阻斷PDL1的表達(dá)可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性

文雪

摘要：目的：使用抗PDL1抗體阻斷PDL1/PD1通路，研究負(fù)性共刺激分子PDL1與膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥物抵抗的相關(guān)性及免疫逃逸機(jī)制。方法 分離并活化人外周血淋巴細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)，同時(shí)加入化療藥物，流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果 抗PDL1抗體可以顯著活化淋巴細(xì)胞，同時(shí)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)論 阻斷PDL1/PD1通路可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化并促進(jìn)致敏淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：PDL1;膠質(zhì)瘤;化療藥物

Abstract： Objective To use anti-PDL1 antibody to block the PDL1/PD1 pathway to study the correlation between the negative costimulatory molecule PDL1 and the resistance of glioma cells to chemotherapy drugs and the immune escape mechanism. Methods The mixed culture of human peripheral blood lymphocytes and glioma cells was separated and activated， and chemotherapy drugs were added at the same time. The proliferation of lymphocytes and glioma cells was detected by flow cytometry. Results Anti-PDL1 antibody can significantly activate lymphocytes and promote the apoptosis of glioma cells. Conclusion Blocking the PDL1/PD1 pathway can induce lymphocyte activation and promote the anti-tumor effect mediated by sensitized lymphocytes.

Keywords： PDL1; glioma; chemotherapy drugs

膠質(zhì)瘤占所有原發(fā)性腦腫瘤的 51.4%，是成人中最常見的原發(fā)性腦腫瘤 [1]。然而，采用全手術(shù)切除繼以放療和輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)治療，膠質(zhì)瘤患者的生存率任然較低[2]。膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)局部和全身免疫抑制的能力限制了對腫瘤生長的先天防御和適應(yīng)性免疫療法的功效，因此對新療法的開發(fā)提出了重大挑戰(zhàn)[3]。

程序性細(xì)胞死亡（PD）1受體及其配體（PDL1），可以抑制T淋巴細(xì)胞的活性[4]。在過去的 5 年中，使用 PD1 和 PDL1 單克隆抗體 （mAb） 進(jìn)行免疫治療已產(chǎn)生顯著益處，在多種類型的腫瘤中具有持久的反應(yīng)和可接受的治療相關(guān)毒性。本研究通過分離并活化人外周血淋巴細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)，同時(shí)加入化療藥物，通過體外實(shí)驗(yàn)，探討負(fù)性共刺激分子PDL1在腫瘤逃避免疫攻擊中的作用及其機(jī)制。

1 材料及方法

1.1細(xì)胞及試劑 U251 細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室凍存; DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;胰酶購自Sigma公司;替莫唑胺（TMZ）購自先靈葆雅公司;抗PDL1抗體購自eBioscience公司;ConA購自Sigma公司;CFSE購自Sigma公司;凋亡試劑盒購自羅氏公司;替莫唑胺（TMZ）購自先靈葆雅公司。

1.2 細(xì)胞混合培養(yǎng) 分離并收集人外周血淋巴細(xì)胞，CFSE染色后，加入ConA（20ug/ml） 共孵育。48小時(shí)后，按照10：1的比例將淋巴細(xì)胞與U251 細(xì)胞種植于24孔板進(jìn)行混合培養(yǎng)，分別加入TMZ（50μmol/L）和（或）抗PDL1抗體（30g/ml）共培養(yǎng)6天。分組如下：①淋巴細(xì)胞+ U251 ②淋巴細(xì)胞+ U251+ TMZ ③淋巴細(xì)胞+ U251+ TMZ+抗PDL1抗體。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集上述各組腫瘤細(xì)胞，然后用冰冷的PBS洗滌，按照凋亡試劑盒說明加入染料，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測并分析凋亡結(jié)果。收集上述各組淋巴細(xì)胞，然后用冰冷的PBS洗滌，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測并分析增殖結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS version 12·0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

①淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為6.3±2.4，U251凋亡率為12.8% ±5.3 ②淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為4.1±0.8，U251凋亡率為25.1% ±6.1 ③淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為10.2±3.3，U251凋亡率為45.6% ±4.7。結(jié)果表明，抗PDL1抗體能促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化并促進(jìn)化療藥物的抗瘤效應(yīng)。

3 討論

PDL1 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)，與腫瘤分級相關(guān)，并有助于產(chǎn)生免疫抗性。 PD1/PDL1 通路在膠質(zhì)瘤生物學(xué)中起著重要作用。在膠質(zhì)瘤的免疫治療策略中使用抗 PD1/PDL1 抗體正引起越來越多的關(guān)注。為了提高抗PDL1免疫治療的療效，許多研究都集中在聯(lián)合治療上，包括靶向多種免疫抑制劑、放療、消融、化療等分子靶向治療。本研究利用抗PDL1抗體阻斷PDL1/PD1的同時(shí)聯(lián)合化療藥物，探討PDL1分子對活化淋巴細(xì)胞增殖以及腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果證實(shí)阻斷PDL1的表達(dá)可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

參考文獻(xiàn)：

[1]. Goodenberger ML， Jenkins RB. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 2012;205（12）：613–21.

[2]. Han F， Hu R， Yang H， Liu J， Sui J， Xiang X， Wang F， Chu L， Song S. PTEN gene mutations correlate to poor prognosis in glioma patients： a metaanalysis. Onco Targets Ther. 2016;9：3485–92.

[3]. Gousias K， Markou M， Arzoglou V， Voulgaris S， Vartholomatos G， Kostoula A， Voulgari P， Polyzoidis K， Kyritsis AP. Frequent abnormalities of the immune system in gliomas and correlation with the WHO grading system of malignancy. J Neuroimmunol. 2010;226（1–2）：136–42.

[4]. K?hnke T， Krupka C， Tischer J， Kn?sel T， Subklewe M. Increase of PD-L1 expressing B-precursor ALL cells in a patient resistant to the CD19/CD3-bispecific T cell engager antibody blinatumomab. J Hematol Oncol. 2015;8（1）：111.

基金項(xiàng)目：2020年度湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目（B2020389）