聯(lián)體共生動物模型在生理學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展#

袁順靈 朱悅 熊文婕 劉文鋒△

（1. 湖南師范大學(xué)體適能與運動康復(fù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410012；2. 中南大學(xué)湘雅附屬二醫(yī)院，湖南 長沙 410011）

聯(lián)體共生（Parabiosis）是指運用外科手術(shù)的方法，將兩只動物連接在一起，使血細(xì)胞和可溶性因子交換，從而改變配對伙伴的全身環(huán)境。其靈感來源于自然界中的聯(lián)體嬰兒[1]。關(guān)于聯(lián)體雙胞胎的報道可追溯到1100年前，在19世紀(jì)初，泰國出現(xiàn)一例生活到63歲聯(lián)體雙胞胎的報道，使聯(lián)體嬰兒再次吸引了人們的眼球[2,3]。1864年，法國生理學(xué)家Bert首次用大鼠成功完成人工聯(lián)體手術(shù)[1]。1908年，德國外科醫(yī)生Sauerbruch和Heyde對該技術(shù)進(jìn)行了復(fù)興，并引入了“parabiosis”一詞來指代兩動物之間人工建立的共生關(guān)系[4]。2005年，Coonboy 等人利用異時聯(lián)體共生模型，在《NATURE》上發(fā)表了《年輕環(huán)境使衰老干細(xì)胞重新年輕化》的文章，使聯(lián)體共生模型重回人們視野[5]。從Bert首次造模成功，到現(xiàn)在基于該模型已產(chǎn)生一系列的生理學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)。本文綜述聯(lián)體共生的歷史及造模方法，并綜述其在各個系統(tǒng)的主要研究進(jìn)展。

1 聯(lián)體共生造模方法及演變

造模方法最早由Bert于1864年描述，將大鼠的腹側(cè)面皮膚切開進(jìn)行連接[1]。這之后，Andresen等人將兔子的耳朵進(jìn)行連接[6]，其他動物如蠑螈、非洲爪蟾也開始應(yīng)用[7-8]。Demy等人還用囊胚融合產(chǎn)生聯(lián)體共生斑馬魚[9]。但實驗證明，嚙齒動物手術(shù)后恢復(fù)得最好。Conboy等人[10]對當(dāng)前手術(shù)過程做了詳細(xì)示例（如圖1）：（A）小鼠手術(shù)面剃毛；（B）手術(shù)面皮膚切口；（C）分離皮膚下方筋膜；（D）并排俯臥放置，將兩只小鼠的背部皮膚聚攏，用皮膚縫合器裝訂縫合；（E）背部皮膚連接完成；（F）縫合線皮下捆綁關(guān)節(jié)（肘和膝），以確保連接牢固；（G）翻轉(zhuǎn)露出腹側(cè)皮膚；（H）重復(fù)縫合皮膚和關(guān)節(jié)的過程，完成聯(lián)體生物對。

圖1 聯(lián)體手術(shù)過程[10]

2 聯(lián)體共生模型與各系統(tǒng)的研究

2.1 聯(lián)體共生與神經(jīng)系統(tǒng)

Villeda等人[11]將年輕的小鼠與年老小鼠聯(lián)體，實驗觀察到年輕小鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性明顯下降，皮層認(rèn)知功能和空間學(xué)習(xí)記憶功能亦受到損害。研究證實年輕的小鼠從年老小鼠的血液環(huán)境內(nèi)獲得負(fù)性調(diào)節(jié)因子嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白CCL11，增加年輕小鼠體內(nèi)CCL11濃度水平可導(dǎo)致其腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，損害學(xué)習(xí)和記憶功能。提示年老系統(tǒng)環(huán)境可能會對干細(xì)胞功能有害，從而對共生對中年輕小鼠大腦神經(jīng)的發(fā)生不利。中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過髓鞘再生來恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)和防止軸突變性[12]。然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘再生的效率隨著年齡的增長而降低[13]。Ruckh等報道，暴露在年輕系統(tǒng)環(huán)境中的老年小鼠可恢復(fù)神經(jīng)干細(xì)胞髓鞘再生能力[14]。Francesco等人利用異時聯(lián)體共生模型發(fā)現(xiàn)生長分化因子（Growth Differentiation Factor 11，GDF11）可逆轉(zhuǎn)年齡導(dǎo)致的相關(guān)性心肌肥厚[15]。隨后GDF11鑒定為“恢復(fù)活力的因子”，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的視角[16]。Kim等人發(fā)現(xiàn)，通過異時聯(lián)體共生和注射血漿的方法，將3xTg-AD小鼠暴露于運動小鼠的血液環(huán)境中，可改善神經(jīng)可塑性和線粒體功能并抑制細(xì)胞凋亡，最終改善認(rèn)知功能[17]?；谏鲜鲆幌盗兄匾陌l(fā)現(xiàn)，未來應(yīng)該意識到GDF11和聯(lián)體共生模型在阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病研究中的價值。

2.2 聯(lián)體共生與內(nèi)分泌系統(tǒng)

1969年，Lewis等人[18]將野生型大鼠與具有體質(zhì)性高血壓大鼠聯(lián)體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩大鼠中腎小球高血壓的發(fā)生頻率相同。指出誘發(fā)野生型動物高血壓的是某種體液因子。此外，他們切除易患高血壓的大鼠腎上腺，發(fā)現(xiàn)野生型共生大鼠不會產(chǎn)生高血壓，這表明該因子是在高血壓大鼠的腎臟中產(chǎn)生的。此因子的存在隨后在其他研究中也得到證實[19]，1993年，Lewanczuk等人將其鑒定為甲狀旁腺高血壓因子（Parathyroid Hypertension Factor，PHF）[20]。此外，Coleman等人將缺失db基因易于肥胖發(fā)展成Ⅱ型糖尿病模型小鼠與非肥胖小鼠組成聯(lián)體共生模型，觀察到野生型小鼠顯著減少了食物攝取，而肥胖型小鼠繼續(xù)增加體重。由此推斷必須有一個飽足感因子，只有野生型才能產(chǎn)生響應(yīng)[21]。30年后Friedman在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了確定飽腹感出現(xiàn)的關(guān)鍵因素——瘦素，瘦素發(fā)揮抑制食欲，減少能量攝取，增加能量消耗，已成為調(diào)節(jié)體重的關(guān)鍵激素之一[22]。

聯(lián)體共生最突出特點就是聯(lián)體對之間體液因子的交換。在70年代初，科學(xué)家開始將不同年齡的動物進(jìn)行聯(lián)體。這種異時共生聯(lián)體通過將老化的有機(jī)體暴露于年輕的系統(tǒng)環(huán)境而引起一系列效應(yīng)。Ludwig等人發(fā)現(xiàn)與等時聯(lián)體對照相比，異時聯(lián)體中的老年小鼠壽命更長[23]。Conboy等使用異時共生實驗，發(fā)現(xiàn)源自年輕的系統(tǒng)環(huán)境因素能夠激活舊生物體的肝臟或肌肉干細(xì)胞中的分子信號傳導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致增殖和組織再生增加。這些結(jié)果通過培養(yǎng)含有年幼動物血清的肌肉干細(xì)胞得到進(jìn)一步證實[5]。他們的發(fā)現(xiàn)清楚地表明，干細(xì)胞功能與年齡相關(guān)的損傷在很大程度上是由內(nèi)環(huán)境的組成引起的，而不是僅由細(xì)胞內(nèi)在變化引起的。由此可見，該模型對于研究不同組織和器官衰老的全身體液因素至關(guān)重要。

2.3 聯(lián)體共生與運動系統(tǒng)

早在1959年，Hall等人對患有肌肉營養(yǎng)不良的小鼠與健康小鼠聯(lián)體共生，就發(fā)現(xiàn)可以延長肌肉營養(yǎng)不良的小鼠壽命[24]。Li等發(fā)現(xiàn)通過共生可改善營養(yǎng)不良小鼠的骨質(zhì)量和骨愈合[23]。Wagers等利用小鼠聯(lián)體共生模型展開研究，觀察到年輕小鼠的血液在老年小鼠體內(nèi)循環(huán)，對老年小鼠損傷后的肌肉修復(fù)可產(chǎn)生再生效應(yīng)[25]。相比之下，暴露于舊系統(tǒng)環(huán)境的年幼小鼠的肌生長減少[5,26]。此后，又有了一系列延緩骨骼肌衰老的發(fā)現(xiàn)。衰老過程中WNT通路改變可改變骨骼肌再生能力[14]。Sinha通過該模型發(fā)現(xiàn)睪酮可減輕骨骼肌細(xì)胞衰老帶來的影響[27]。Gurpreet 等人通過異時聯(lián)體共生模型，發(fā)現(xiàn)在老年小鼠與年輕小鼠建立起血液循環(huán)后，長骨的修復(fù)的能力和成骨細(xì)胞的分化能力都得到了明顯的改善。其中β-連環(huán)蛋白可促進(jìn)老年骨折愈合[28]。GDF11除對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生有益影響外，也可延緩骨骼肌細(xì)胞的衰老進(jìn)程[29]，Rochette等人發(fā)現(xiàn)，GDF11分子在年輕小鼠血液中自然濃度較高[16]。通過異時共生模型將年輕健康小鼠與具有由衰老引起的骨骼肌細(xì)胞功能障礙的老年小鼠聯(lián)體，發(fā)現(xiàn)GDF11能逆轉(zhuǎn)骨骼肌細(xì)胞由于衰老引起的功能紊亂[27]。Baht GS等人也證實，血液中較高的GDF11水平可改善肌肉的結(jié)構(gòu)和功能特點，增加肌肉力量[28]。

2.4 聯(lián)體共生與心血管系統(tǒng)

Francesco等人在小鼠聯(lián)體4周時觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)體共生小鼠中年老小鼠肥大的心肌細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞功能也明顯恢復(fù)。其利用蛋白質(zhì)組學(xué)實驗，發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)其中起作用的為GDF11。GDF11屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的轉(zhuǎn)化生長因子-β家族中的一員，是防止和逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞老年性肥大的關(guān)鍵因素，該因子在老年小鼠的血漿中顯著降低。指出這可能是未來醫(yī)學(xué)治愈心臟衰老的途徑之一[15]。Rochette等研究表明，年齡相關(guān)的導(dǎo)致心臟舒張性心力衰竭等正常心臟功能的喪失是由于老年小鼠缺乏某些循環(huán)因子所致。他們報道，這種肥大在老年動物通過異時共生而暴露于年輕的系統(tǒng)環(huán)境中是可逆轉(zhuǎn)的。他們確定了GDF11是防止心臟肥大的關(guān)鍵因素，此外，還證明GDF11還可舒張腦血管，增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生，改善小鼠大腦功能障礙[16]。

3 聯(lián)體共生模型的限制與挑戰(zhàn)

該模型主要挑戰(zhàn)之一是需要良好的手術(shù)技術(shù)以及手術(shù)死亡率的問題[30-31]。通過標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)過程和術(shù)后護(hù)理，可以使聯(lián)體生物存活率提高到90%以上。另外，與操作無關(guān)，存在“聯(lián)體疾病”的現(xiàn)象，稱為“聯(lián)體中毒”，它導(dǎo)致死亡[32]。這種死亡目前沒有得到有效解決，Spencer等的研究提出，可能跟免疫攻擊新生的血管吻合有關(guān)[33]。1951年Finerty等報道共生生物疾病的發(fā)生率可高達(dá)20～30%[32]。但此后很多研究都低于這一死亡率。Lu則報道聯(lián)體生活的小鼠有極好的健康狀況，死亡率為零[34]。Ashapkin指出術(shù)后死亡率僅1%[35]，聯(lián)體動物存在這樣的死亡率差異，可能跟實驗條件和術(shù)后護(hù)理有關(guān)。

另外一個有爭議的是涉及動物倫理。1990年英國實驗動物科學(xué)協(xié)會提出該模型對動物的傷害后，就影響了該模型的應(yīng)用[36]。但是Aicher 等指出由于對聯(lián)體動物的疼痛和痛苦評估的基本原則不同，影響了對該模型的合理評價[37]?；诖耍瑥埜幌榈热擞^察聯(lián)體小鼠的術(shù)后生理變化，發(fā)現(xiàn)小鼠疼痛持續(xù)時間短暫，不至于死亡，并無任何生活質(zhì)量降低的跡象，直至術(shù)后第四個月，小鼠的死亡率均為零[38]。由此可見，隨著手術(shù)及護(hù)理技術(shù)水平的提高，前人提出的這樣一些問題已經(jīng)明顯得到弱化，能夠使該模型更好地服務(wù)于科學(xué)研究。此外，需要引起重視的是盡管具有潛在價值，但該模型體液因素非常復(fù)雜，無法精確控制。血液中多種因素（細(xì)胞、蛋白質(zhì)）的混合更有可能發(fā)揮作用。要確定其中一些“神秘因子”，還需要付出很多努力。

4 總結(jié)與展望

在一個多世紀(jì)中盡管聯(lián)體共生模型產(chǎn)生了一系列驚人的生理學(xué)發(fā)現(xiàn)，但是它的應(yīng)用并不廣為人知。此外聯(lián)體共生動物模型在血液循環(huán)因子干預(yù)研究中具有巨大潛力，探究這些循環(huán)因子將是未來生理學(xué)的重要任務(wù)之一。我們認(rèn)為，聯(lián)體共生是一種應(yīng)該得到更廣泛接受和應(yīng)用的模型，有能力成為生理學(xué)研究中一個變革性的創(chuàng)新性實驗范式。