中的蛋白氮和尿氮分解成NH3-N，NH3-N通過(guò)微生物固氮轉(zhuǎn)化為宿主可用的微生物蛋白氮，為宿主提供營(yíng)養(yǎng)?？茖W(xué)家長(zhǎng)期以來(lái)一直在研究用尿素作為一種低成本氮源，以取代反芻動(dòng)物日糧中的一部分植物蛋白成分[6]，但不能過(guò)度使用，在畜牧生產(chǎn)中，日糧中添加尿素能夠大幅提高反芻動(dòng)物瘤胃中NH3的濃度，提高動(dòng)物NH3中毒的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)尿素添加量達(dá)到25 g/kg干物質(zhì)（DM）時(shí)，會(huì)降低動(dòng)物的干物質(zhì)攝入量和體重增加值[7]。

Abdoun等[8]報(bào)告，當(dāng)瘤胃液的生理pH值低于6.5，瘤胃內(nèi)的NH3主要以NH4+的形式被吸收。瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)NH4+的吸收需要載體或通道的幫助，與NH3相比，其吸收速度較慢。理論上，瘤胃液體的低pH值可以降低NH3從瘤胃進(jìn)入血流的吸收率，降低NH3中毒的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)飼喂高精料日糧可升高瘤胃中短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）的產(chǎn)生，降低瘤胃pH值[9]，從而降低因日糧中添加尿素產(chǎn)生NH3中毒的風(fēng)險(xiǎn)?；谝陨侠碚?，Xu等[10]將尿素與高精日糧（45%NFC）混合飼喂，證明了高精日糧飼喂條件下尿素可替代75%的日糧蛋白，而不對(duì)動(dòng)物體造成危害。Lu等[11]研究了添加尿素后瘤胃微生物組及其鎳依賴(lài)性微生物群落的變化，并進(jìn)一步分析了瘤胃環(huán)境因素（包括發(fā)酵變量和鎳濃度）在這些群落重建中的作用。但是目前缺少日糧添加尿素對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞功能，特別是增殖、凋亡和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能影響的研究。由于中精日糧（30%NFC）可以顯著提高瘤胃上皮細(xì)胞的增殖、凋亡和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能，因此，在本研究中，采用尿素與中精日糧混合并取代日糧中部分豆粕的方案，在整體動(dòng)物水平上與粗料飼喂條件下的瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)比，研究日糧添加尿素對(duì)胃上皮細(xì)胞增殖、凋亡和上皮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)基因表達(dá)的影響；并在組織水平上研究尿素對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力的調(diào)節(jié)。由于之前的研究表明，飼喂中精日糧可以顯著調(diào)節(jié)研究瘤胃發(fā)酵參數(shù)、加快瘤胃上皮細(xì)胞的增殖與凋亡和增強(qiáng)上皮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能。所以，進(jìn)一步探討添加尿素取代日糧中的部分豆粕之后，尿素+中精日糧對(duì)瘤胃上皮功能的調(diào)節(jié)與中精日糧相比是否有改變。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物飼養(yǎng)

從溧水山羊養(yǎng)殖場(chǎng)（江蘇省南京市）購(gòu)得18 只波雜山羊（4月齡，體重14～16 kg）。飼養(yǎng)地點(diǎn)為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物房，每只羊被飼養(yǎng)在單獨(dú)的欄舍里，可以自由飲水。在14 天適應(yīng)期（只飼喂干草飼料）后，將山羊隨機(jī)分為3 組，分別接受含有無(wú)尿素+純粗料（LC組，n=6）、0%緩釋尿素+30%精料（MC組，有豆粕，n=6）以及1%DM緩釋尿素+30%精料（Urea組，部分豆粕被替代，n=6）的飼料。日糧符合《NY/T816—2004 產(chǎn)肉山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》的營(yíng)養(yǎng)要求，日糧的成分和化學(xué)成分見(jiàn)表1。在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)對(duì)飼料進(jìn)行取樣分析，樣品的干物質(zhì)、灰分、粗脂肪和粗蛋白含量按照AOAC程序進(jìn)行分析。根據(jù)Van Soest等[12]的程序分析酸性洗滌劑纖維（ADF）和中性洗滌劑纖維（NDF）值。

表1 日糧營(yíng)養(yǎng)和化學(xué)成分

在試驗(yàn)期間，每天07：00和19：00時(shí)喂食混合日糧，每天測(cè)量每只山羊的采食量和剩余日糧量。連續(xù)飼喂28 天，在第29天，18 只山羊在早晨喂食后6h在當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)屠宰，并收集瘤胃內(nèi)容物和上皮。瘤胃內(nèi)容物通過(guò)4 層粗棉布過(guò)濾，四等分（50 mL）的瘤胃液體儲(chǔ)存在-20℃用于SCFA濃度、pH值和NH3-N濃度測(cè)定。自瘤胃腹側(cè)盲囊采集上皮并剪成1cm×1cm的小塊，沖洗，放置在RNALate溶液中過(guò)夜，然后在-80 ℃下儲(chǔ)存，用于mRNA提取和Real-Tme PCR，如下所述。在試驗(yàn)的最后1 天，在早晨喂食前1 h，通過(guò)頸靜脈穿刺將血樣采集到5mL EDTA涂層真空采集器管中。立即將血樣置于冰上，4 ℃，1 500 r/min，離心15 min以獲得血清，然后在-20 ℃下儲(chǔ)存。

1.2 瘤胃NH3-N、SCFA 濃度以及pH 值的測(cè)定

按照Yang 等[13]的方法，使用氣相色譜儀（HP6890N，Agilent Technologies，Wilmington，DE）測(cè)定瘤胃SCFA濃度；采用NH3分析試劑盒（南京建成，中國(guó)南京）測(cè)定瘤胃NH3-N濃度。在雙尾T檢驗(yàn)中，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異被認(rèn)為是顯著的；使用pH計(jì)進(jìn)行瘤胃pH值測(cè)定（Mettler Toledo Delta 320；Mettler-Toledo Group，Halstead，=UK）。

1.3 瘤胃上皮的形態(tài)學(xué)觀(guān)察

根據(jù)Malhi等[14]的描述，測(cè)量了瘤胃乳頭的密度、長(zhǎng)度和寬度，即使用1 cm2福爾馬林固定的瘤胃上皮計(jì)算乳頭密度（乳頭個(gè)數(shù)/cm2）。使用滑動(dòng)卡尺測(cè)量福爾馬林固定上皮樣本中的15 個(gè)乳頭的長(zhǎng)度和寬度。

用Odongo等[16]的方法，將單個(gè)福爾馬林固定乳頭包埋在石蠟中，并以6 μm厚切片。每個(gè)切片用蘇木精和曙紅染色，然后安裝在載玻片上進(jìn)行顯微鏡分析。瘤胃上皮每個(gè)樣品選四張切片，使用Image Pro Plus6.0軟件（Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA）觀(guān)察所有樣本中上皮細(xì)胞的形態(tài)，每個(gè)切片選取4 個(gè)區(qū)域，計(jì)算單位面積內(nèi)顆粒層和棘突層細(xì)胞個(gè)數(shù)和單位長(zhǎng)度上的基底層細(xì)胞個(gè)數(shù)。

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10 000 個(gè)細(xì)胞，CELLQuest軟件收集細(xì)胞大小及細(xì)胞DNA含量等數(shù)據(jù)，ModFit LT for Macintosh軟件分析結(jié)果。

1.4 Real-Tme PCR

用Neasy微型試劑盒（Qiagen，Shanghai，China）從瘤胃上皮提取總RNA。使用隨機(jī)六聚體引物（Invitrogen，Shanghai，China）和M-MLV（莫羅尼鼠白血病病毒）逆轉(zhuǎn)錄酶（Fermentas，Burlington，ON，Canada）合成cDNA。使用StepOne Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，Den Ijssel，Netherlands）和SYBR Green（Roche，Shanghai，China）進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）作為管家基因。根據(jù)NCBI中的可用序列設(shè)計(jì)靶基因的引物（表2）。引物的擴(kuò)增效率通過(guò)一系列稀釋的上皮cDNA測(cè)定。所有樣品均一式三份，并根據(jù)2-ΔΔCT法[15]。利用擴(kuò)增結(jié)束時(shí)進(jìn)行的熔融曲線(xiàn)分析，檢查擴(kuò)增產(chǎn)物的特性和純度。

表2 Real-time PCR 引物

1.5 Ussing Chamber 瘤胃上皮離體培養(yǎng)

利用Ussing Chamber上皮體外培養(yǎng)系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)量尿素跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)率，研究尿素特異性載體，尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-B（UT-B）的蛋白活性。按照Lu等[9]的方法配置標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，配方見(jiàn)表3，并保持38 ℃，動(dòng)物在屠宰后2～3min內(nèi)從腹腔取出前胃。從腹側(cè)囊取出一塊約400 cm2的瘤胃壁，在38 ℃緩沖溶液中反復(fù)清洗，并從肌肉層剝離。隨后將組織浸泡在通有95%CO2和5%O2的緩沖溶液中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。取瘤胃上皮（3 cm ×3 cm）安裝在Ussing Chamber培養(yǎng)小室的兩半之間，暴露面積為3.14 cm2。系統(tǒng)兩側(cè)注入16 mL培養(yǎng)液，配方見(jiàn)表3，對(duì)安裝好的組織進(jìn)行浸泡，并在38 ℃下用O2/CO2（5:95）的混合氣體進(jìn)行充氣，模擬瘤胃和血液環(huán)境，并設(shè)定瘤胃上皮乳頭一側(cè)為瘤胃?jìng)?cè)，對(duì)側(cè)為血液側(cè)。根據(jù)Lu等[9]的方法進(jìn)行電生理參數(shù)監(jiān)控，上皮的瘤胃?jìng)?cè)培養(yǎng)pH值保持在6.4，血液側(cè)pH保持在7.4，向血液側(cè)加入C14標(biāo)記的尿素。培養(yǎng)一段時(shí)間后從瘤胃?jìng)?cè)采集培養(yǎng)液，并與閃爍液混合（Rotiszint，Roth–Karlsruhe，Germany），通過(guò)使用β計(jì)數(shù)器（LKB Wallace Perkin Elmer；überlingen，Germany）。測(cè)定培養(yǎng)液中出現(xiàn)的放射性進(jìn)而來(lái)計(jì)算尿素在瘤胃上皮的轉(zhuǎn)運(yùn)率。

表3 Ussing chamber 培養(yǎng)液配方

2 結(jié)果

2.1 各組瘤胃發(fā)酵參數(shù)、血漿尿素氮（BUN）濃度比較

如表4結(jié)果所示，與LC組相比，Urea組的乙酸、丙酸、丁酸和總SCFA濃度均顯著增加，分別增加約30%、50%、35%和35%（P<0.05）。同時(shí)，丙酸、丁酸和總SCFA的濃度在Urea組和MC組之間并未顯示出顯著變化（P>0.05）。Urea組的瘤胃pH值與LC組相比顯著降低（P<0.05），與MC組相比則無(wú)出顯著差異（P>0.05）。隨著日糧精料的增加，瘤胃NH3-N和BUN濃度顯著升高（P<0.05）。而Urea組的瘤胃NH3-N和BUN濃度顯著高于MC組（P<0.05）。

將職務(wù)犯罪調(diào)查中的技術(shù)運(yùn)用劃分為兩條涇渭分明的路線(xiàn)，并非是將這樣的路線(xiàn)之爭(zhēng)實(shí)質(zhì)化，而是將其中的技術(shù)原理予以提煉后，分析國(guó)家對(duì)職務(wù)犯罪調(diào)查技術(shù)運(yùn)用的制度安排。從目前來(lái)看，國(guó)家對(duì)于職務(wù)犯罪調(diào)查的技術(shù)安排體現(xiàn)為發(fā)展與制約并重。一方面，在技術(shù)運(yùn)用較為薄弱的科學(xué)技術(shù)方面強(qiáng)化投入與產(chǎn)出，在最短的時(shí)間內(nèi)提升戰(zhàn)斗力。另一方面，通過(guò)制度設(shè)計(jì)制約人文技術(shù)，使其始終保持在穩(wěn)定可控的范圍內(nèi)。這樣揚(yáng)長(zhǎng)避短的制度思路或許還將長(zhǎng)期存在于職務(wù)犯罪調(diào)查的技術(shù)安排之中。

表4 對(duì)比各組瘤胃發(fā)酵參數(shù)和血漿Urea-N 濃度（n=6）

2.2 瘤胃上皮的形態(tài)學(xué)分析

如表5結(jié)果所示，由于日糧精料水平的增加，MC組與LC組相比，瘤胃乳頭的長(zhǎng)度、寬度和密度均顯著增加（P<0.05）。Urea組與LC組相比，這些參數(shù)同樣顯著增加（P<0.05）。而Urea組和MC組相比，瘤胃乳頭的以上參數(shù)差異均不顯著（P<0.05）。通過(guò)計(jì)算Urea組單位面積瘤胃上皮內(nèi)乳頭吸收面積顯著高于LC組，同時(shí)低于MC組，但是降低趨勢(shì)并不明顯（P>0.05）。

表5 對(duì)比各組瘤胃上皮乳頭參數(shù)（n=6）

如表6結(jié)果所示，與LC組相比，Urea組和MC組瘤胃上皮棘突層和顆粒層細(xì)胞密度以及層數(shù)顯著升高（P<0.05），Urea組與MC相比較則不顯著；而3組之間基底層細(xì)胞層數(shù)和細(xì)胞數(shù)量無(wú)差異顯著。

表6 對(duì)比各組瘤胃上皮形態(tài)學(xué)變化

2.3 各組瘤胃上皮細(xì)胞周期的比較

如表7所示，與LC組相比，Urea組山羊瘤胃上皮細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞百分率均顯著升高（P<0.05），Urea組與MC相比較則不顯著；Urea 組的G0/G1 期細(xì)胞百分率顯著低于LC 組（P<0.05），但與MC組之間差異不顯著。

表7 對(duì)比各組瘤胃上皮細(xì)胞周期的變化1

2.4日糧添加尿素對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

如圖1結(jié)果所示，Urea組山羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖相關(guān)基因cyclin A、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E1、CDK1、CDK2、CDK4、和CDK6mRNA表達(dá)均顯著高于LC組（P<0.05），同時(shí)這些基因的表達(dá)量與MC組無(wú)顯著差異。

圖1 瘤胃上皮細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA 表達(dá)

如圖2結(jié)果所示，Urea組山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、p53、Bcl 2與Bax的mRNA表達(dá)都顯著高于LC組（P<0.05），與MC組相比Caspase 9、Bax的表達(dá)量顯著降低（P<0.05），Bax則顯著升高（P<0.05），其余基因無(wú)顯著差異。

圖2 瘤胃上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)

2.5日糧添加尿素對(duì)山羊瘤胃上皮SCFA 轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA 表達(dá)的影響

如圖3 所示，Urea 組山羊瘤胃上皮三種SCFA–/HCO3

圖3 瘤胃上皮SCFA 轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA 表達(dá)

–交換載體DRA、PAT1和AE2的m RNA 的表達(dá)顯著高于LC 組（P<0.05），兩 種SCFA–與H+的共轉(zhuǎn)運(yùn)載體MCT1和MCT 4 的m RNA 表達(dá)也顯著高于LC 組（P<0.05）。但與MC組相比這些基因的表達(dá)量差異不顯著。

2.6日糧添加尿素對(duì)山羊瘤胃上皮pHi 調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白和UT-B mRNA 表達(dá)的影響

圖4 瘤胃上皮pHi 調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白和UT-B mRNA 表達(dá)

2.7日糧添加尿素對(duì)山羊瘤胃上皮UT-B 蛋白活性的影響

如表8 所示，尿素在瘤胃上皮中的轉(zhuǎn)運(yùn)受瘤胃p H 值、SCFA 濃度和N H3濃度的調(diào)節(jié)。Ussingchamber 數(shù)據(jù)顯示，與LC 組相比，Urea 組（P<0.0 5）和MC 組（P<0.05）瘤胃上皮將尿素從血液轉(zhuǎn)運(yùn)到瘤胃能力隨著日糧精料水平提高而顯著增加。而這兩組數(shù)據(jù)之間對(duì)比，MC 組上皮的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)能力則要顯著高于Urea 組（P<0.0 5）。結(jié)果表明U T-B 蛋白活性由高到低分別為：MC 組、Urea 組以及LC 組。

表8 對(duì)比各組血漿尿素跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)率（n=6）

3 討論

3.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

在所研究的發(fā)酵變量中，精料+尿素的混合日糧顯著升高了瘤胃乙酸、丙酸和丁酸濃度，瘤胃pH值顯著降低，但是與飼喂中精日糧的MC組相比，以上參數(shù)沒(méi)有因?yàn)槿占Z中添加尿素而改變。瘤胃SCFA和H+主要來(lái)源于日糧中碳水化合物的微生物發(fā)酵水解，這表明Urea組與MC組相比，瘤胃微生物發(fā)酵的功能并未改變，這與Currier等[16]的研究一致。因此，日糧中碳水化合物的比例相似會(huì)導(dǎo)致所有組中乙酸、丙酸、丁酸以及總SCFA的濃度相近。

N H3是瘤胃中微生物蛋白合成和生長(zhǎng)的重要氮源[8]。瘤胃NH3的最適宜濃度約為8.8 mg/dL[17]。然而，當(dāng)瘤胃NH3濃度超過(guò)140 mg/dL時(shí)，反芻動(dòng)物可能遭受NH3中毒[18]。瘤胃NH3的濃度由日糧中氮的水平和通過(guò)尿素循環(huán)進(jìn)入瘤胃的尿素決定。尿素可被瘤胃解脲微生物（主要是細(xì)菌）迅速水解為NH3，100%可在瘤胃內(nèi)降解[19]。前人的大量研究結(jié)果顯示日糧中添加尿素能夠大幅提高反芻動(dòng)物瘤胃中NH3的濃度[20～22]，Patra等[23]的研究報(bào)道，瘤胃NH3濃度是尿素循環(huán)的主要抑制因素。因此Urea組中較高的瘤胃NH3濃度抑制了血液中的尿素通過(guò)尿素循環(huán)跨過(guò)瘤胃上皮進(jìn)入瘤胃，導(dǎo)致了Urea組BUN濃度顯著高于MC組。

3.2 瘤胃上皮形態(tài)學(xué)和細(xì)胞周期

瘤胃上皮對(duì)發(fā)酵終產(chǎn)物的吸收至關(guān)重要，例如50%～85%的SCFA直接通過(guò)瘤胃上皮吸收，SCFA的吸收途徑主要包括被動(dòng)擴(kuò)散和通過(guò)載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[24～26]，瘤胃上皮乳頭表面積決定了上皮的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力[13，27，28]。針對(duì)山羊和綿羊的研究表明，提高日糧精料水平可以提高瘤胃SCFA濃度，進(jìn)而增加瘤胃乳頭的大小和表面積[29，30]。在本研究中，Urea組的瘤胃乳頭長(zhǎng)寬、密度和表面積均顯著大于LC組，這與Urea組攝入更多的能量和氮源一致，此外，也與Urea組的發(fā)酵終產(chǎn)物SCFA濃度更高相一致。因此，Urea組的瘤胃乳頭表面積更大，增加了吸收能力。與MC組相比，攝入的能量和氮源幾乎相同，導(dǎo)致瘤胃SCFA濃度無(wú)顯著差異，所以?xún)山M的瘤胃乳頭長(zhǎng)寬、密度和表面積也無(wú)顯著差別。

本文的研究表明，相比LC組，Urea組中瘤胃上皮中角質(zhì)層以及棘突層和顆粒層細(xì)胞層數(shù)增加。這是由于Urea組提高日糧精料水平增加了瘤胃SCFA濃度，進(jìn)而上調(diào)了上皮細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)引起的（圖3）。但是表4的數(shù)據(jù)又顯示，瘤胃上皮的棘突層和顆粒層以及基底層細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著的變化，推測(cè)這是因?yàn)樘岣呷占Z精料水平不僅促進(jìn)了瘤胃上皮的細(xì)胞增殖，而且加快了瘤胃上皮細(xì)胞的死亡，比如加快瘤胃上皮細(xì)胞凋亡水平。同時(shí)，瘤胃上皮細(xì)胞周期的變化顯示，Urea組的G0/G1期細(xì)胞所占百分比顯著下降，而G2/M期細(xì)胞所占百分比顯著升高。這個(gè)結(jié)果表明，Urea組由于調(diào)高了日糧精料水平，瘤胃上皮細(xì)胞周期進(jìn)程加快。由于Urea組和MC組的瘤胃SCFA濃度幾乎相同，所以它們的瘤胃上皮細(xì)胞增殖生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異。

3.3 瘤胃上皮細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)

細(xì)胞周期控制系統(tǒng)基于兩個(gè)蛋白家族：細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（cyclins）[31]。在本試驗(yàn)中，與LC組相比，Urea組和MC組山羊瘤胃上皮的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子（cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE1、CDK1、CDK2、CDK4和CDK6）的基因表達(dá)均顯著增強(qiáng)，表明這些細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子促進(jìn)了這兩組的細(xì)胞周期進(jìn)程。本研究中，通過(guò)將提高日糧精料水平，增加瘤胃SCFA濃度，降低瘤胃pH值。這與之前的報(bào)告一致[13，32]。研究結(jié)果表明，提高日糧精料水平使瘤胃乳頭密度增加，乳頭大小增大。這與加速上皮細(xì)胞增殖有關(guān)[30，33]。瘤胃乳頭生長(zhǎng)主要受瘤胃SCFA（主要是丁酸）濃度和pH值的調(diào)節(jié)[34，35]。提高日糧精料水平會(huì)升高SCFA的濃度，SCFA被認(rèn)為是上調(diào)瘤胃上皮細(xì)胞增殖的因素[36]。McLeod等[37]進(jìn)一步報(bào)道，消化道SCFA是促進(jìn)消化道上皮增殖的主要因素。

細(xì)胞凋亡對(duì)細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)態(tài)起著中重要的作用。在通過(guò)細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量的增加和通過(guò)細(xì)胞凋亡減少細(xì)胞數(shù)量，這兩者的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于維持組織細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)都起著至關(guān)重要的作用，SCFA能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，尤其是丁酸的作用更加明顯。在本研究中，與LC組相比，Urea組和MC組山羊瘤胃上皮的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子（caspase 3、caspase 8、caspase 9、p53、Bcl-2和Bax）的基因表達(dá)均增強(qiáng)。這與Urea組和MC組瘤胃SCFA特別是丁酸濃度顯著升高相一致。簡(jiǎn)言之，提高日糧精料水平可加速瘤胃細(xì)胞周期并促進(jìn)瘤胃細(xì)胞凋亡。在此水平上，凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可用于細(xì)胞增殖，這可能有助于維持上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

由于作為主要調(diào)節(jié)因素的瘤胃SCFA濃度在Urea組和MC組間無(wú)顯著差異，所以?xún)山M的上皮細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)同樣無(wú)顯著差異。

3.4 瘤胃上皮SCFA 轉(zhuǎn)運(yùn)載體和pHi 調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)

提高日糧精料水平不僅會(huì)使瘤胃內(nèi)的發(fā)酵增加，還導(dǎo)致瘤胃對(duì)SCFA的吸收增加[38～40]。Sehested等[40]在2000年報(bào)道，增加日糧的精料水平，可以在不改變吸收表面積的情況下，增加瘤胃上皮對(duì)丁酸的吸收能力。隨后Kuzinski[41]與Connor[42]等分別發(fā)現(xiàn)，提高日糧中的精料比例，會(huì)引起瘤胃上皮中SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體MCT1與DRA的mRNA表達(dá)增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，瘤胃上皮吸收功能的變化源自瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改變。提高日糧中的精料水平可增加瘤胃上皮內(nèi)SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)，從而增加瘤胃上皮對(duì)SCFA的吸收能力。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，同LC組相比，Urea組和MC組瘤胃上皮中SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體（MCT1、MCT4、DRA、PAT1和AE2）的表達(dá)都顯著升高。這些結(jié)果與[43]的發(fā)現(xiàn)一致，由于SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA表達(dá)增加，這兩的組瘤胃上皮對(duì)SCFA的吸收能力也可能會(huì)相應(yīng)的升高。由于Urea組和MC組間SCFA濃度相似，所以?xún)山M的SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異。

之前的發(fā)現(xiàn)提高日糧精料水平不僅會(huì)引起SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)升高，還能引起細(xì)胞內(nèi)pHi調(diào)節(jié)蛋白（NHE1、NHE2、NHE3、vH+ATPase與Na+/K+ATPase）的mRNA表達(dá)升高[43]。SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體與細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)同時(shí)升高，對(duì)瘤胃上皮有著重要的生理意義。目前已經(jīng)證實(shí)，SCFA的吸收會(huì)導(dǎo)致瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)的H+濃度升高，細(xì)胞內(nèi)的pH值下降，這就需要pH調(diào)節(jié)蛋白來(lái)幫助排出胞內(nèi)的H+，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，保證細(xì)胞的正常生理活動(dòng)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)Urea組和MC組瘤胃上皮中SCFA濃度顯著高于同LC組，因此這兩組中的細(xì)胞內(nèi)pHi調(diào)節(jié)蛋白（NHE1、NHE2、NHE3、vH+ATPase與Na+/K+ATPase）的mRNA表達(dá)均顯著升高。由于Urea組中添加尿素替代部分豆粕，造成瘤胃NH3濃度顯著高于MC組。先前的研究發(fā)現(xiàn)NH3對(duì)NHE1、NHE2和NHE3的mRNA表達(dá)有抑制作用[44]。因此，以上5種細(xì)胞內(nèi)pHi調(diào)節(jié)蛋白在Urea組中的mRNA表達(dá)顯著低于MC組。

3.5 瘤胃上皮尿素轉(zhuǎn)運(yùn)能力

反芻動(dòng)物具有特殊的氮節(jié)約機(jī)制，可以通過(guò)尿素循環(huán)，將2/3的需將尿素運(yùn)回瘤胃[1，2，45]。尿素進(jìn)入瘤胃后被微生物分泌的脲酶分解，產(chǎn)生的NH3被微生物作為原料合成微生物蛋白，為宿主提供營(yíng)養(yǎng)。尿素跨瘤胃上皮轉(zhuǎn)運(yùn)是尿素循環(huán)中最關(guān)鍵的一步，尿素通過(guò)特異性載體UT-B實(shí)現(xiàn)跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)。瘤胃上皮對(duì)尿素的轉(zhuǎn)運(yùn)能力包括UT-B的蛋白活性和mRNA表達(dá)量。之前的研究顯示，瘤胃SCFA和低pH值對(duì)瘤胃上皮UT-B的蛋白活性和mRNA表達(dá)量均有顯著的上調(diào)作用，而瘤胃NH3則起抑制作用[9，46]。Urea組與LC組相比，由于瘤胃SCFA濃度顯著增加，pH值顯著降低，因此UT-B的蛋白活性和mRNA表達(dá)量均顯著升高。Urea組中添加尿素替代部分豆粕，造成瘤胃NH3濃度顯著高于MC組，同時(shí)瘤胃SCFA濃度和pH值相似，所以UT-B的蛋白活性和mRNA表達(dá)量受到抑制顯著低于MC組。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)在3 0%精料的日糧中添加尿素（1%DM）替代部分豆粕作為非蛋白類(lèi)氮源。添加尿素對(duì)于日糧精料水平提高而發(fā)生的瘤胃SCFA濃度升高、pH值降低趨勢(shì)沒(méi)有顯著改變，但在精料日糧的基礎(chǔ)上進(jìn)一步顯著提高瘤胃NH3和BUN濃度。因此添加尿素對(duì)于以瘤胃SCFA為主要調(diào)節(jié)因子的瘤胃上皮生理活動(dòng)（上皮生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、增殖凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)和SCFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)）均無(wú)顯著影響。但是對(duì)于受瘤胃NH3調(diào)節(jié)的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)、pHi調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)則有顯著的負(fù)調(diào)節(jié)。我們的研究結(jié)果表明，添加尿素對(duì)于提高日糧精料水平而發(fā)生的瘤胃和瘤胃上皮的一系列技能變化有部分調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步研究尿素作為替代豆粕的非蛋白類(lèi)氮源對(duì)反芻動(dòng)物生理機(jī)能的影響提供了數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。