乳腺癌中環(huán)狀RNA circ_0030777的表達及其臨床意義

汪園園，柯 璟，劉 希，李曉鋒，常紅云，楊 喆，張冠軍

乳腺癌是影響女性身心健康的常見惡性腫瘤之一。我國女性乳腺癌的發(fā)病率居于女性惡性腫瘤的首位，2015年我國乳腺癌新發(fā)病例約30.4萬例，占女性惡性腫瘤發(fā)病的17.10%[1]。環(huán)狀RNA是一種新型非編碼RNA，近期研究表明，環(huán)狀RNA在多種腫瘤中異常表達，如肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者的預后有關(guān)[2-3]。在乳腺癌中，環(huán)狀RNA也具有重要作用[4]。本實驗主要通過qRT-PCR法檢測環(huán)狀RNA circ_0030777在乳腺癌中的表達，探討其臨床意義及其作為腫瘤分子標志物的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本 收集2014年6月～2015年12月西安交通大學第一附屬醫(yī)院存檔的手術(shù)標本，包含124例乳腺癌、4例癌旁正常乳腺組織及38例良性病變?nèi)橄俳M織。納入標準：所有患者均為女性，年齡18～80歲，術(shù)前均未行放、化療及新輔助治療。124例乳腺癌患者年齡35～80歲，平均52歲。其中非特殊型浸潤性癌Ⅱ級19例，非特殊型浸潤性癌Ⅲ級88例，浸潤性小葉癌3例，篩狀癌1例，黏液癌3例，浸潤性微小乳頭狀癌4例，伴髓樣特征的癌6例。38例乳腺良性病變患者年齡16～60歲，平均34.58歲，均為乳腺纖維腺瘤。所有患者均簽署知情同意書，手術(shù)后標本立即放入液氮中保存，標本經(jīng)過兩位病理醫(yī)師進行診斷。

1.1.2 主要試劑鼠抗人ER單克隆抗體、鼠抗人PR單克隆抗體和鼠抗人Ki-67單克隆抗體均購自福州邁新公司，鼠抗人HER-2單克隆抗體購自羅氏公司，GLP HER2/CSP17探針試劑盒購自廣州安必平醫(yī)藥公司，RNA提取試劑TRIzol和qRT-PCR試劑盒SYBR均購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，PCR試劑盒購自康為世紀公司。

1.2 方法

1.2.1HE和免疫組化染色 所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色。切取典型病變組織(3 μm厚)，根據(jù)說明書進行采用Ventana(Roche公司)全自動免疫組化染色儀進行EnVision兩步法染色。ER和PR結(jié)果判讀標準：計數(shù)100個以上的腫瘤細胞，≥1%的腫瘤細胞核陽性判讀為陽性，﹤1%則判讀為陰性[5]。HER-2結(jié)果判讀依據(jù)乳腺癌HER2檢測指南(2019版)[6]。Ki-67增殖指數(shù)為腫瘤細胞中陽性細胞所占百分比。

1.2.2FISH 使用HER-2雙色探針對免疫組化HER-2 2+的乳腺癌組織進行FISH檢測，操作步驟根據(jù)試劑盒說明書進行：石蠟切片3 μm厚，60 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟，乙醇去二甲苯，95 ℃蒸餾水煮片20 min，室溫晾干，37 ℃蛋白酶消化10 min，SSC緩沖液洗滌10 min，梯度乙醇脫水，室溫晾干，后續(xù)實驗步驟均避光操作，滴加HER-2探針，橡膠水泥封固，雜交儀過夜(85 ℃ 5 min；37 ℃過夜)。次日，洗滌切片，滴加DAPI復染液至組織上，分析熒光信號。HER-2 FISH判讀依據(jù)乳腺癌HER2檢測指南(2019版)[6]。

1.2.3qRT-PCR 采用TRIzol提取組織中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR。環(huán)狀RNA circ_0030777上游引物：5′-TGACAGACAATAAGGGCGAAG-3′，下游引物：5′-TCGAGAAGCAGGTGGAAACAT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3′，下游引物：5′-GCGCCCAATACGA CCAAATC-3′。使用普通PCR試劑盒進行PCR，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,41個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃下保存。產(chǎn)物跑膠后，送華大基因公司測序；使用SYBR進行qRT-PCR檢測，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，41個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計算mRNA表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用兩獨立樣本的秩和檢驗(Wilcoxon rank test)與χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。雙側(cè)P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中環(huán)狀RNA circ_0030777的表達根據(jù)HE染色，確定標本組織病變類型，分別為乳腺癌、癌旁正常乳腺組織及良性病變?nèi)橄俳M織(圖1)。采用環(huán)狀RNA芯片篩選技術(shù)抽取4例乳腺癌及對應(yīng)癌旁乳腺組織，篩選出在乳腺癌中特異性低表達的環(huán)狀RNA circ_0030777，作為后續(xù)實驗靶標。環(huán)狀RNA circ_0030777在乳腺癌與癌旁組織中表達量相差56倍(P=0.001)。

本組采用PCR對芯片結(jié)果進行進一步驗證，測序結(jié)果顯示擴增的序列跨越目標基因反向剪接序列(圖2)，與目標基因的序列相符。qRT-PCR結(jié)果顯示，環(huán)狀RNA circ_0030777在124例乳腺癌組織中的表達低于38例乳腺良性病變組織(P<0.001，圖3)，符合芯片表達結(jié)果。

圖2 環(huán)狀RNA circ_0030777及GAPDH基因qRT-PCR的擴增曲線、熔解曲線圖及測序后的環(huán)狀RNA拼接位點示意圖：A.擴增曲線；B.熔解曲線，紅色線條為目標基因，綠色線條為內(nèi)參基因；C.拼接位點示意圖

圖3 乳腺癌組織及良性病變組織中環(huán)狀RNA circ_0030777的表達差異

2.2 乳腺癌中環(huán)狀RNA circ_0030777表達與臨床病理特征的相關(guān)性以組織病理診斷為金標準，區(qū)分乳腺癌組織和乳腺良性病變組織，用qPCR檢測環(huán)狀RNA circ_0030777表達水平所得數(shù)據(jù)制作ROC，得到ROC曲線下面積(area under curve,AUC)為0.866 7(95%CI：0.803 7～0.929 7)，根據(jù)約登指數(shù)，得到截點cut-off為9.598E-4，靈敏度Sen為0.580 6(95%CI：0.488 7～0.668 6)，特異度Spe為0.973 7(95%CI：0.861 9～0.999 3)，具有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1，圖4)。

圖4 環(huán)狀RNA circ_0030777診斷乳腺癌的ROC曲線

根據(jù)ROC將環(huán)狀RNA circ_0030777表達水平分成高表達組和低表達組，分析環(huán)狀RNA circ_0030777表達水平與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA circ_0030777表達與ER、PR和Ki-67表達水平(圖5)有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、腫瘤部位、組織學分型、HER-2狀態(tài)(圖5、6)、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分子分型及組織學分型等均無相關(guān)性(P>0.05)。進一步Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0030777低表達率與ER表達狀態(tài)相關(guān)(r=0.243，P=0.046)，ER陽性組hsa_circ_0030777低表達率低；PR陽性組hsa_circ_0030777低表達率低(r=0.187，P=0.007)；Ki-67陽性組hsa_circ_0030777低表達率低(r=0.179，P=0.047,表1)。

圖5 乳腺癌中ER、PR、HER-2、Ki-67的表達，EnVision兩步法：A.ER陰性；B.ER陽性；C.PR陰性；D.PR陽性；E.HER-2 0；F.HER-2 3+；G.Ki-67陰性；H.Ki-67陽性 圖6 乳腺癌免疫組化HER-2 2+行FISH法檢測：A. HER-2陰性；B. HER-2陽性

表1 環(huán)狀RNA circ_0030777表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

乳腺癌是我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，盡管在診斷和治療方面取得了一定進展，相對于其他腫瘤的5年生存率(82.0%)較高，但我國與發(fā)達國家比較還存在較大差距(90.9%)[1,7]，其主要原因是臨床早期就診率低，以及晚期病例臨床診治不規(guī)范。因此，早期診斷和及時治療是提高乳腺癌患者生存率與生存質(zhì)量的關(guān)鍵[8]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA在乳腺癌中穩(wěn)定表達，且越來越多的報道顯示環(huán)狀RNA在乳腺癌中異常表達，并且發(fā)揮重要作用[4]。Lu等[9]對4例乳腺癌腫瘤組織和癌旁正常組織進行環(huán)狀RNA微陣列檢測發(fā)現(xiàn)，715個在乳腺癌中上調(diào)，440個下調(diào)的環(huán)狀RNA。Wang等[10]通過RNA測序和芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了480個在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中較原位癌中有差異的環(huán)狀RNA，5 842個在MDA-MB-231和MCF-7乳腺細胞中表達差異的環(huán)狀RNA。CircSKA3高表達通過侵襲偽足的形成，促使體內(nèi)和體外腫瘤侵襲性增加，促進乳腺癌的進展[11]。環(huán)狀RNA circANKS1B和circAGFG1在三陰型乳腺癌組織及細胞中高表達，circANKS1B表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進展期乳腺癌有關(guān)，通過與miR-148a-3p和miR-152-3p的海綿作用，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。

本實驗通過環(huán)狀RNA芯片篩選出特異性低表達的環(huán)狀RNA circ_0030777，通過qRT-PCR和Sanger測序進一步驗證發(fā)現(xiàn)，與良性病變組織比較，乳腺癌中環(huán)狀RNA circ_0030777表達明顯下調(diào)，通過ROC曲線發(fā)現(xiàn)，circ_0030777是乳腺癌中的一種較好的分子標志物。以ROC曲線截點為分界點，將環(huán)狀RNA circ_0030777表達分為高表達組和低表達組，進一步發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA circ_0030777表達與ER、PR和Ki-67有關(guān)。Ki-67是與細胞增殖密切相關(guān)的細胞核蛋白，在有絲分裂時逐漸增加到最大值[13]。腫瘤細胞中Ki-67表達水平變化與腫瘤細胞的增殖活性有關(guān)，部分反映了腫瘤的侵襲性，而腫瘤細胞的侵襲性與疾病預后密切相關(guān)。歐洲腫瘤標志物小組指南中提出，Ki-67表達升高與乳腺癌患者的不良預后獨立相關(guān)[14]。ER和PR作為乳腺癌內(nèi)分泌治療的重要指標，表明了其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要地位。研究顯示，ER在乳腺癌組織中的表達高于非乳腺癌組織；而乳腺癌高發(fā)人群較低發(fā)人群的乳腺上皮中有更多ER表達，ER可以促進乳腺正常和新生上皮細胞的增殖，從而增加乳腺癌的發(fā)病率及復發(fā)率[15]。這些證據(jù)均表明circ_0030777在乳腺癌中的重要作用。

綜上所述，環(huán)狀RNA是乳腺癌診斷和預后的重要生物學標志物。本實驗結(jié)果顯示，環(huán)狀RNA circ_0030777在乳腺癌中低表達，提示其在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。Circ_0030777低表達與ER、PR和Ki-67表達相關(guān)，為其成為高特異性和敏感性的乳腺癌分子標志物提供實驗依據(jù)。