野生東方草莓莖尖培養(yǎng)體系的建立

韓春妮， 王軍利， 豆秀英， 張阿寧， 李美索， 仝玉琴， 馮馨樂

(1.咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽 712046； 2.永壽縣農(nóng)技推廣中心， 陜西 永壽 713400； 3.淳化縣農(nóng)技推廣中心， 陜西 淳化 711200； 4.禮泉縣植保植檢站， 陜西 禮泉 713200)

0 引言

【研究意義】草莓為薔薇科草莓屬草本水果。全球有草莓屬植物50余種，在全球廣為栽培的草莓栽培種是通過八倍體鳳梨草莓(Fragariaananassa)培育而成，而其他倍性的草莓屬植物，多以野生或半野生狀態(tài)分布于世界各地[1-3]。全球常見的野生草莓約有20種，中國自然分布11種左右[1-5]?？梢姡袊牟葺N質(zhì)資源十分豐富，基因庫較大。由于歷史原因，中國草莓育種工作一直比較落后，中國廣為栽培的草莓種基本引種自歐美或日本，自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的栽培種較少[3-6]。因此，培育自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的草莓栽培種對(duì)促進(jìn)我國草莓種植業(yè)的發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】近年來，為培育中國自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的草莓栽培種，增強(qiáng)草莓栽培種的選擇性，同時(shí)，為把中國野生草莓特有的抗逆性強(qiáng)、香味濃郁、果色豐富等優(yōu)質(zhì)基因引入栽培種，我國科學(xué)家進(jìn)行不懈努力并取得一定成效[7-10]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣泛分布于陜西省秦巴山區(qū)的東方草莓，為四倍體野生草莓[1]，其野生環(huán)境為海拔600～1 800 m的林間或溝坎荒坡、砂地、草叢，該野生種植株較矮，匍匐莖細(xì)長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的抗逆性，耐寒、耐旱能力非常強(qiáng)；其葉片呈卵形且較小，兩性花；果實(shí)為圓形或橢圓形，深紅色；種子陷于果面下；果肉細(xì)膩，果香濃郁[3-7]。目前，此珍貴的野生草莓種質(zhì)資源還未得到充分有效的利用。【擬解決的關(guān)鍵問題】以野生東方草莓匍匐莖的莖尖為材料，研究東方草莓的莖尖組培快繁技術(shù)，為其離體染色體加倍等育種工作提供前期材料，促進(jìn)野生草莓種質(zhì)資源的有效利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的東方草莓野生資源采集自陜西省太白山自然保護(hù)區(qū)。2018年5月中旬，東方草莓果實(shí)成熟期，于陜西省太白縣的太白山自然保護(hù)區(qū)挖回多株，栽培于咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝實(shí)訓(xùn)基地，設(shè)立專門圃地，根據(jù)其匍匐莖、花、果實(shí)、葉片等器官的形態(tài)特征，運(yùn)用雷家軍等[8]相關(guān)的鑒定資料和方法，以及《中國植物志》《中國果樹分類學(xué)》《秦嶺植物志》等資料[9-11]，對(duì)其進(jìn)行檢索與鑒定，確定其為東方草莓。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 活性炭對(duì)東方草莓褐化的影響及無菌苗的獲得 2019年5月下旬，于晴天午后選取健壯、無病蟲害的東方草莓苗，用手術(shù)剪剪取長(zhǎng)度為1.0～2.0 cm的匍匐莖頂端多枚放于大燒杯中，流水沖洗12 h以上，在超凈工作臺(tái)上用無菌鑷子將其夾出，放入盛有75%酒精的燒杯中消毒20～25 s，再用2%的NaClO消毒15 ～20 min，無菌水沖洗3～5次，再用高溫、高壓滅菌后的濾紙吸干表面水分，放置在墊有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用高溫滅菌后晾涼的解剖刀切取長(zhǎng)0.5～0.8 cm的莖尖(帶1個(gè)葉原基)作為外植體，接種在基本培養(yǎng)基為MS，并添加0.4 mg/L 6-BA、6 g/L瓊脂粉及30 g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基上，pH 5.8～6.0。

為研究活性炭對(duì)外植體褐化的影響，活性炭的添加量設(shè)置4個(gè)對(duì)比梯度，分別為0 g/L、0.5 g/L、 1.0 g/L、1.5 g/L。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5個(gè)外植體，每組試驗(yàn)接種20瓶。接種后將培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察外植體污染情況，1 d后及時(shí)將未發(fā)生污染的外植體轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的同類新培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件：光照時(shí)長(zhǎng)為12～14 h/d，光強(qiáng)為1 800～2 200 lx，溫度為(22±2)℃。在外植體接種的消毒過程中，由于東方草莓通體被有較長(zhǎng)絨毛，為使消毒徹底，消毒過程不斷搖動(dòng)燒杯或用無菌玻璃棒不斷攪拌。接種4 d后，無菌苗開始褐化。21 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)褐化情況，并計(jì)算褐化率。

1.2.2 不同濃度6-BA對(duì)東方草莓離體增殖的影響 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH5.8～6.0，NAA濃度為0.1 mg/L。6-BA設(shè)置6個(gè)濃度處理：0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6 mg/L。選取由莖尖培養(yǎng)而得的生長(zhǎng)均勻、高度4～5 cm、具有4～5片葉子的東方草莓無根試管苗，將其接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5個(gè)無根試管苗，每個(gè)處理接種10瓶。接種30 d后，統(tǒng)計(jì)外植體增殖倍數(shù)。

1.2.3 基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素種類對(duì)東方草莓生根的影響 基本培養(yǎng)基設(shè)置MS培養(yǎng)基和1/2 MS培養(yǎng)基2個(gè)試驗(yàn)，生長(zhǎng)素類調(diào)節(jié)劑選擇IBA和NAA 2種，每種調(diào)節(jié)劑設(shè)置0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L共 4種濃度。無根草莓試管苗的選?。涸贛S+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)而得的生長(zhǎng)健壯的無根草莓苗，高度5 cm左右，具有4～5片葉子。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種3株無根試管苗。接種21 d后，觀察根系生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)生根數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及結(jié)果差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基活性炭不同添加量東方草莓外植體的污染及褐化情況

由表1看出，培養(yǎng)基活性炭不同添加量各處理東方草莓外植體的污染率無顯著差異，說明污染率和培養(yǎng)基無關(guān)系。培養(yǎng)基中添加活性炭，對(duì)褐化的影響比較顯著。不添加活性炭的培養(yǎng)基，其外植體褐化率高達(dá)84.1%，褐化致死率達(dá)51.2%；培養(yǎng)基添加活性炭后，褐化率及褐化致死率均大幅下降。東方草莓的外植體接種時(shí)，培養(yǎng)基中添加活性炭有利于降低褐化率，此結(jié)果與葉睿華等[12-13]在其他植物的試驗(yàn)結(jié)果相似。當(dāng)活性炭添加量為1.0 g/L時(shí)，褐化率及褐化致死率相對(duì)較低。

表1 不同活性炭添加量東方草莓外植體的污染及褐化情況

未褐化或褐化程度不嚴(yán)重的莖尖，在接種21 d后，不經(jīng)愈傷組織階段而直接萌發(fā)新芽，最終形成叢生芽，從而獲得東方草莓無菌苗。

2.2 不同濃度6-BA培養(yǎng)東方草莓的離體增殖情況

由表2看出，當(dāng)6-BA的濃度為0.1～0.2 mg/L時(shí)，東方草莓長(zhǎng)勢(shì)健壯，但增殖倍數(shù)相對(duì)較低；當(dāng)6-BA的濃度增加至0.3～0.4 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)隨濃度的增加而增加，增殖苗健壯，葉色濃綠；當(dāng)6-BA的濃度增加至0.5 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)開始下降，且增殖苗開始有黃化現(xiàn)象出現(xiàn)。當(dāng)6-BA濃度增加至0.6 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)急劇下降，且苗低矮、皺縮畸形，黃化程度嚴(yán)重。在基本培養(yǎng)基為MS且NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，東方草莓離體增殖的最佳6-BA添加濃度為0.4 mg/L，其增殖倍數(shù)為11.26倍。

表2 不同濃度6-BA培養(yǎng)東方草莓無菌苗的增殖效果

2.3 不同基本培養(yǎng)基與生長(zhǎng)素種類培養(yǎng)東方草莓的生根情況

從表3看出，當(dāng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物為IBA時(shí)，接種21 d時(shí)，1/2 MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基的東方草莓無根試管苗生根率均達(dá)100%，高于NAA對(duì)根生長(zhǎng)的誘導(dǎo)率；當(dāng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為NAA，誘導(dǎo)生成的根普遍粗且健壯，平均根長(zhǎng)相對(duì)較大，且單株誘導(dǎo)生根數(shù)更多，植株在出瓶練苗時(shí)更易成活；基本培養(yǎng)基為1/2 MS且NAA濃度為0.3 mg/L的培養(yǎng)基其株平均根數(shù)最多，為5.13根/株，平均根長(zhǎng)也最長(zhǎng)，為1.01 cm。

表3 不同基本培養(yǎng)基與生長(zhǎng)素種類培養(yǎng)東方草莓的生根效果

雖然添加生根調(diào)節(jié)劑IBA時(shí)生根率達(dá)100%，但添加NAA生根調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的不定根更粗、更健壯、長(zhǎng)度更長(zhǎng)。另外，觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過30 d時(shí)，添加NAA生根調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基其誘導(dǎo)生根率也達(dá)100%。故此認(rèn)為，誘導(dǎo)東方草莓無根試管苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg/L NAA。

3 討論

野生草莓較現(xiàn)有栽培草莓具有較大優(yōu)勢(shì)，其抗病蟲害、抗逆性更強(qiáng)，可溶性有機(jī)物種類更多，果實(shí)顏色更豐富，果實(shí)香味物質(zhì)種類更多[1-8]。中國作為全球野生草莓的主要發(fā)源地之一，具有豐富的野生草莓資源，要利用好這些資源，就有必要對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的調(diào)查、搜集、整理和研究。野生東方草莓的抗寒性和抗旱性均很強(qiáng)，生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠，果實(shí)顏色深紅，果肉綿軟，香味獨(dú)特，是一種優(yōu)質(zhì)的雜交育種資源，也可以通過染色體加倍、細(xì)胞融合或者轉(zhuǎn)基因等方法進(jìn)行育種，以使該優(yōu)質(zhì)基因源得到充分利用[12-17]。對(duì)野生東方草莓進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，建立其莖尖培養(yǎng)快繁體系，為其后續(xù)通過染色體加倍、細(xì)胞融合或轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行育種等工作奠定基礎(chǔ)，也為其快繁探索道路，對(duì)其野生資源的開發(fā)、利用具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)也為其他草莓屬植物的組培快繁提供借鑒。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，剝?nèi)〉那o尖外植體越小，其褐化率及褐化死亡率越高，相反，剝?nèi)〉那o尖外植體越大，褐化程度越低且越有利于外植體成活，該結(jié)論與王軍利等[3，15-16]的研究結(jié)論一致。由此可見，在草莓屬植物組織培養(yǎng)時(shí)，其外植體切取越小，越容易褐化。6-BA對(duì)東方草莓離體增殖影響的研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度增加，東方草莓離體增殖倍數(shù)增大，但達(dá)到某一峰值后，增殖倍數(shù)開始下降，與王軍利等[3，15]的研究結(jié)論基本一致。在基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素對(duì)東方草莓無根苗生根的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IBA作為添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物，培養(yǎng)21 d時(shí)無根試管苗的生根率達(dá)100%；在添加IBA或NAA生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件下，1/2MS培養(yǎng)基上無根試管苗生根時(shí)間都早于MS培養(yǎng)基，且生根量相對(duì)較大，長(zhǎng)度較長(zhǎng)，與王軍利等[3，15]的研究結(jié)論一致。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，NAA作為生根調(diào)節(jié)劑，所生成的根普遍更粗、更健壯，該結(jié)論與王軍利等[3]在五葉草莓上的研究結(jié)論一致，而與王燕等[15]對(duì)黃毛草莓的研究不一致?？梢姡瑸椴葺畬僦参?，不同的種之間，試驗(yàn)結(jié)果有差異。因此，在構(gòu)建不同植物的組織培養(yǎng)體系時(shí)，應(yīng)針對(duì)具體植物而言，合適的培養(yǎng)基和添加劑應(yīng)通過具體試驗(yàn)來取得和驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過離體莖尖培養(yǎng)，可建立野生東方草莓離體組培快繁體系，進(jìn)而為其離體誘導(dǎo)及離體染色體加倍等育種工作提供前期材料和技術(shù)。野生東方草莓可利用其匍匐莖的莖尖在MS+0.4 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上獲得無菌苗，培養(yǎng)基中添1.0 g/L活性炭(AC)有利于預(yù)防外植體褐化；適合東方草莓快繁的培養(yǎng)基為MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其增殖倍數(shù)為11.26倍；適合其生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg/L NAA，誘導(dǎo)根數(shù)多、根粗、根長(zhǎng)，可獲壯苗。