含硅羥基磷灰石調(diào)節(jié)巨噬細胞極性促進成骨分化機制研究

王志英，楊秋霞，田新利，林雪霞

硅是人體重要的微量元素，參與骨的代謝［1］，而羥基磷灰石（HA）是骨的主要無機成分。含硅羥基磷灰石（si-HA）具有良好的骨傳導性和骨誘導性，是一種性能優(yōu)良的無機骨再生修復材料［2］，多年來受到生物材料學界的普遍關(guān)注。但是，si-HA刺激成骨的確切機制尚未明確。既往研究多采用si-HA直接刺激成骨細胞，觀察其成骨分化，實現(xiàn)骨再生修復［3］。然而，體內(nèi)成骨過程是在由骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等多個系統(tǒng)細胞協(xié)同營造的局部微環(huán)境中完成的，以往研究往往忽視了炎癥反應在材料介導成骨過程中所起的重要作用。隨著對宿主與生物材料相互作用研究的深入，學者們逐漸意識到生物材料植入體內(nèi)，并非只與成骨細胞接觸，首先與材料接觸的是免疫細胞［4］，免疫細胞是骨再生微環(huán)境的中心調(diào)控者［5］。在所有免疫細胞中，巨噬細胞是啟動和維持炎癥反應的主要細胞［6］。因此，本研究將巨噬細胞作為研究免疫調(diào)節(jié)的模型細胞。另據(jù)文獻報道，巨噬細胞具有極大的功能可塑性［7］。一般認為其存在2種極化狀態(tài)，即M1型（炎癥型）和M2型（修復型）［8］。M1型巨噬細胞啟動炎癥反應，分泌大量的促炎因子；M2型巨噬細胞參與組織的后期修復［9-11］。在成骨生物材料的作用下，巨噬細胞產(chǎn)生何種極化狀態(tài)，在其產(chǎn)生的免疫微環(huán)境中，前成骨細胞會產(chǎn)生何種成骨能力的改變，鮮有報道。本研究采用小鼠巨噬細胞（RAW264.7，RAW）和小鼠前成骨細胞（MC3T3-E1，3T3）通過體外實驗探索該機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、試劑與儀器 3T3和RAW均購自中國科學院上海細胞庫，高糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶、雙抗、胎牛血清（Gibco，USA），CCK-8（biosharp生物科技公司），BCA試劑盒（Sigma公司，美國），堿性磷酸酶（ALP）活性檢測試劑盒（日本W(wǎng)AKO公司），Trizol Reagent（Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒（Thermo Scientific公司）。CO2細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO，MCO-15AC），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS-CX41），低溫高速離心機（德國Sartorius-3k30），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，BCM-1000），多功能酶標儀（美國BioTek公司-ELx808），超微量紫外分光光度計（美國NanoDrop公司，NanoDrop2000）。

1.2 HA和si-HA納米粒子的制備 利用熱化學沉淀法制備HA和si-HA納米粒子。硝酸鈣［Ca（NO3）2·4H2O］為鈣源，磷酸氫二銨［（NH4）2HPO4］為磷源，醋酸硅［Si（CH3COO）4］在反應過程中水解提供硅源。據(jù)文獻報道［3］和本實驗室前期研究［12］，當摻硅量為0.8%（質(zhì)量分數(shù)）時，si-HA具有最高的生物成骨活性，因此本研究采用此硅含量的si-HA。合成步驟：稱取Ca（NO3）2·4H2O 7.04 g和（NH4）2HPO43.094 g，分別溶于80 mL三蒸水中；將Ca（NO3）2·4H2O溶液倒入三口瓶，稱取Si（CH3COO）4粉末0.248 g（HA合成時不再加入）加入三口瓶中；調(diào)節(jié)溫度65℃，攪拌加熱1 h，直至Si（CH3COO）4溶解；將溫度設定為90℃，控制（NH4）2HPO4溶液緩慢均勻滴入三口瓶中，過程中不斷加入濃氨水溶液，使pH值穩(wěn)定在11；反應1 h后，制備樣品靜置過夜。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 3T3和RAW細胞均采用高糖DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。當細胞融合度達80%~90%時，3T3細胞采用胰酶消化，1 000 r/min離心6 min，收集細胞后傳代。由于RAW細胞貼壁較牢，加入PBS，用細胞刮輕輕刮下，離心去除PBS，按1∶3比例進行傳代。取對數(shù)生長期的3T3和RAW細胞用于后續(xù)實驗。（1）RAW細胞分組。實驗設Control組、HA組和si-HA組。Control組RAW細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，不加入材料；HA組和si-HA組RAW細胞在DMEM完全培養(yǎng)基中分別加入10 mg/L的HA和si-HA納米粒子材料懸液進行培養(yǎng)。（2）3T3細胞分組。將完全培養(yǎng)基、HA和si-HA納米粒子刺激RAW細胞3 d后獲得的上清液，以1∶2的比例與完全培養(yǎng)基混合，稱為條件培養(yǎng)基（RAW條件培養(yǎng)基、HA+RAW條件培養(yǎng)基和si-HA+RAW條件培養(yǎng)基）。將3T3細胞分別采用3種條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，分為RAW組、HA＋RAW組和si-HA＋RAW組；另設空白對照組，采用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 qPCR檢測巨噬細胞的極化狀態(tài) RAW細胞在完全培養(yǎng)基、10 mg/L HA與10 mg/L si-HA納米粒子材料懸液中分別培養(yǎng)3 d（Control組、HA組和si-HA組），采用qPCR檢測RAW細胞M1極化標志物誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、M2極化標志物Arginase基因及各種促炎、抗炎因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10和IL-1ra的mRNA表達。細胞總RNA提取、cDNA合成、qPCR反應均按照相應試劑盒說明書進行。qPCR反應總體系10μL，包括5μL qPCR mix SYBR green，3.4μL Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix和濃度為10μmol/L的上、下游引物各0.4μL，10倍稀釋的cDNA 0.8μL。反應條件：預變性95℃10 min；95℃15 s，60℃35 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計算細胞中基因相對表達量。實驗重復3次。引物序列見表1。

Tab.1 Amplification of gene primers by qPCR表1 qPCR擴增基因引物序列

1.5 條件培養(yǎng)基對3T3細胞增殖及成骨分化的影響

1.5.1 3T3細胞在條件培養(yǎng)基中的增殖情況 取對數(shù)生長期3T3細胞，按密度3×103個/孔接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后分別更換完全培養(yǎng)基（空白對照組）和不同的條件培養(yǎng)基（RAW條件培養(yǎng)基、HA+RAW條件培養(yǎng)基和si-HA+RAW條件培養(yǎng)基），每組均設置5個平行復孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1、3和7 d。每孔加入含10%CCK-8的培養(yǎng)液100μL，培養(yǎng)箱中避光孵育1 h；酶標儀檢測在450 nm處各孔細胞光密度（OD）值，分析細胞增殖情況。實驗重復3次。

1.5.2 3T3細胞在條件培養(yǎng)基中的成骨分化能力（1）3T3細胞ALP活性定量分析。將3T3細胞按密度1×104個/孔接種于24孔板，貼壁培養(yǎng)24 h后，分別更換完全培養(yǎng)基（空白對照組）和不同條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2~3 d更換1次，待培養(yǎng)至7、14 d后終止培養(yǎng)，檢測3T3細胞的ALP活性。提取細胞總蛋白，按照BCA試劑盒說明書步驟檢測總蛋白濃度。ALP活性定量采用日本W(wǎng)AKO公司的ALP檢測試劑盒，按照說明書步驟進行操作：向96孔板中加入100μL底物緩沖液，再分別加入20μL標準液或細胞裂解液，放入37℃烘箱孵育1 h；向96孔板每孔加入80μL反應終止液，于酶標儀中測定每孔在405 nm處的OD值。（2）3T3細胞基質(zhì)礦化的茜素紅染色及半定量分析。3T3細胞培養(yǎng)21 d后，吸去培養(yǎng)基，PBS漂洗3次后，4%多聚甲醛常溫下固定20 min，加入1 mL茜素紅染液染色15~20 min。鏡下觀察拍片后采用洗脫法進行半定量分析，步驟如下：在24孔板中，每孔加入1 mL洗脫液并上搖床以120 r/min搖勻至試樣上染料充分溶解，每孔取3份150μL洗脫液，轉(zhuǎn)入96孔板中，測定620 nm波長處OD值并使用空白洗脫液調(diào)零。（3）qPCR檢測3T3細胞成骨相關(guān)基因表達。將3T3細胞按密度5×104個/孔接種于6孔板，分別培養(yǎng)7、14 d后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qPCR法檢測成骨基因ALP、OCN、OPN、Col-1、Runx2mRNA表達水平，以GADPH為內(nèi)參。操作步驟同1.4，引物序列見表2。按照2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。

Tab.2 Amplification of osteogenic gene primers by qPCR表2 qPCR擴增成骨基因引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HA、si-HA納米粒子對巨噬細胞極化狀態(tài)及炎性因子mRNA表達的影響 與Control組相比，HA組巨噬細胞M1表型因子iNOS及促炎因子TNF-α、IL-1βmRNA表達水平升高，M2表型因子Arginase及抗炎因子IL-10mRNA表達水平降低（P＜0.05）。si-HA組iNOS、TNF-α、IL-1βmRNA表達水平均低于Control組和HA組，Arginase、IL-10和IL-1ramRNA表達水平均高于Control組和HA組（P＜0.05）；IL-6mRNA表達水平低于HA組（P＜0.05），與Control組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

2.2 巨噬細胞的極化狀態(tài)對3T3細胞增殖能力的影響 各組3T3細胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)1、3、7 d時的細胞增殖能力依次增強，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。培養(yǎng)1 d時，各組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；培養(yǎng)3、7 d時，si-HA+RAW組3T3細胞增殖能力明顯強于空白對照組、RAW組和HA+RAW組（P＜0.05），見表4。

2.3 巨噬細胞的極化狀態(tài)對3T3細胞成骨分化能力的影響

2.3.1 3T3細胞ALP活性的定量分析 3T3細胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7、14 d時，RAW組3T3細胞ALP活性與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；si-HA+RAW和HA+RAW組3T3細胞ALP活性均顯著強于空白對照組和RAW組，si-HA+RAW組3T3細胞ALP活性明顯強于HA+RAW組（P＜0.05），見表5。

Tab.3 Comparison of the mRNA expression levels of inflammatory factors between the three groups of macrophages表3 3組巨噬細胞炎性因子mRNA表達水平的比較 （n=3，x±s）

Tab.4 Comparison of the 3T3 cell growth after treatment with different conditioned medium between the four groups表4 不同條件培養(yǎng)基處理后3T3細胞生長情況比較（n=3，OD值，x±s）

Tab.5 Comparison of the ALP activity between the four groups of 3T3 cells表5 各組3T3細胞ALP活性的比較 （n=3，x±s）

2.3.2 3T3細胞基質(zhì)礦化的茜素紅染色及半定量分析結(jié)果 3T3細胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后，HA+RAW組和si-HA+RAW組均有大量紅色鈣結(jié)節(jié)形成，空白對照組和RAW組中幾乎無著色的鈣結(jié)節(jié)，見圖1。半定量分析結(jié)果顯示，空白對照組、RAW組、HA+RAW組和si-HA+RAW組OD值分別為0.200±0.030，0.209±0.032，0.933±0.040和1.637±0.061，差異有統(tǒng)計學意義（F=578.606，P＜0.01）。si-HA+RAW和HA+RAW組3T3細胞OD值高于空白對照組和RAW組，si-HA+RAW組3T3細胞OD值顯著高于HA+RAW組（P＜0.05）。RAW組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

Fig.1 Images of calcium nodules 21 days after osteogenic differentiation(×200)圖1 成骨分化21 d后鈣結(jié)節(jié)的茜素紅染色（×200）

2.3.3 各組3T3細胞成骨相關(guān)基因mRNA表達水平變化 3T3細胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d時，si-HA+RAW組3T3細胞ALP、Col-1、Runx2mRNA表達水平高于空白對照組、RAW組和HA+RAW組（P＜0.05），OPNmRNA表達水平與其他3組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；HA+RAW組ALP、Runx2mRNA表達水平高于空白對照組和RAW組（P＜0.05）。培養(yǎng)14 d時，si-HA+RAW組3T3細胞ALP、OCN、OPN、Col-1、Runx2mRNA表達水平均高于其他3組（P＜0.05）；HA+RAW組ALP、Runx2mRNA表達水平高于空白對照組和RAW組，OCNmRNA表達水平高于空白對照組，Col-1mRNA表達水平高于RAW組（P＜0.05），見表6。

Tab.6 Comparison of mRNA expression levels of bone related genes between the four groups表6 各組成骨相關(guān)基因mRNA表達水平的比較 （n=3，x±s）

3 討論

硅是結(jié)締組織發(fā)育和骨代謝中重要的微量元素。多項研究表明含硅的生物材料可促進成骨細胞分化，如含硅的磷灰石、生物活性玻璃和硅酸鈣水泥等［13-14］，但其刺激成骨的確切機制尚未明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)參與骨缺損部位的骨形成過程，并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［15-16］。外周巨噬細胞主要參與炎癥和宿主防御反應，特別是機體固有免疫反應［17］。當骨修復材料植入缺損部位后可導致機體產(chǎn)生固有免疫反應和適應性免疫反應，過度的炎癥反應可引起“異物反應”，形成慢性炎癥以及纖維包裹，將“異物”與機體隔絕或者排出體外［18］。因此，機體反應既可阻礙生物材料發(fā)揮成骨作用，也可通過調(diào)節(jié)成骨和破骨細胞的活性及分化而促進骨形成［19］，適當控制免疫反應是促進成骨的重要手段［20］。本研究從骨免疫學的角度對羥基磷灰石和si-HA納米粒子進行分析，通過體外細胞實驗研究巨噬細胞在不同材料懸液的作用下產(chǎn)生的免疫微環(huán)境對成骨過程的影響。

M1、M2是巨噬細胞的2種極化類型。M1又稱經(jīng)典性活化，分泌多種促炎細胞因子，包括炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18），趨化因子，活性氧和氮中間產(chǎn)物等［21］；M2又稱替代性活化，主要通過分泌細胞因子，如纖維連接蛋白、IL-1β、IL-6、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，發(fā)揮抗炎及維持組織平衡功能［22］。巨噬細胞通過M1、M2極化表型分泌不同的炎性細胞因子調(diào)控炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠巨噬細胞在不同納米粒子的材料懸液中產(chǎn)生不同的極化狀態(tài)。si-HA能夠顯著抑制M1表型因子iNOS和促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的表達，進而抑制炎癥反應。同時si-HA材料懸液顯著促進RAW細胞M2表型因子Arginase和抗炎因子IL-10和IL-1ra的表達，提示經(jīng)si-HA納米粒子刺激后，RAW細胞表現(xiàn)出向M2極化的趨勢。相反，在HA納米粒子作用下小鼠RAW巨噬細胞的基因表達傾向于促炎型，促炎基因iNOS、TNF-α和IL-1β的表達顯著上調(diào)，提示HA和si-HA懸液對巨噬細胞M1/M2極化產(chǎn)生了不同的調(diào)控作用。

目前對于巨噬細胞的不同表型對成骨的作用尚未達成共識。Chen等［23］研究認為人巨噬細胞上清液可抑制間充質(zhì)干細胞（MSC）成骨分化的過程，主要是由于上清液中含有大量的TNF-α和IL-1β。Lee等［24］研究發(fā)現(xiàn)鈦顆?；罨男∈缶奘杉毎种菩∈笄俺晒羌毎晒欠只?，主要是由于巨噬細胞分泌的TNF-α可抑制Wnt和BMP2信號通路。M1型巨噬細胞啟動炎癥反應，分泌大量的促炎因子，可抑制成骨分化；M2型巨噬細胞參與組織的后期修復，巨噬細胞適度地向M2極化可促進骨生成；然而也有研究表明M1型巨噬細胞具有促進骨生成的作用［25］。因此，本研究旨在探究在HA和si-HA納米粒子刺激下，巨噬細胞不同極化狀態(tài)所產(chǎn)生的免疫微環(huán)境對小鼠前成骨細胞的增殖和成骨分化能力的影響。

本研究結(jié)果顯示，si-HA+RAW組3T3細胞的增殖能力顯著高于其他3組，提示HA中摻入硅所刺激產(chǎn)生的微環(huán)境能更好地促進3T3細胞增殖，使細胞具有更高活力。

ALP是成骨細胞表型和早期成骨分化的典型標志物，是檢測成骨細胞分化的重要指標。本研究結(jié)果顯示，3T3細胞采用完全培養(yǎng)基、RAW、HA+RAW和si-HA+RAW條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7、14 d時，si-HA+RAW組和HA+RAW組3T3細胞ALP活性顯著高于空白對照組和RAW組，且si-HA+RAW組明顯高于HA+RAW組，提示si-HA+RAW條件培養(yǎng)基具有較強的刺激成骨作用。3T3細胞在成骨分化后期會出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)現(xiàn)象，這是成骨分化后期的另一重要標志。本研究結(jié)果顯示，si-HA+RAW組和HA+RAW組3T3細胞的礦化結(jié)節(jié)形成顯著高于空白對照組和RAW組。另外，3T3細胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d時，si-HA+RAW組3T3細胞ALP、Col-1、Runx2 mRNA表達水平高于其他3組；培養(yǎng)14 d時，si-HA+RAW組3T3細胞ALP、OCN、OPN、Col-1、Runx2 mRNA表達水平均高于其他3組。這些結(jié)果均提示在si-HA的刺激下，巨噬細胞的極化狀態(tài)可顯著促進3T3細胞的增殖與成骨分化。

綜上所述，si-HA納米粒子可誘導巨噬細胞產(chǎn)生較有利的骨免疫微環(huán)境，增強3T3細胞的增殖和成骨分化。