M2型巨噬細胞旁分泌調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學行為研究

龔麒麟 吳宇 劉輝

甲狀腺癌是近年來全球發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一，美國甲狀腺癌的發(fā)病率平均每年增加3.6%[1]，在我國同樣增長迅速。2006年甲狀腺癌發(fā)病率在我國所有惡性腫瘤中位于第10 位之后，而2019年國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌已位于常見惡性腫瘤第7 位，女性常見惡性腫瘤第4位[2]。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型，研究甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機制具有重要意義。

腫瘤的發(fā)展與腫瘤所處的微環(huán)境密切相關(guān)。巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中重要的基質(zhì)細胞,腫瘤相關(guān)巨噬細胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）是浸潤于腫瘤組織周圍的巨噬細胞，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。在正常生理情況下，巨噬細胞有M1、M2 型兩種激活狀態(tài)。TAMs 的表型和功能更傾向于M2 型巨噬細胞，因此，經(jīng)常以M2 型巨噬細胞為對象研究TAMs 的致病過程[4，5]。

M2 型巨噬細胞與甲狀腺乳頭狀癌關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細胞密度越高，甲狀腺乳頭狀癌分期越晚，預后越差[3]，但M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌生物學行為的調(diào)控作用及其機制仍需深入研究。本研究探討M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響及其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞、人單核細胞系THP-1 細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所。CCK-8 試劑盒購自中國Biosharp 公司。SYBR Premix EX Taq 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR 引物由美國 Invitrogen(北京)公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞加入含有1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，人單核細胞系THP-1 細胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，均于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2 天擴增1 次。

1.3 誘導、極化M2 型巨噬細胞每個含人單核細胞系THP-1 細胞培養(yǎng)皿加入5μl 佛波酯(PMA)，放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h，誘導THP-1 細胞貼壁分化為未極化的巨噬細胞（M0）。然后加入重組人IL-4（1∶500）和重組人IL-13（1∶500）各5μl，混勻后繼續(xù)放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)18h，分化為誘導極化的M2 型巨噬細胞。

1.4 M2 型巨噬細胞鑒定M2 型巨噬細胞的特點為高表達IL-10，精氨酸酶1（Arginase-1）活性增加。用RT-PCR 檢測未極化的巨噬細胞和誘導極化的巨噬細胞IL-10、Arginase-1。按Trizol 試劑盒步驟提取每組細胞的總RNA，使用 Primer Script Treagent Kit試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA；再以cDNA為模板，使用 SYBR Premix EX Taq 試劑盒進行RTPCR。以β-actin 為內(nèi)參，檢測IL-10、Arginase-1的表達。各目的基因擴增條件相同，95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃復制60s，95℃延伸15s，共40 個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCT方法分析，引物序列見表1。

表1 引物設計

1.5 獲得條件培養(yǎng)基及分組將M2 型巨噬細胞在無血清DMEM 中培養(yǎng)12h，然后通過0.22μm 濾膜過濾以除去細胞并收集條件培養(yǎng)基（CM）。設置研究組及對照組。研究組將TPC-1 細胞置入含CM的無血清DMEM 中培養(yǎng)。對照組將TPC-1 細胞置入不含CM 的無血清DMEM 中培養(yǎng)。研究組及對照組均置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.6 細胞侵襲、增殖和遷移實驗采用CCK-8 法檢測細胞增殖能力：將研究組及對照組細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞濃度為1×105個/ml，每孔加入100μl 細胞懸液(每組設置6 孔重復)。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，加入CCK-8 進行細胞增殖檢測，2h 內(nèi)讀取OD450 值。

采用Transwell 法檢測細胞侵襲能力：研究組及對照組細胞培養(yǎng)24h 后，先消化細胞，然后用無血清培養(yǎng)基洗3 次，配成5×105個/ml 細胞懸液，在上室中加入100μl 細胞懸液(3 個室)，在下室中加入500μl 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h 后用多聚甲醛固定，擦去上室內(nèi)基質(zhì)膠和細胞，1%結(jié)晶紫乙醇溶液孵育染色，顯微鏡下（×100）隨機計數(shù)16 個視野內(nèi)的膜下細胞數(shù)。

采用劃痕法檢測細胞遷移能力：將研究組及對照組細胞分別接種于6 孔板中，每個孔中加入約3.5×106個細胞。用記號筆在6 孔板背后用直尺劃橫線，每孔劃3 條。細胞貼壁后用槍頭和直尺垂直于背后的橫線劃痕， PBS 洗細胞2～3 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)0h、24h、48h 時各拍照6 張。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 M2型巨噬細胞誘導及鑒定經(jīng)RT-PCR檢測，誘導極化的THP-1 細胞中IL-10 表達量為2.58±0.36， Arginase-1 含量為3.79±0.45；未極化的THP-1 中IL-10 表達量為0.92±0.11，Arginase-1 含量為1.20± 0.23。誘導極化的巨噬細胞IL-10、Arginase-1 表達均高于未極化的巨噬細胞，兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=9.894，P=0.000；t=11.427，P=0.000）。結(jié)果顯示誘導極化后的THP-1 細胞高表達IL-10、Arginase-1，符合M2 型巨噬細胞表型特征。

2.2 M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞增殖能力的影響采用CCK-8 法檢測細胞增殖能力。結(jié)果顯示：研究組和對照組OD450 值分別為1.32±0.70、0.85±0.57，研究組OD450 值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.869，P=0.000）。表明研究組細胞增殖能力強于對照組。

2.3 M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞侵襲能力的影響采用Transwell 法檢測細胞侵襲能力。結(jié)果顯示：研究組和對照組的穿膜細胞數(shù)分別為（264.20±43.22）個、（138.60±29.99）個，研究組穿膜細胞數(shù)多于對照組（見圖1），差異有統(tǒng)計學意義（t=5.339，P=0.01）。表明研究組細胞侵襲能力強于對照組。

圖1 Transwell 法檢測細胞侵襲能力(×100)

2.4 M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞遷移能力的影響采用劃痕法檢測細胞增殖力。結(jié)果顯示：研究組和對照組的遷移距離分別為（255.94±35.10）μm、（167.58±33.26）μm，研究組細胞遷移距離大于對照組（見圖2），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.086，P=0.04）。表明研究組細胞遷移能力強于對照組。

圖2 劃痕法檢測細胞遷移能力(×100)

3 討論

巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的重要細胞，在某些腫瘤中可達到腫瘤微環(huán)境的50%[6]。在正常生理情況下，巨噬細胞有兩種極化狀態(tài)類型：M1 型巨噬細胞為經(jīng)典活化型巨噬細胞，M2 型巨噬細胞為替代活化型巨噬細胞。M1 型巨噬細胞可由脂多糖（Lipopolys accharide，LPS）、干擾素γ（Interferon-γ，IFN-γ）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）刺激經(jīng)典活化而來，它的特征是高表達IL-1β、TNF、IL-12 和IL-18，低表達IL-10。可抑制腫瘤、產(chǎn)生促炎細胞因子、介導對病原體的抗性并表現(xiàn)出強大的殺菌能力[7]。與經(jīng)典途徑相反的途徑激活的巨噬細胞被稱為 M2 型巨噬細胞，CSF-1、IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、IL-13、真菌和蠕蟲感染之類的刺激有利于 M2 型巨噬細胞激活。M2 型巨噬細胞的特征是高表達IL-10，Arginase-1活性增加，低表達IL-12、IL-13[8]。M2 型巨噬細胞在促進腫瘤發(fā)生、血管生成、細胞基質(zhì)重塑及過敏性疾病反應中起重要作用[9]。TAMs 是浸潤在腫瘤周圍的巨噬細胞，嚴格意義上來說，它并非巨噬細胞的一個亞群，因為這些細胞在穩(wěn)態(tài)環(huán)境中并不存在，但在許多腫瘤中可以觀察到。TAMs 與多種腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)人和鼠的腫瘤組織中，TAMs 通常具有M2 型巨噬細胞的表型特征，因此可以通過研究M2 型巨噬細胞分析TAMs 的作用[10～12]。

M2 型巨噬細胞與乳腺癌[13]、肝癌[14]、結(jié)腸癌[15]等多種腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。動物模型也已證實，M2 型巨噬細胞減少與抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。M2 型巨噬細胞與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系同樣密切。有組織學研究發(fā)現(xiàn)，高密度的M2 型巨噬細胞與甲狀腺乳頭狀癌的高侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量多和TNM 分期晚有關(guān)，且M2 型巨噬細胞密度越高，癌癥相關(guān)生存時間越短[16]。但在甲狀腺癌細胞學上，相關(guān)研究甚少。本研究通過將M2 型巨噬細胞條件培養(yǎng)基與甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞共培養(yǎng)，檢測癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，發(fā)現(xiàn)在M2 型巨噬細胞條件培養(yǎng)基刺激下，TPC-1 細胞增殖、侵襲及遷移能力增加。本研究細胞學實驗證實了M2 型巨噬細胞可以促進甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞增殖、侵襲及遷移，可與上述學者在組織學上發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相互印證[11，13～16]。本研究中TPC-1 細胞增殖、侵襲及遷移能力的增強是在去除M2 型巨噬細胞的條件培養(yǎng)基刺激下所致，因此進一步提示M2 型巨噬細胞促腫瘤作用是通過旁分泌相關(guān)細胞因子完成。

M2 型巨噬細胞通過旁分泌細胞因子調(diào)節(jié)腫瘤生物學行為在其他類型的腫瘤中已有發(fā)現(xiàn)，有學者在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)巨噬細胞分泌的TNF-α 和IL-6 與結(jié)腸癌浸潤增加有關(guān)[17]。M2 型巨噬細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）會促進皮膚鱗癌的浸潤[18]。在人乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)，M2 型巨噬細胞表達表皮生長因子 (EGF) 促進乳腺癌細胞的侵襲，而乳腺癌細胞產(chǎn)生的CSF-1 會促進巨噬細胞高表達EGF，從而形成一個惡性循環(huán)[19]。但關(guān)于M2 型巨噬細胞是通過旁分泌哪些細胞因子調(diào)控甲狀腺癌細胞生物學活性，目前國內(nèi)外相關(guān)研究較少。有學者在PTC 的M2 型巨噬細胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)趨化因子8（CXCL8）升高，而用CXCL8 抗體中和培養(yǎng)基后，PTC 細胞侵襲性降低，推斷M2 型巨噬細胞可能通過CXCL8 旁分泌作用促進PTC 細胞轉(zhuǎn)移[20]。但CXCL8 并非巨噬細胞分泌的特有細胞因子，內(nèi)皮細胞及正常或惡性的甲狀腺濾泡細胞均能分泌[21～23]。因此CXCL8 可能并非M2 型巨噬細胞調(diào)控甲狀腺癌細胞轉(zhuǎn)移的主要細胞因子。M2 型巨噬細胞促進甲狀腺癌進展的分子機制仍未明確。

綜上所述，本研究在體外細胞學層面證實了M2 型巨噬細胞可以促進甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞的增殖、侵襲及遷移，且此作用是通過旁分泌細胞因子實現(xiàn)。但M2 型巨噬細胞調(diào)控甲狀腺癌細胞生物學行為的具體細胞因子及其機制仍需后續(xù)實驗進一步研究。