葛根總皂苷調(diào)控NAMPT-Sirt1軸誘導(dǎo)BMSCs向髓核樣細(xì)胞分化

岳宗進(jìn)，劉汝銀，于露，王新立，馮仲鍇，王西彬

中老年人椎間盤退變加重常引起腰痛和下肢疼痛，甚至引起尿便失禁及其他功能障礙。椎間盤退變的典型癥狀是髓核細(xì)胞數(shù)目減少、椎間盤內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)減少、終板軟骨鈣化等［1］。其主要治療方法包括基因治療、細(xì)胞因子治療、細(xì)胞或髓核移植及組織工程技術(shù)等［2-3］，但這些方法均無(wú)法恢復(fù)脊柱的原有解剖結(jié)構(gòu)，甚至造成相鄰椎間盤的病變。隨著干細(xì)胞治療研究的深入，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成髓核細(xì)胞修復(fù)椎間盤有望成為一種新治療手段，但是其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。葛根屬于豆科植物，具有促進(jìn)人體新陳代謝、提高肝臟解毒能力的功效。葛根中的三萜及皂苷類化合物主要為齊墩果烷型，主要有黃豆皂苷元A、B，葛根皂苷元A、B、C等。藥理實(shí)驗(yàn)證明葛根總皂苷（total saponins of pueraria lobata，TSPL）可改善小鼠免疫性肝損傷［4］。目前有關(guān)TSPL促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在探討TSPL對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）定向分化成髓核樣細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制，為TSPL改善椎間盤退變提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和動(dòng)物 大鼠BMSCs（Cat NO.RBM-005F）購(gòu)自美國(guó)ALLCELLS公司。SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量（230±13）g，由河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK（豫）2017-0012。飼養(yǎng)條件：溫度為25℃，相對(duì)濕度為50%~70%，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣，自然光照，自由進(jìn)食和飲水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)Z1.0/612）。

1.1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、Ⅱ型膠原蛋白酶、Alcian Blue、DMEM培養(yǎng)基（高糖）、胎牛血清（Sigma公司）；二甲基亞甲基藍(lán)（DMMB）比色法定量檢測(cè)試劑盒（上海赫澎生物公司）；引物合成（上海生工生物公司）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光PCR（qPCR）試劑（大連TaKaRa公司）；總蛋白提取試劑盒、Prestained Protein Ladder（Thermo Fisher Scientific公司）；Lipo?fectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；兔抗COL2A1多克隆抗體（貨號(hào)：ab34712）、兔抗Aggrecan單克隆抗體（Aggrecan，貨號(hào)：ab186414）、兔抗Sox9單克隆抗體（貨號(hào)：ab185230）、兔抗Tie2單克隆抗體（貨號(hào)：ab221154）、兔抗Sirt1單克隆抗體（貨號(hào)：ab189494）、山羊抗兔IgG（貨號(hào)：ab205718）和過(guò)氧化物酶（HRP）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）/NADH檢測(cè)試劑盒（Biovision公司）；腺苷三磷酸（ATP）檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司）；煙酰胺單核苷酸（NMN）和煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）抑制劑FK866（北京福珺生物科技有限公司）；沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同系物1（Sirt1）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8，北京百泰克生物公司）；去離子水設(shè)備Milli-Q水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；SRT2104試劑（上海普邁生物科技有限公司）。

1.1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)（iBright）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；qPCR儀（型號(hào)：ABI-7300）購(gòu)自美國(guó)ABI公司；蛋白免疫印跡電泳系統(tǒng)（型號(hào)1659001）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)752）購(gòu)自上海光譜儀器有限公司；倒置電子顯微鏡（型號(hào)FM-500）購(gòu)自上海普丹光學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠腰椎間盤退變模型 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、30 mg/kg TSPL治療組和50 mg/kg TSPL治療組，每組8只。腹腔注射6.5%水合氯醛麻醉大鼠，取俯臥位，固定四肢，腰背部備皮，沿腰背部棘突做后正中切口。切開(kāi)皮膚后，沿骨膜下剝離，咬骨鉗去除以L3為中心的L1~S1的棘突、關(guān)節(jié)突和棘上及棘間韌帶，切斷雙側(cè)豎棘肌，逐層縫合皮下筋膜、皮膚。假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚，然后進(jìn)行縫合，處理結(jié)束后將大鼠放入單獨(dú)籠中飼養(yǎng)。治療組大鼠分別給予30、50 mg/（kg·d）TSPL灌胃治療，假手術(shù)組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。飼喂8周后，處死大鼠，顯微鏡下采集大鼠L5~S1椎間盤組織。

1.2.2 TSPL的提取 采用乙醇熱回流及大孔吸附樹(shù)脂方法提取制備葛根總皂苷［3］，含量＞50%。稱取葛根飲片1 kg（廣州中醫(yī)藥大學(xué)大藥房有限公司，批號(hào)：20100319），碾碎后，加入75%乙醇，水浴加熱回流提取3次后，濃縮收集提取液，稱質(zhì)量。然后，大孔吸附樹(shù)脂為固態(tài)相，分別用水和不同梯度（30%、40%、50%、60%和70%）乙醇進(jìn)行洗脫，濃縮收集洗脫液，再次稱質(zhì)量。最后，將TSPL樣品溶解于去離子水，質(zhì)量濃度為2 g/L，去離子水作為參照組。采用分光光度計(jì)于400~800 nm處測(cè)定TSPL的吸光度。

1.2.3 BMSCs的培養(yǎng)和處理 取生長(zhǎng)狀況良好的大鼠BMSCs，使用含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)按1∶3傳代，選取第3代細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，接種于6孔板中。體外實(shí)驗(yàn)分為：（1）BMSCs組，給予生理鹽水處理。（2）BMSCs-TSPL組，分別給予不同劑量（10、20、30、40、50μmol/L）TSPL處理。（3）BMSCs-TSPL-FK866組，分別給予30μmol/L TSPL和2.5μmol/L FK866處理。（4）BMSCs-TSPL-SRT2104組，分別給予30μmol/L TSPL和10μmol/L SRT2104處理。

1.2.4 DMMB比色法檢測(cè)糖胺聚糖含量 分別取各組大鼠L5~S1椎間盤組織0.5 g，加入1 mL HEPENGBIO清理液清洗1次，勻漿器研磨成勻漿，置于離心管中，加入5 mL HEPENGBIO萃取液，漩渦震蕩后，分別在56℃恒溫水槽中孵育16 h，90℃恒溫水槽中孵育10 h。離心后取50μL上清液，加入0.1 mL HEPENGBIO染色液，室溫孵育30 min后，離心棄上清液，加入0.1 mL HEPENGBIO解離液，震蕩后轉(zhuǎn)移到比色皿中，在656 nm處用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)的糖胺聚糖含量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，收集第1、4、7、10、14天的細(xì)胞，通過(guò)高鹽萃取細(xì)胞中可溶性糖胺聚糖，與DMMB染料結(jié)合，在丙醇解離溶液中，產(chǎn)生不溶性紫色或粉紅色糖胺聚糖染料復(fù)合物釋放出染料，分光光度計(jì)于656 nm處定量分析糖胺聚糖的含量，操作步驟同組織測(cè)定。

1.2.5 CCK-8法測(cè)定髓核樣細(xì)胞增殖情況 按照CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。將經(jīng)過(guò)不同處理的細(xì)胞以1.5×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24、48和72 h后，丟棄上清液，并向每孔中添加10μL CCK-8溶液。37℃孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值。

1.2.6 qPCR檢測(cè)髓核樣細(xì)胞中COL2A1、Aggrecan、Sox9、Tie2和Sirt 1mRNA水平 細(xì)胞誘導(dǎo)成熟后，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞中總RNA。測(cè)定RNA濃度后，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)，根據(jù)試劑盒要求進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系：10×Taq bufffer 2.5μL，dNTP mix 2.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，RNase-free water補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件如下：95℃5 min；94℃15 s，54℃30 s，72℃20 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，基因引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot測(cè)定COL2A1、Aggrecan、Sox9、Tie2和Sirt1蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，并溶解于SDS蛋白上樣緩沖液中。每組取40μg上樣蛋白，等量蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h，TSBT清洗后，加入兔抗COL2A1多克隆抗體（稀釋比例1∶300），兔抗Aggrecan單克隆抗體（稀釋比例1∶300），兔抗Sox9單克隆（稀釋比例1∶500），兔抗Tie2單克隆抗體（稀釋比例1∶200）和兔抗Sirt1單克隆抗體（稀釋比例1∶100）于4℃冰箱中孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST漂洗后，與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（稀釋比例1∶1 000）室溫孵育1 h，以GAPDH為內(nèi)參。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，用凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并用Image J軟件對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

1.2.8 WST-8法檢測(cè)各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中NAD+水平 誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，收集各組細(xì)胞，根據(jù)NAD+/NADH測(cè)定試劑盒的步驟進(jìn)行操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計(jì)算NAD+的水平。

1.2.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ATP水平及髓核樣細(xì)胞的NAMPT水平 用離心管離心沉淀細(xì)胞，棄上清液，然后加入裂解液裂解細(xì)胞后，在4℃，12 000×g條件下離心10 min，取上清液，按照ATP試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)ATP水平。按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各處理組細(xì)胞中NAMPT水平，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算NAMPT水平。

Tab.1 Primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)；不同時(shí)點(diǎn)多組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 椎間盤組織和BMSCs中糖胺聚糖含量比較 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組和30、50 mg/kg TSPL治療組椎間盤組織中糖胺聚糖含量（ng/g）分別為2.66±0.22、1.37±0.05、2.01±0.07和2.42±0.17，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3 694.896，P＜0.05）。其中模型組低于假手術(shù)組，30、50 mg/kg TSPL治療組高于模型組，且50 mg/kg TSPL治療組高于30 mg/kg TSPL治療組（P＜0.05）。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMSCs組和不同劑量TSPL組細(xì)胞中糖胺聚糖含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)（P＜0.05）。除處理1 d時(shí)各組細(xì)胞中糖胺聚糖含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各時(shí)點(diǎn)TSPL各組糖胺聚糖含量均高于BMSCs組，10、20、30μmol/L TSPL組糖胺聚糖含量依次升高，40、50μmol/L TSPL組糖胺聚糖含量逐漸降低，見(jiàn)表2。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇30μmol/L TSPL處理細(xì)胞。

不同處理組細(xì)胞中糖胺聚糖含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)（P＜0.05）。處理1 d時(shí)，各組細(xì)胞中糖胺聚糖含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余各時(shí)點(diǎn)，與BMSCs組比較，BMSCs-TSPL組、BMSCs-TSPL-SRT2104組糖胺聚糖含量均增高（P＜0.05），BMSCs-TSPL-FK866組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與BMSCs-TSPL組比較，BMSCs-TSPL-FK866組糖胺聚糖含量降低，BMSCs-TSPL-SRT2104組糖胺聚糖含量增高；與BMSCs-TSPL-FK866組比較，BMSCs-TSPL-SRT2104組糖胺聚糖含量明顯增高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.2 不同處理組BMSCs向髓核樣細(xì)胞分化情況比較 BMSCs組細(xì)胞貼壁后逐漸顯現(xiàn)出梭形、紡錘形；與BMSCs組比較，TSPL單獨(dú)或聯(lián)合SRT2014處理后的BMSCs細(xì)胞形態(tài)由梭形向多角形轉(zhuǎn)變，核周顆粒明顯，細(xì)胞表型接近髓核樣細(xì)胞；與BMSCs-TSPL組比較，BMSCs-TSPL-FK866組BMSCs分化程度減少，而B(niǎo)MSCs-TSPL-SRT2014組促進(jìn)BMSCs向髓核樣細(xì)胞分化，見(jiàn)圖1。

2.3 不同處理組BMSCs細(xì)胞增殖能力比較 不同處理組細(xì)胞增殖能力隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)（P＜0.05）。處理0 h時(shí)，各組細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；處理24 h時(shí)，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于BMSCs組；處理48、72 h時(shí)，與BMSCs組相比，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPLFK866組細(xì)胞增殖能力減弱，BMSCs-TSPLSRT2104組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；BMSCs-TSPLSRT2104組細(xì)胞增殖能力較BMSCs-TSPL-FK866組增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)表4。

Tab.2 Comparison of glycosaminoglycan contents in cells between the six treatment groups表2 BMSCs組和不同劑量TSPL組細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)的糖胺聚糖含量比較 （n=4，mg/L，x±s）

Tab.3 Comparison of glycosaminoglycan contents between the four different treatment groups of cells表3 不同處理組細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)的糖胺聚糖含量比較 （n=4，mg/L，x±s）

Fig.1 Cytographic view of BMSCs differentiated into nucleus pulposus like cells（×100）圖1 BMSCs向髓核樣細(xì)胞分化的細(xì)胞圖（×100）

Tab.4 Comparison of cell proliferation between the four different treatment groups表4 不同處理組細(xì)胞增殖情況的比較 （n=4，x±s）

2.4 不同處理組BMSCs中COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2mRNA表達(dá) qPCR結(jié)果顯示，與BMSCs組相比，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組COL2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表達(dá)水平升高，Tie2mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPL-FK866組COL 2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表達(dá)水平降低，Tie2mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL-FK866組比較，BMSCs-TSPL-SRT2104組COL2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表達(dá)水平升高，Tie2mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表5。

Tab.5 Comparison of mRNA levels of COL2A1,Aggrecan,SOX9 and Tie2 in BMSCs between the four different treatment groups表5 不同處理組COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2 mRNA表達(dá)比較 （n=4，x±s）

2.5 不同處理組BMSCs中COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與BMSCs組相比，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表達(dá)水平升高，Tie2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPL-FK866組COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表達(dá)水平降低，Tie2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL-FK866組比較，BMSCs-TSPL-SRT2104組COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表達(dá)水平升高，Tie2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表6。

Fig.2 COL2A1,Aggrecan,Sox9 and Tie2 protein levels in TSPL-treated BMSCs圖2 Western blot檢測(cè)各組COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表達(dá)

Tab.6 Comparison of protein levels of genes in nucleus pulposus-like cells between the four different treatment groups表6 不同處理組COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表達(dá)比較 （n=4，x±s）

2.6 不同處理組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平 ELISA結(jié)果顯示，與BMSCs組相比，BMSCs-TSPL組和BMSCs-TSPL-SRT2104組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平升高（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPL-FK866組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平降低（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL-FK866組 比 較，BMSCs-TSPL-SRT2104組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表7。

Tab.7 Comparison of the levels of NAD+,ATP and NAMPT in BMSCs between the four different treatment groups表7不同處理組BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT相對(duì)水平的比較 （n=4，x±s）

2.7 不同處理組BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白的表達(dá) 與BMSCs組相比，TSPL單獨(dú)或聯(lián)合SRT2104處理顯著上調(diào)BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）；與BMSCs-TSPL組相比，BMSCs-TSPLFK866組細(xì)胞中Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05），而B(niǎo)MSCs-TSPL-SRT2104組 細(xì) 胞 中Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)表8、圖3。

Tab.8 Comparison of Sirt1 mRNA and protein levels in BMSCs between the four different treatment groups表8不同處理組BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較 （n=4，x±s）

Fig.3 Sirt1 protein level in myeloid cells圖3 髓核樣細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

有研究表明，牛膝皂苷、當(dāng)歸、梓醇、黃芪甲苷等中藥及提取物均可促進(jìn)BMSCs分化成髓核樣細(xì)胞而改善椎間盤退化［5-8］。葛根素通過(guò)ERK1/2和P38MAPK途徑促進(jìn)成骨分化，改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松［9］。椎間盤退變的主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化，尤其是糖胺多糖丟失［10］。因此，本研究分別測(cè)定大鼠椎間盤組織和BMSCs中糖胺聚糖含量來(lái)判斷椎間盤退變情況，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠椎間盤組織中糖胺聚糖含量降低；與模型組相比，TSPL治療組糖胺聚糖含量增加，且50 mg/kg TSPL效果較30 mg/kg顯著；體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量TSPL組糖胺聚糖含量均高于BMSCs組，其中10、20、30μmol/L TSPL組糖胺聚糖含量依次升高，40、50μmol/L TSPL組糖胺聚糖含量逐漸降低，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇30μmol/L TSPL處理細(xì)胞。

BMSCs具有多向分化能力，根據(jù)所處的微環(huán)境不同，可分化成神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和肝樣細(xì)胞等［11-12］。椎間盤由外層的纖維環(huán)及其包繞的髓核構(gòu)成，髓核由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，基質(zhì)主要包括水、蛋白多糖、膠原和非膠原蛋白。退變的椎間盤組織中，細(xì)胞外基質(zhì)降解增強(qiáng)，導(dǎo)致髓核細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白轉(zhuǎn)變成Ⅰ型膠原蛋白［13］，糖胺聚糖含量降低。因此，研究BMSCs向髓核樣細(xì)胞分化對(duì)椎間盤退變疾病的治療具有重要意義。據(jù)報(bào)道，黃芪甲苷Ⅳ可通過(guò)調(diào)節(jié)糖原合成酶激酶（GSK）3β/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化［14］。梓醇通過(guò)Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［15］。本研究結(jié)果顯示，BMSCs經(jīng)TSPL處理后，BMSCs中糖胺聚糖含量增加，且促進(jìn)BMSCs向髓核樣細(xì)胞分化。COL2A1、Aggrecan、Sox9和Tie2作為髓核樣細(xì)胞的特有基因，可用來(lái)判斷BMSCs分化至髓核細(xì)胞的程度［16-17］。Liu等［18］研究表明椎間盤退變過(guò)程中Aggrecan蛋白表達(dá)量降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs經(jīng)TSPL處理可上調(diào)COL2A1、Aggrecan以及Sox9的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并且下調(diào)Tie2 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

NAD+是一種典型的輔酶，介導(dǎo)多種氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)關(guān)鍵代謝途徑中的氫轉(zhuǎn)移。Sirt1是一個(gè)與細(xì)胞分化、衰老、凋亡和能量代謝密切相關(guān)的NAD＋依賴的組蛋白去乙酰化酶［19］。Sirt1通過(guò)連接調(diào)節(jié)NAD+補(bǔ)救途徑的酶反饋回路和晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路，調(diào)節(jié)代謝及晝夜節(jié)律［20-22］。在神經(jīng)退行性疾病治療過(guò)程中，可通過(guò)補(bǔ)充NAD+中間產(chǎn)物來(lái)恢復(fù)NAD+水平，進(jìn)而改善記憶退化和動(dòng)作遲鈍等癥狀。在細(xì)胞增殖和分化的過(guò)程中，NAMPT作為整個(gè)反應(yīng)啟動(dòng)因子，最終產(chǎn)生Sirt1，激活下游信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。據(jù)報(bào)道，在高糖和游離脂肪酸微環(huán)境中，miR-449通過(guò)抑制Sirt1途徑抑制BMSCs的成骨分化［20］。NAMPT/NAD/Sirt1軸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控BMSCs增殖、分化的重要通路之一［23］。NAMPT抑制劑FK866通過(guò)抑制尼克酰胺的合成，降低Sirt1活性，進(jìn)而減少BMSCs的分化。本研究結(jié)果顯示，NAMPT抑制劑FK866下調(diào)TSPL處理的BMSCs中NAMPT和Sirt1蛋白表達(dá)水平，且降低NAD+水平，提示NAMPT/NAD/Sirt1信號(hào)通路被阻斷；經(jīng)Sirt1蛋白的激活劑SRT2104處理后，Sirt1蛋白表達(dá)量增加，提示NAMPT/NAD/Sirt1信號(hào)通路可能在TSPL誘導(dǎo)的BMSCs向髓核樣細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，TSPL可通過(guò)激活NAMPT/NAD/Sirt1信號(hào)通路，促進(jìn)BMSCs向髓核樣細(xì)胞分化來(lái)改善椎間盤退變，這為TSPL治療椎間盤退變提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。