化生性乳腺癌免疫微環(huán)境中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和PD-L1表達(dá)及臨床病理意義

胡 月，程嵐卿，王 弦,2，王志皓，吳 強(qiáng),2

化生性乳腺癌(metaplastic breast cancer, MBC)是一組異質(zhì)性腫瘤，其特征是腫瘤性上皮向鱗狀細(xì)胞和(或)間葉樣成分分化，包括但不限于梭形細(xì)胞、軟骨樣和骨樣細(xì)胞[1]。MBC往往伴有浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌非特殊型(invasive ductal carcinoma of no special type, IDC-NST)成分。目前對(duì)于MBC的化生亞型與預(yù)后的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。MBC整體生存率不佳，容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且目前尚無(wú)有效的預(yù)后指標(biāo)[2]。

本課題組前期研究顯示，乳腺癌中腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils, TANs)浸潤(rùn)與乳腺癌患者無(wú)瘤生存期呈負(fù)相關(guān)[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中腫瘤衍生的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子通過(guò)Janus激酶(JAK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路，激活胃癌中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞，并表達(dá)高水平細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)，進(jìn)而抑制正常T細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且在體內(nèi)促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)和發(fā)展[4]。MBC中尚無(wú)關(guān)于TANs和PD-L1相關(guān)性的研究，因此，本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化法檢測(cè)MBC中TANs的浸潤(rùn)情況與PD-L1的表達(dá)，分析TANs和PD-L1表達(dá)的關(guān)系，探究TANs與PD-L1在MBC中的作用及其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2011～2020年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院存檔的47例MBC手術(shù)切除標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未行新輔助化療，并經(jīng)復(fù)查核實(shí)。所有腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO(2019)MBC組織學(xué)分型。根據(jù)腫瘤成分類型分類：鱗狀細(xì)胞癌22例、梭形細(xì)胞癌5例、低級(jí)別腺鱗癌1例、伴異源性間葉樣分化型9例、混合型10例(含兩種及兩種以上化生成分)。此外，47例MBC中同時(shí)具有化生成分和NST成分有41例。MBC患者中位年齡51.6歲。對(duì)患者進(jìn)行隨訪，每半年隨訪1次，隨訪方式為查詢門診病歷或電話隨訪。當(dāng)患者出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或死亡等事件時(shí)作為隨訪終點(diǎn)，隨訪截至2020年8月。

1.2 試劑鼠抗人CD66b單克隆抗體(G10F5，BD Pharmingen公司)，抗人PD-L1兔單克隆抗體(SP142，Abcam公司)，小鼠/兔聚合法檢測(cè)通用性試劑盒(北京中杉金橋公司、美國(guó)羅氏公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司、美國(guó)羅氏公司)。

1.3 方法所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋。蠟塊經(jīng)4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化染色。應(yīng)用CD66b標(biāo)記TANs，采用EnVision兩步法進(jìn)行免疫組化染色；通過(guò)Roche BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化儀半抗原及Optiview增強(qiáng)放大系統(tǒng)對(duì)癌組織進(jìn)行PD-L1染色。

1.4 結(jié)果判讀免疫組化結(jié)果判讀由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法對(duì)染色切片進(jìn)行全面觀察，判讀結(jié)果取平均值。TANs計(jì)數(shù)[3]：以中性粒細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)強(qiáng)染色為陽(yáng)性，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野MBC中化生成分癌實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)的CD66b陽(yáng)性中性粒細(xì)胞總數(shù)作為其浸潤(rùn)密度。以TANs浸潤(rùn)密度的中位數(shù)作為區(qū)分TANs浸潤(rùn)高、低密度的指標(biāo)。PD-L1判讀[5]：以細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色點(diǎn)狀或線狀染色為陽(yáng)性，采用IC計(jì)數(shù)法評(píng)估免疫細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞)染色結(jié)果，即任何強(qiáng)度的PD-L1陽(yáng)性免疫細(xì)胞所占腫瘤面積的比例≥1%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad(Prism 5.0)和SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。連續(xù)變量的差異分析采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，樣本率之間的比較采用卡方檢驗(yàn)或費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。用Kaplan-Meier曲線和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行多因素Cox回歸分析。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MBC中TANs浸潤(rùn)及PD-L1的表達(dá)在MBC化生成分癌實(shí)質(zhì)及癌間質(zhì)均觀察到TANs浸潤(rùn)。癌實(shí)質(zhì)TANs浸潤(rùn)密度為0～283.0，浸潤(rùn)密度中位數(shù)為4.0。其中低密度TANs組中位數(shù)為1.0，平均數(shù)為1.4±1.0；高密度組中位數(shù)為36.0，平均數(shù)為68.2±76.7(圖1～3)。癌間質(zhì)TANs浸潤(rùn)密度中位數(shù)為1.0，化生成分癌實(shí)質(zhì)TANs浸潤(rùn)密度高于癌間質(zhì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。PD-L1在單一化生成分型MBC中的陽(yáng)性率32.4%(12/37)，在混合化生成分型中的陽(yáng)性率90.0%(9/10)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)TANs浸潤(rùn)密度和PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行了自身對(duì)照，41例同時(shí)具有化生成分和NST成分病例中，化生成分中的TANs浸潤(rùn)密度高于NST成分(P<0.05，圖5)，化生成分中的PD-L1陽(yáng)性率高于NST成分(P<0.05，表2)。

圖1 CD66b和PD-L1在鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)：A. HE染色；B. 浸潤(rùn)的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達(dá)，Roche BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化 圖2 CD66b和PD-L1在梭形細(xì)胞癌中的表達(dá)：A. HE染色；B. 浸潤(rùn)的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達(dá)，Roche BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化 圖3 CD66b和PD-L1在伴軟骨樣成分分化型MBC中的表達(dá)：A. HE染色；B. 浸潤(rùn)的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達(dá)，Roche BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化

表1 MBC中TANs密度和PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖4 MBC癌實(shí)質(zhì)和癌間質(zhì)的TANs浸潤(rùn)密度差異

圖5 TANs在MBC化生成分癌實(shí)質(zhì)與NST成分癌實(shí)質(zhì)中的浸潤(rùn)情況

表2 MBC化生成分和NST成分的PD-L1表達(dá)情況

2.2 TANs浸潤(rùn)密度、PD-L1表達(dá)與MBC臨床病理特征的關(guān)系在MBC癌組織中，TANs高密度浸潤(rùn)與患者年齡>50歲、TNM高分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ER陰性、高Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05，表1)；PD-L1陽(yáng)性與HER-2過(guò)表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，表1)。生存分析顯示，TANs浸潤(rùn)密度與患者3年無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01，圖6A)，PD-L1表達(dá)與患者3年P(guān)FS無(wú)相關(guān)性(P>0.05，圖6B)。MBC患者3年P(guān)FS的Cox多因素分析顯示，MBC中TANs浸潤(rùn)密度與3年P(guān)FS密切相關(guān)(P<0.05，表3)，是較差的PFS獨(dú)立危險(xiǎn)因素。TANs浸潤(rùn)密度與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.309，P<0.05，圖7)。

圖6 A. TANs浸潤(rùn)密度與患者PFS的關(guān)系；B. PD-L1表達(dá)與患者PFS的關(guān)系

圖7 MBC癌組織中TANs浸潤(rùn)密度與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性

表3 MBC患者3年P(guān)FS的Cox多因素分析

3 討論

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是決定腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)鍵因素之一[6]。TME包括多種免疫細(xì)胞、非免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[7]。MBC雖然被視為一種具有相對(duì)免疫原性的乳腺癌，但研究表明，MBC的TME存在豐富的免疫細(xì)胞如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)，并影響其腫瘤進(jìn)展與預(yù)后[8]。

中性粒細(xì)胞是抵抗感染和損傷的第一道防線。過(guò)去認(rèn)為，TME中中性粒細(xì)胞可能是防御性免疫反應(yīng)的指標(biāo)，然而最新研究顯示TANs可以增強(qiáng)局部腫瘤的生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[9]。TANs分泌的彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)在TME中可以降解胰島素受體底物1，進(jìn)而加強(qiáng)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和血小板源性生長(zhǎng)因子受體之間的相互作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[10]。中性粒細(xì)胞釋放的細(xì)胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。NETs是由具有金屬蛋白酶的DNA支架和活化的中性粒細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，NETs可直接影響腫瘤細(xì)胞，通過(guò)激活NF-κB等信號(hào)傳導(dǎo)途徑或通過(guò)NETs中的NE等蛋白酶促進(jìn)其增殖[11]。NETs還能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散。在小鼠結(jié)腸癌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NETs在體外通過(guò)激活小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中TLR9生長(zhǎng)信號(hào)通路釋放高遷移率族蛋白B1，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的遷移和侵襲[12]。Park等[13]的研究亦印證了這點(diǎn)，在小鼠三陰型乳腺癌肺轉(zhuǎn)移病灶中NETs的陽(yáng)性率高于原發(fā)病灶，并且使用脫氧核糖核酸酶Ⅰ抑制NETs的形成可以顯著減少小鼠三陰型乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。本組中，TANs高密度浸潤(rùn)MBC組相對(duì)于TANs低密度浸潤(rùn)MBC組具有更高的Ki-67增殖指數(shù)。這表明，MBC中TANs浸潤(rùn)密度和癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了TANs可能會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。此外，本組病例中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的6例患者均伴隨TANs高密度浸潤(rùn)(6/6)，明顯高于未轉(zhuǎn)移患者。這表明TANs高密度浸潤(rùn)與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，TANs在MBC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程可能發(fā)揮重要作用。

TANs除了促進(jìn)MBC癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，還與MBC的PFS密切相關(guān)。在本組中，TANs高密度浸潤(rùn)與ER陰性、高TNM分期呈正相關(guān)，與PFS呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與既往研究一致[14]。多因素分析顯示，TANs浸潤(rùn)密度與3年P(guān)FS密切相關(guān)，浸潤(rùn)密度越高，患者出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)越大。這表明，TANs高密度浸潤(rùn)與MBC進(jìn)展密切相關(guān)，有望成為一個(gè)潛在的MBC生物學(xué)標(biāo)志物。這也為MBC中針對(duì)中性粒細(xì)胞的靶向治療提供新思路。

TANs還可以通過(guò)上調(diào)PD-L1表達(dá)，抑制T細(xì)胞增殖從而抑制腫瘤免疫反應(yīng)。Shang等[15]研究證實(shí)卵巢癌中HOXA轉(zhuǎn)錄本可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞分泌白介素-6，上調(diào)PD-L1表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)，最終加速卵巢癌細(xì)胞的免疫逃逸。

乳腺癌中PD-L1表達(dá)通常與預(yù)后不良的臨床病理特征呈正相關(guān)。如在一項(xiàng)關(guān)于PD-L1與乳腺癌臨床病理特征的Meta分析中發(fā)現(xiàn)，PD-L1陽(yáng)性與HER-2過(guò)表達(dá)密切相關(guān)[16]。本組中PD-L1陽(yáng)性與HER-2過(guò)表達(dá)亦呈正相關(guān)。有研究表明HER-2過(guò)表達(dá)與MBC的惡性特征直接相關(guān)[17]。此外，PD-L1在存在一種以上化生成分MBC中的陽(yáng)性率高于單一化生成分型MBC，而存在一種以上化生成分是MBC中無(wú)復(fù)發(fā)和特異性生存率的不良因素之一[18]。盡管本組中PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性(或與樣本量過(guò)少有關(guān))，但PD-L1表達(dá)與MBC的惡性特征呈正相關(guān)，這提示PD-L1可能影響MBC的進(jìn)展，也為開(kāi)展免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors, ICIs)如PD-1/PD-L1抑制劑的免疫治療提供證據(jù)。Al Sayed等[19]在1例轉(zhuǎn)移性MBC中聯(lián)合使用抗PD-L1抗體(durvalumab)與化療藥物紫杉醇，治療效果良好且副作用小。此外ICIs在MBC中的治療效果已進(jìn)入臨床研究(NCT02834013)。本組中PD-L1的陽(yáng)性率為44.7%(21/47)，與既往MBC研究中PD-L1的陽(yáng)性率47.6%大致相符[8]。這提示接近一半對(duì)放化療反應(yīng)不佳的MBC患者可能從ICIs治療中獲益。

研究證實(shí)腫瘤組織中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)密度與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)，如膽管細(xì)胞癌中TANs密度與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MBC中TANs浸潤(rùn)密度與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)果一致。這提示TANs與PD-L1可能共同參與MBC的進(jìn)展，影響MBC患者的預(yù)后。此外，針對(duì)中性粒細(xì)胞的靶向治療還可以協(xié)助PD-1/PD-L1抑制劑發(fā)揮治療作用。Kargl等[21]研究小鼠肺非小細(xì)胞肺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞抑制劑可協(xié)助PD-1抑制劑攻擊肺癌細(xì)胞，使癌灶體積縮小，延緩腫瘤產(chǎn)生耐藥性的時(shí)間，這提示中性粒細(xì)胞抑制劑也許是ICIs有效的輔助治療手段。

綜上所述，化生成分癌實(shí)質(zhì)中浸潤(rùn)的TANs與MBC進(jìn)展及PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)，有望成為MBC無(wú)進(jìn)展生存率的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。