基于TaqMan實時熒光PCR的擬松材線蟲分子鑒定技術(shù)

宋志強，張旭君，康李鵬，王立超，周立峰，陳鳳毛

(1.淳安縣林業(yè)局，浙江淳安 311799；2.南京林業(yè)大學林學院，江蘇南京 210037)

擬松材線蟲Bursaphelenchus mucronatus是松屬Pinus植物的寄生性線蟲，廣泛分布于歐亞大陸[1]。作為松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus的姊妹種，兩者之間的親緣關(guān)系極為接近，個體形態(tài)和生物學特性極為相似，占據(jù)著相同的生態(tài)位，并擁有相同的媒介昆蟲和寄主類群[2]；兩者能夠雜交，產(chǎn)生可育雜交后代，但后代的繁殖能力相對較弱[3－4]。另外，一些擬松材線蟲的蟲株對松樹也具有較強的致病性[5－7]。因此，擬松材線蟲是公認的松材線蟲病病原鑒定最為主要的干擾物種，如何區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲成為限制松材線蟲病病原鑒定準確率的主要因素。

當前，國內(nèi)外對于松材線蟲病病原鑒定大多采用形態(tài)學和分子生物學技術(shù)。形態(tài)學鑒定主要根據(jù)雌性成蟲的尾尖突長短來區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲[8－9]，但由于個體之間存在一定的差異，往往導致沒有豐富種類鑒定經(jīng)驗的檢驗人員難以準確識別[10]。另外，由于取樣量和取樣季節(jié)等因素的影響，從松木樣品中分離出來的線蟲數(shù)量過少或找不到雌性成蟲等情況時有發(fā)生，妨礙了形態(tài)學鑒定。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子技術(shù)已經(jīng)成為松材線蟲物種鑒定的常用輔助手段之一，但由于松材線蟲和擬松材線蟲的親緣關(guān)系十分接近，假陽性現(xiàn)象偶有發(fā)生，錯誤地將擬松材線蟲鑒定為松材線蟲。因此，在研究松材線蟲分子檢測與鑒定技術(shù)的同時，開發(fā)擬松材線蟲分子鑒定技術(shù)，構(gòu)建可疑線蟲雙重檢測的分子鑒定技術(shù)體系，對于提高松材線蟲種類鑒定準確性具有十分重要的意義，同時也能夠為擬松材線蟲本身的系統(tǒng)發(fā)育等基礎(chǔ)生物學研究奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲 供試的30株擬松材線蟲和10株松材線蟲均由南京林業(yè)大學森林保護研究所提供，其寄主和來源詳見表1。將各線蟲株系轉(zhuǎn)接到長滿灰葡萄孢Botrytis cinerea的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5～7 d，待灰葡萄孢菌絲被取食殆盡時，采用貝爾曼漏斗法收集線蟲[11]，備用。將收集到的線蟲移至無菌水的平皿中，靜置10 min后，棄上清，卵因為有粘性留在平皿的底部。在顯微鏡下觀察，用移液槍吸取獲得單個卵或單條線蟲。

表1 供試線蟲的寄主及來源Tab.1 Geographic origins and host species of the nematode isolates

1.2 DNA提取 線蟲樣品用無菌水洗滌3～5次后，分別取40 μL(約1 000條)置于Eppendorf管中，加入 40 μL 線蟲裂解液(125 mmol/L KCl，25 mmol/L Tris－HCl，pH 8.3，3.75 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L DTT，1.125%Tween20，0.025% gelatine)，加入 2 μL 蛋白酶 K(200 mg/mL)，混勻，在65℃水浴中保持45 min，后95℃ 15 min；12 000 r/min離心3 min，取上清液；用 Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Nanochip測定 DNA的濃度，－20℃?zhèn)溆?。對于單條線蟲及單卵則采用10 μL體系的凍融法提取DNA[12]。

1.3 引物與TaqMan探針設(shè)計 從GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下載39種線蟲的核糖體DNA ITS。其中，傘滑刃屬Bursaphelenchus 36 種:B.mucronatus，B.xylophilus，B.hellenicus，B.rainulfi，B.thailandae，B.hofmanni，B.abietinus，B.anamurius，B.antoniae，B.arthuri，B.borealis，B.braaschae，B.clavicauda，B.conicaudatus，B.corneolus，B.eggersi，B.eremus，B.fungivorus，B.gerbera，B.hildegardae，B.hylobianum，B.okinawaensis，B.paracorneolus，B.paraparvispicularis，B.parathailandae，B.pinasteri，B.pinophilus，B.platzeri，B.poligraphi，B.seani，B.sexdentati，B.sinensis，B.tusciae，B.vallesianus，B.willibaldi，B.yongensis；長尾滑刃線蟲屬 Seinura 2種:S.lii和S.wuae；滑刃線蟲屬 Aphelenchoides 1種:A.macronucleatus。采用BioEid軟件(V7.2)對供試線蟲的核糖體DNA ITS進行比對，在堿基差異較多的區(qū)域利用Primer Premier 5軟件設(shè)計擬松材線蟲的引物和TaqMan熒光探針。

1.4 TaqMan探針特異性檢測 驗證擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針的特異性，對30株擬松材線蟲和10株松材線蟲分別進行TaqMan實時熒光PCR。實時熒光PCR儀為ABI SepOnePlus Real-Time PCR System 7500。 反應(yīng)總體積為10 μL，Premix Ex TaqTM(2 ×)5 μL，引物各0.25 μL，探針 0.5 μL，蒸餾水2.5 μL，DNA 模板1.5 μL。 反應(yīng)程序為50 ℃ 2 min；隨后95℃ 15 s，35個循環(huán)；最后60℃ 20 s。

1.5 引物擴增效率分析 分析擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物TaqMan實時熒光PCR的擴增效率，將擬松材線蟲DNA進行10倍法梯度稀釋5個濃度梯度后進行 TaqMan實時熒光 PCR，反應(yīng)體系同1.4，獲得各梯度濃度的循環(huán)數(shù)值(threshold cycle values，Cq)。根據(jù)各梯度濃度及相應(yīng)的Cq值繪制擴增標準曲線，得到線性方程，并通過斜率法計算出引物的擴增效率(Amplification efficiency，E)[13]。

1.6 探針靈敏度檢測 采用1.2方法所提取的單條線蟲和單個卵的DNA進行TaqMan實時熒光PCR，反應(yīng)體系同1.4，分析擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物TaqMan實時熒光PCR，檢測擬松材線蟲的靈敏度。

1.7 統(tǒng)計分析 TaqMan實時熒光PCR反應(yīng)均設(shè)有3個技術(shù)重復(fù)和3個生物學重復(fù)，并設(shè)有1個陰性對照。擴增效率E＝(10－1/S－1) ×100%，S為擴增標準曲線的斜率。相關(guān)系數(shù)(R2)通過擴增標準曲線回歸計算獲得[12]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Microsoft Excel 2007軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針設(shè)計從GeneBank上下載的39種滑刃屬、傘滑刃屬和長尾滑刃線蟲屬線蟲的核糖體DNA ITS，通過多重序列比對，發(fā)現(xiàn)在核糖體DNA ITS2存在較多的差異堿基(表2)。

表2 擬松材線蟲特異性TaqMan實時熒光PCR引物與探針設(shè)計Tab.2 Designing of special TaqMan real-time PCR primers and probe for B.mucronatus

2.2 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針驗證對30株擬松材線蟲和10株松材線蟲分別進行TaqMan實時熒光PCR結(jié)果顯示，擬松材線蟲蟲株均檢測到了Cq值(20.2±0.7)，而松材線蟲蟲株均沒有檢測到Cq值，表明所設(shè)計的擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針具有特異性。

2.3 擬松材線蟲特異性引物擴增效率 對擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物的擴增效率曲線(圖1A)線性回歸分析，得到擴增效率方程y＝－3.43x＋20.91(圖1B)，再根據(jù)斜率計算出擴增效率E＝96%。擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物的擴增效率為90%～105%，表明該引物能夠穩(wěn)定地擴增基因序列。

圖1 擬松材線蟲特異性TaqMan實時熒光PCR引物擴增效率分析Fig.1 Amplification efficiency of the TaqMan real-time PCR for B.mucronatus

2.4 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針靈敏度 所有參與TaqMan實時熒光PCR反應(yīng)的生物學重復(fù)和技術(shù)重復(fù)均得到了穩(wěn)定的Cq值(表3)，說明所設(shè)計的擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針具有較高的靈敏性。

表3 擬松材線蟲TaqMan實時熒光PCR引物與探針靈敏度分析Tab.3 Sensitivity of the TaqMan real-time PCR primers and probe for B.mucronatus

3 結(jié)論與討論

松材線蟲病是世界范圍內(nèi)有歷史記載以來最為嚴重的森林病害，對我國及多個國家的松林帶來巨大破壞，造成極其嚴重的經(jīng)濟和生態(tài)損失。因此，松材線蟲被許多國家列為一級檢疫對象。借助現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，開發(fā)特異性強、靈敏度高的分子檢測和鑒定技術(shù)成為近年來松材線蟲快速檢測技術(shù)研究的前沿和熱點[14]。然而，由于松材線蟲與擬松材線蟲的親緣關(guān)系過于接近，檢測結(jié)果可能會出現(xiàn)一定的假陽性，造成鑒定結(jié)果不準確。本研究瞄準松材線蟲種類鑒定的主要干擾物種擬松材線蟲，基于TaqMan實時熒光PCR技術(shù)開發(fā)出一套可用于擬松材線蟲分子鑒定的特異性引物和探針，結(jié)合已有的松材線蟲分子檢測與鑒定技術(shù)，可以構(gòu)建起可疑線蟲雙重檢測分子鑒定技術(shù)體系，為進一步開發(fā)實用有效的檢測新設(shè)備奠定基礎(chǔ)，在研究思路上具有一定的創(chuàng)新性。研究結(jié)果表明，該技術(shù)靈敏度高，可以實現(xiàn)對單條擬松材線蟲甚至單個卵的檢測和鑒定，對排除擬松材線蟲的干擾和提高松材線蟲種類鑒定的準確性具有十分重要的意義。與此同時，本研究結(jié)果也能夠為深入開展擬松材線蟲本身的系統(tǒng)發(fā)育和進化生物學等基礎(chǔ)理論研究提供堅實的基礎(chǔ)。

隨著分子生物學研究的飛速發(fā)展，多種分子技術(shù)開始應(yīng)用于線蟲的檢測和鑒定。張立海和趙立榮等[15－16]以松材線蟲ITS1區(qū)域上的特異性引物5′－GATGATGCGATTGGTGACT－3′、擬松材線蟲ITS1區(qū)域上的特異性引物5′－TGCGCTGCGTTGAGTCGA－3′為正向引物，以5.8S區(qū)域上的松材線蟲和擬松材線蟲的通用引物5′－CAATTCACTGCGTTCTTC－3′為反向引物進行PCR擴增，結(jié)果松材線蟲擴增的片段長度329 bp，擬松材線蟲擴增的片段長度206 bp，而其他滑刃線蟲與真滑刃線蟲則無擴增產(chǎn)物。陳鳳毛等[17]應(yīng)用隨機擴增多態(tài)性DNA標記(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)篩選出OPC18、OPN18引物組合，在擬松材線蟲株系中擴增出一條970 bp特異性片段，能準確地鑒定擬松材線蟲。Urek等[18]認為限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)可用于區(qū)分多種滑刃屬線蟲和傘滑刃屬線蟲；但陳鳳毛等[19]認為RFLP會產(chǎn)生大量長度相近的酶切片段，導致這種技術(shù)不適合大量樣品的快速檢測和鑒定；而Filipiak等[20－21]進一步證實基于實時熒光PCR技術(shù)可以用于區(qū)分松材線蟲與擬松材線蟲。另外，小亞基(Small subunit，SSU)[22]、大亞基(D2/D3 domain of large subunit，D2/D3 LSU)[23]和線粒體COI基因(Mitochondrial cytochrome oxidase I，mtCOI)[24]等均可被用于線蟲的種類鑒定。本研究基于實時熒光PCR技術(shù)，針對線蟲遺傳多變區(qū)核糖體DNA ITS設(shè)計擬松材線蟲特異性的引物和TaqMan探針組合，該組合經(jīng)驗證具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短等優(yōu)點，能夠為林業(yè)和海關(guān)檢疫提供有力的技術(shù)支撐。