我國新記錄綠潮物種Ulva laetevirens 的比較葉綠體基因組學(xué)研究*

王 靜 王毅超,4 王洪淑 劉 峰① 陳楠生①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 青島 266071; 4. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

綠潮(green tide)在全球范圍內(nèi)頻繁暴發(fā), 歐洲、北美、澳洲和亞洲等海域均有報道。歐洲北亞得里亞海(Runcaet al, 1996)、波羅的海(B?cket al, 2000)、德國瓦登海(Kolbeet al, 1995)等, 美國羅得島州(Guidoneet al, 2013)、華盛頓州(Nelsonet al, 2003),亞洲中國(Liuet al, 2013)、日本(Shimadaet al, 2003)、菲律賓(Largoet al, 2004)等國的海域, 均發(fā)生過大規(guī)模的綠潮事件。近些年, 全球范圍內(nèi)綠潮呈現(xiàn)出常態(tài)化的暴發(fā)趨勢, 對經(jīng)濟(jì)和社會活動造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響, 對致災(zāi)海域的生態(tài)環(huán)境、群落結(jié)構(gòu)、生物多樣性以及水產(chǎn)養(yǎng)殖也造成極大的破壞性影響(Lyonset al, 2014; Liuet al, 2020)。綠潮暴發(fā)的原因種主要包括綠藻門石莼科的石莼屬(Ulva)(Smetaceket al,2013)、硬毛藻屬(Chaetomorpha)(De Paula Silvaet al,2008)和剛毛藻屬(Cladophora)(De Paula Silvaet al,2013), 其中石莼屬綠藻占主要部分(Fletcher, 1996;Smetaceket al, 2013; Fortet al, 2020)。石莼屬綠潮物種中, 部分物種能夠形成跨境侵襲的大規(guī)模綠潮災(zāi)害, 譬如中國黃海綠潮; 部分僅在局部海域暴發(fā), 譬如美國納拉甘塞特海灣連年發(fā)生的扁滸苔(Ulva compressa)-硬石莼(U. rigida)綠潮(Guidoneet al,2013)、韓國濟(jì)州島東海岸綠潮(Leeet al, 2019), 以及我國渤海自2015 年連續(xù)暴發(fā)的滸苔綠潮(Songet al,2019)。我國黃海滸苔綠潮在2007 年暴發(fā)之前, 滸苔物種或綠潮事件在我國并未引起廣泛關(guān)注, 暴發(fā)之后投入大量的科研工作致力于滸苔綠潮的相關(guān)研究,這恰恰警示我們對潛在的綠潮物種和局地規(guī)模的綠潮事件應(yīng)給予高度關(guān)注。調(diào)查和了解石莼屬綠潮物種生物地理分布和局地規(guī)模的綠潮事件是預(yù)防和監(jiān)測大規(guī)模綠潮暴發(fā)的首要工作之一。

我國在局地綠潮方面的研究報道相對較少。馬元慶等(2010)報道了2007 年煙臺金沙灘海域石莼(U.lactuca)綠潮事件相關(guān)的理化條件; Song 等(2019)研究發(fā)現(xiàn)秦皇島海域自2015 年連年暴發(fā)的綠潮原因種是羽藻(Bryopsis plumosa)和滸苔(U. prolifera), 經(jīng)巡航觀測和對沿岸定生樣本的分子標(biāo)記rbcL分析發(fā)現(xiàn),這兩個原因種只在海草床中被發(fā)現(xiàn), 最終確定海草床中的羽藻和滸苔是渤海綠潮的原因種?？傮w而言,我國在局地綠潮的相關(guān)研究工作正處于起步階段。

我國海域石莼屬物種的記錄自20 世紀(jì)60 年代由曾呈奎等生態(tài)學(xué)前輩系統(tǒng)整理開始, 一直處于不斷地補充和修正中。1963 年董美齡(1963)報道我國海域的“滸苔屬”(Enteromorpha)綠藻有11 個種。2015年丁蘭平等(2015)整理的中國海洋綠藻門新分類系統(tǒng)中“滸苔屬”有10 個種, “石莼屬”有14 個種。2020年Xie 等(2020)報道了我國海域的6 個新記錄物種U.simplex、U. splitiana、U. partita、U. meridionalis、U. tepida和U. chaugulli, 后三者為綠潮物種。此外,還有一株淡水石莼物種U. shanxiensis(Chenet al,2015) 和一株滸苔亞種U. proliferasubsp.Qingdaoensis(Cuiet al, 2018)被鑒定。這說明我國海域可能還有更多的石莼屬物種(包括石莼屬綠潮物種)有待發(fā)現(xiàn)。由于石莼屬部分近緣物種種間形態(tài)十分相近, 并且具有形態(tài)可塑性, 基于形態(tài)進(jìn)行石莼屬物種鑒定難度較大。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展, 分子標(biāo)記的開發(fā)和利用對石莼屬物種的鑒定起了重要的推動作用(Haydenet al, 2003)。目前, 應(yīng)用于石莼屬物種鑒定的通用單基因分子標(biāo)記是ITS、rbcL和tufA(Garyet al, 2010; Mudassaret al, 2016; Cuiet al, 2018)。然而,盡管這些通用分子標(biāo)記使用廣泛, 但是由于它們的分辨率比較有限, 在部分情況下無法做到準(zhǔn)確定種。相對單基因分子標(biāo)記, 細(xì)胞器基因組可以作為串聯(lián)基因標(biāo)記提供更可靠的分類依據(jù)。

本研究針對2020 年11 月初煙臺第一海水浴場局地綠潮事件, 采用分子標(biāo)記和葉綠體基因組比較分析對此次綠潮事件的原因種進(jìn)行物種鑒定和分析,確定該局地綠潮原因種為U. laetevirens, 系該物種在我國海域的首次綠潮記錄。同時, 探索了三者之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

2020 年11 月2 日于山東省煙臺市第一海水浴場的石莼綠潮事件(121°24′59″E, 37°32′6″N, 圖1a)中隨機(jī)采集了11 株石莼屬綠藻, 分別編號CNS00533、CNS00592—CNS00601?，F(xiàn)場采集的藻體置于內(nèi)含無菌海水的離心管, 無菌海水中含有f/2 培養(yǎng)基、0.5‰GeO2、50 μg/mL 敵百蟲和五種復(fù)合抗生素(50 μg/mL鏈霉素, 66.6 μg/mL 慶大霉素, 20 μg/mL 環(huán)丙殺星,2.2 μg/mL 氯霉素, 100 μg/mL 氨芐青霉素)(Shiblet al,2020)。采樣后低溫保存, 24 h 內(nèi)運輸回實驗室。藻體樣本到達(dá)實驗室后, 立即用無菌海水沖洗藻體表面。最后, 將藻體置于含有30 mL 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中, 內(nèi)含f/2 培養(yǎng)基、0.5‰ GeO2、50 μg/mL 敵百蟲和上述五種復(fù)合抗生素, 置于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng), 培養(yǎng)條件18 °C, 100—120 μmol photons/(m2·s), L:D = 12 h:12 h。待鏡檢無其他微藻、浮游動物等雜質(zhì), 即可用于后續(xù)實驗。

1.2 DNA 文庫制備與測序

藻體DNA 采用植物基因組DNA 提取試劑盒(DP305, 北京天根)進(jìn)行提取, 所提取的 DNA 經(jīng)Covaris S220 超聲破碎儀進(jìn)行片段化, 獲得讀長為350 bp 的DNA 序列; 經(jīng)末端修復(fù)、加A 尾、加測序接頭、純化、PCR 及產(chǎn)物富集。文庫質(zhì)量分別采用NGS3K/Caliper 和 real-time PCR (Qubit 3.0 fluorometer, 美國Invitrogen)進(jìn)行文庫大小分布評估和定量分析。質(zhì)量合格的文庫采用美國 Illumina NovaSeq PE150 (北京諾禾致源科技股份有限公司)進(jìn)行測序。

1.3 分子標(biāo)記tufA 的序列獲取及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

煙臺綠潮11 個藻體樣本的分子標(biāo)記tufA序列信息通過軟件BWA v0.7.17 (Liet al, 2010)、samtools v1.9 (Liet al, 2009)和SPAdes v3.14.0 (Bankevichet al,2012)從上述全基因組測序數(shù)據(jù)中篩選組裝獲得, 所采用的參考序列來自于U. laetevirens葉綠體基因組MT179351 注釋的tufA基因全長序列。將11 個樣品和來自GenBank 的tufA序列通過Clustal W 進(jìn)行多重比對分析(Thompsonet al, 1997), 并輔以手工校正。通過Mega 7.0 軟件的最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(Kumaret al, 2016)。Bootstrap 值為1 000。

1.4 葉綠體基因組組裝與注釋

采用GetOrganelle 軟件(Jinet al, 2020)從頭組裝獲得葉綠體基因組序列, 其中使用的組裝軟件為SPAdes (3.10.1)(Bankevichet al, 2012), 分析過程中使用的seed 參考序列為NCBI 登錄序列MT179351(Ulva rigida葉綠體基因組)(Fortet al, 2021)。組裝后的葉綠體基因組序列通過BWA v0.7.17 軟件的MEM運算法對所構(gòu)建的葉綠體基因組序列進(jìn)行質(zhì)檢(Liet al, 2010), 并通過IGV v2.8.12 進(jìn)行可視化比對分析(Robinsonet al, 2011)。本研究采用在線軟件MFannot(https://megasun.bch.umontreal.ca/RNAweasel/)和ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)對葉綠體基因組進(jìn)行注釋。

1.5 共線性分析

將CNS00533 分別與U. laetevirensMT179351、U. rigidaMT179352 和U. australisMT179348 進(jìn)行共線性分析, 采用circos-0.69 進(jìn)行作圖(Krzywinskiet al, 2009)。

1.6 遺傳進(jìn)化分析

對19 株石莼屬綠藻葉綠體基因組的71 個蛋白編碼基因的氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。氨基酸序列采用MAFFT(默認(rèn)參數(shù))比對(Katohet al, 2013), 然后通過PhyloSuite 進(jìn)行串聯(lián)(Smithet al, 2008), 以基因的位置對串聯(lián)后的序列進(jìn)行分區(qū), 每個分區(qū)的最適氨基酸替代模型通過 ModelFinder 確定(Kalyaanamoorthyet al, 2017), 以IQ-TREE(默認(rèn)參數(shù))構(gòu)建基于氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹(Trifinopouloset al, 2016), bootstrap 值設(shè)置為1 000。硅藻Lithodesmium undulatum(KC509525)和Odontella sinensis(Z67753)的葉綠體基因組作為外類群。

2 結(jié)果

2.1 2020 年11 月煙臺局地綠潮原因種的鑒定

2020 年11 月2 日于山東省煙臺市第一海水浴場暴發(fā)了局地綠潮, 浴場沿岸水體充斥綠色藻體碎片,在海浪的作用下大量的藻體積留海灘(圖1b)。該綠藻藻體呈葉片狀, 多孔、雙層基質(zhì); 因藻體破碎無法辨別不同部位且未見假根, 難以從形態(tài)水平鑒別物種(Maoet al, 2014)(圖1c)。

為鑒定此次煙臺綠潮物種, 隨機(jī)采集了12 株藻體樣本, 對其構(gòu)建了基于tufA的單基因遺傳進(jìn)化樹(圖 1d)。結(jié)果顯示, 其中 11 株 CNS00533、CNS00592—CNS00601 序列完全一致, 且與U. rigida和U. laetevirens的參考序列聚類在一個clade 中; 在NCBI 數(shù)據(jù)庫中, 11 株藻的tufA全長序列(1 224 bp)與U. laetevirens(MT179351)(Fortet al, 2021)的tufA序列(1 224 bp) 100%相同。另外1 株CNS00602 與U.australis參考序列聚類在一個 clade 中, 且與U.australisMT160640 (Fortet al, 2021)完全一致。綜上所述, 除CNS00602 株系以外的11 株可以初步鑒定為同一物種——U. laetevirens, 在煙臺綠潮的物種組成中占絕對優(yōu)勢, 是造成此次局地綠潮的原因種; 而CNS00602 可以初步鑒定為U. australis。

圖1 煙臺局地綠潮及其致災(zāi)物種的形態(tài)和分子鑒定Fig.1 A green tide in Yantai coast and the morphological and molecular analysis of the causative species

2.2 煙臺綠潮物種U. laetevirens CNS00533 葉綠體基因組特征

相較于單基因分子標(biāo)記, 集合多基因的葉綠體基因組信息可能提供更高的分辨率, 能夠更準(zhǔn)確地反映煙臺綠潮原因種的分類地位, 進(jìn)一步確定U.laetevirens、U. rigida以及U. australis的遺傳進(jìn)化關(guān)系。為此, 本研究構(gòu)建并深入解析了煙臺綠潮物種的葉綠體基因組。本研究共完成了4 個株系CNS00533、CNS00392、CNS00396 和CNS00398 葉綠體基因組的組裝, 4 個葉綠體基因組堿基組成完全一致。以CNS00533 葉綠體基因組(圖2)為參考, 比較分析了11 個株系之間的遺傳多樣性, 僅發(fā)現(xiàn)一個單堿基變異位點, 進(jìn)一步表明從煙臺綠潮中分離得到的這11個株系是同一個株系克隆繁殖的結(jié)果。后續(xù)分析僅以CNS00533 為代表。

圖2 煙臺綠潮物種U. laetevirens CNS00533 葉綠體基因組Fig.2 The chloroplast genome of U. laetevirens CNS00533 in the local green tide in Yantai

CNS00533 的葉綠體基因組為110 889 bp, 與U.laetevirens(MT179351, 103 444 bp)、U. rigida(MT179352, 96 673 bp)和U. australis(MT179348,99 820 bp)三個葉綠體基因組相比略長(表 1)。CNS00533 葉綠體基因組的AT 含量與U. laetevirens(MT179351)比較相近, 74.4%—74.6%, 比U. australis與U. rigida的AT 含量(分別為74.8%和75.4%)略低。四個葉綠體基因組共有71 個蛋白編碼基因、3 個rRNA 基因(rrl、rrs和rrn5)和26 個tRNA 基因。CNS00533 與U. laetevirens(MT179351)的葉綠體基因組的tRNA 基因完全相同, 它們比U. australis多了一個tRNA 基因trnF(aaa)。同時,U. rigida相比其他三個葉綠體基因組多了一個trnR(ucu)?？傮w而言,CNS00533 與U. laetevirens(MT179351)的葉綠體基因組的基因組成完全一致, 進(jìn)一步支持上述對CNS00533的物種鑒定。

表1 煙臺綠潮物種U. laetevirens CNS00533 與近緣物種U. laetevirens(MT179351)、U. rigida(MT179352)、U.australis(MT179348)的葉綠體基因組特征Tab.1 Characteristics of chloroplast genomes of U. laetevirens CNS00533 (MW531676), U. laetevirens (MT179351), U. rigida(MT179352) and U. australis (MT179348)

2.3 煙臺綠潮物種U. laetevirens CNS00533 葉綠體基因組共線性分析

為比較分析CNS00533 與其他3 個近緣物種葉綠體基因組的相似度, 本研究將煙臺U. laetevirens株系CNS00533 (MW531676)分別與U. laetevirens(MT179351)、U. rigida(MT179352)、U. australis(MT179348)進(jìn)行基因組共線性分析(圖3)。結(jié)果顯示,CNS00533 與U. laetevirens(MT179351)的葉綠體基因組基因數(shù)目和基因排列順序完全一致(圖 3a)。CNS00533 與U. rigida的葉綠體基因組相比,trnR基因為U. rigida的葉綠體基因組特有(圖 3b)。CNS00533 與U. australis的葉綠體基因組存在顯著的差異, 二者之間存在一個包括45 個基因的基因組反轉(zhuǎn)(inversion)事件(圖3c)。同時, 相比于U. australis的葉綠體基因組, CNS00533 還多一個基因trnF(aaa)。因此, 共線性分析也支持CNS00533 作為U.laetevirens的鑒定。

圖3 U. laetevirens CNS00533 ( MW531676)與U. laetevirens (MT179351)(a)、U. rigida (MT179352)(b)、U. australis(MT179348)(c)葉綠體基因組共線性分析Fig.3 Synteny analysis of chloroplast genomes of U. laetevirens CNS00533 MW531676 vs. U. laetevirens MT179351 (a), U.laetevirens CNS00533 MW531676 vs. U. rigida MT179352 (b), and U. laetevirens CNS00533 MW531676 vs. U. australis MT179348 (c)

2.4 煙臺綠潮物種U. laetevirens CNS00533 的進(jìn)化分析

為了探究煙臺綠潮物種U. laetevirensCNS00533的遺傳進(jìn)化關(guān)系, 本研究針對已發(fā)表的19 株石莼綠藻和CNS00533 的葉綠體基因組, 構(gòu)建了基于蛋白質(zhì)編碼基因氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示,石莼屬物種聚類為 4 個大的 clade, 分別是Ulva lactuca-ohnoi-laetevirens-rigida-gigantea、Ulva linzaprolifera-flexuosa、Ulva australis-fenestratapseudorotundata和Ulva compressa。煙臺綠潮原因種CNS00533 聚類到Ulva lactuca-ohnoi-laetevirensrigida-gigantea, 且與U. laetevirens遺傳進(jìn)化距離更近。同時, 該結(jié)果也表明U. laetevirens與Ulva australis遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn), 不是同一物種, 與Hughey 等(2021)的結(jié)論相反。

圖4 針對U. laetevirens CNS00533 和其他石莼屬葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree based on concatenated amino acid sequences of chloroplast protein-coding genes of U. laetevirens CNS00533 and other Ulva species.

2.5 煙臺綠潮物種U. laetevirens CNS00533 與近緣物種大片段差異序列和內(nèi)含子組成分析

上述關(guān)于分子標(biāo)記(tufA)、基因組成、共線性分析和遺傳進(jìn)化關(guān)系等多方面的分析表明CNS00533 是U. laetevirens的一個株系。比較分析CNS00533 和U. laetevirens(MT179351)的葉綠體基因組DNA 序列發(fā)現(xiàn), 相較于U. laetevirensMT179351, CNS00533 葉綠體基因組(MW531676)多出6 個較長的插入序列(表2, 序號1—6), 長度范圍1—2 kb。這6 個插入序列分別對應(yīng)6 個完整的內(nèi)含子(表3, 5 個I 型和1 個II 型內(nèi)含子)。比較分析CNS00533 和U. rigida(MT179352)的葉綠體基因組發(fā)現(xiàn), CNS00533 葉綠體基因組多了10 個插入序列(表2)。其中1—6 號插入序列與上面的6 個插入序列相同, 其他4 個插入序列分別是基因組atpB、rrl基因內(nèi)的1 個II 型和1 個I 型內(nèi)含子。為了驗證不同物種間非插入序列的相似性, 本研究分析發(fā)現(xiàn) CNS00533 MW531676 與U. laetevirensMT179351 插入序列之外的序列相似性達(dá)到99.8%。與此相比, CNS00533 MW531676 與U. rigidaMT179352 的DNA 序列相似性只有93.1%。

表2 煙臺綠潮物種U. laetevirens CNS00533 葉綠體基因組中相比于U. laetevirens MT179351 和U. rigida MT179352 的大片段插入序列統(tǒng)計Tab.2 The long sequences in the chloroplast genome of U. laetevirens CNS00533 but not in U. laetevirens MT179351 or U. rigida MT179352

本研究進(jìn)一步統(tǒng)計分析了U. l a e t e v i re n sCNS00533、U. laetevirens(MT179351)和U. rigida(MT179352)葉綠體基因組內(nèi)含子的分布情況(表3)。結(jié)果顯示,U. rigida(MT179352)只有1 個I 型內(nèi)含子,位于其rrl基因內(nèi);U. laetevirens(MT179351)有1 個位于atpB基因內(nèi)的II 型內(nèi)含子和2 個位于rrl基因內(nèi)的I 型內(nèi)含子; 相對而言, CNS00533 含有7 個I 型內(nèi)含子(位于psbD、psbC、psbB和rrl基因內(nèi))和2 個II型內(nèi)含子(位于atpB基因內(nèi)), 遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于前兩者。

表3 煙臺綠潮物種U. laetevirens CNS00533、U. laetevirens (MT179351)和U. rigida (MT179352)葉綠體基因組內(nèi)含子分布情況Tab.3 The intron contents in chloroplast genomes of U. laetevirens CNS00533, U. laetevirens (MT179351) and U. rigida (MT179352)

綜上, CNS00533 與U. rigida(MT179352)葉綠體基因組的差異體現(xiàn)在內(nèi)含子組成和基因編碼區(qū), 差異較大; 而CNS00533 與U. laetevirens(MT179351)葉綠體基因組基因編碼區(qū)差異較小, 內(nèi)含子組成是其種內(nèi)差異的主要方面。

3 討論

3.1 U. laetevirens 的形態(tài)和分子鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)報道,U. laetevirens具有掌狀葉片、淺裂、不規(guī)則分叉、不規(guī)則的邊緣突起和二層細(xì)胞基質(zhì)等等, 這些形態(tài)特征與其他石莼屬葉狀藻體有不同程度的相似性, 特別是與其近緣的U. rigida極易混淆(Steinhagenet al, 2019b)。Sfriso 發(fā)現(xiàn)U. rigida的根狀體細(xì)胞相比U. laetevirens更厚、更暗(Sfriso, 2010)。Sfriso (2010)的研究還發(fā)現(xiàn)U. laetevirens的假根和基部邊緣沒有突起。此外, 石莼屬物種具有形態(tài)可塑性,不同的營養(yǎng)環(huán)境、光照以及共附生菌均會影響其形態(tài)(Tayloret al, 2001; Fuet al, 2008)?？傮w而言, 僅僅基于形態(tài)學(xué)的描述, 難以實現(xiàn)對包括U. laetevirens在內(nèi)的石莼屬物種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。

分子學(xué)方法已成為物種分類的一個有效手段,可以在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上, 更加準(zhǔn)確地鑒定石莼屬物種。但是, 分子學(xué)方法的準(zhǔn)確鑒定仍然依賴于分子標(biāo)記的選擇。在已報道的研究中,U. laetevirens、U. rigida和U. australis分類存在爭議。Batista 等(2018)基于分子標(biāo)記 ITS 和rbcL的分析結(jié)果認(rèn)為U.laetevirens和U. rigida區(qū)分不開。Steinhagen 等(2019b)甚至基于此在其研究中將U. laetevirens和U. rigida作為同一物種。Hughey 等(2021)根據(jù)分子標(biāo)記rbcL分析結(jié)果確定U. laetevirens與U. australis為同一物種。Lee 等(2019)在分析韓國濟(jì)州島的樣品時, 盡管采用tufA和rbcL聯(lián)合建樹分析, 但由于其參考序列中沒有U. rigida相關(guān)序列作為參考, 所以分析結(jié)果并沒有說明其建樹方式能有效區(qū)分U. laetevirens和U. rigida。Fort 等(2021)的研究中對歐洲海域采集的110 株葉狀石莼進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析, 結(jié)果明確聚類為6 個clade, 基于分子標(biāo)記ITS 和rbcL的結(jié)果, 6 個SNP-clade分別對應(yīng)6 個物種, 其中包括U. laetevirens和U. rigida, 其后續(xù)研究均視U. laetevirens和U.rigida為兩個物種, 且細(xì)胞器基因組均顯示二者種間差異極大, 種內(nèi)差異極小。

此外, Fort 等(2021)比較了tufA、rbcL的單基因進(jìn)化樹以及線粒體、葉綠體的全部蛋白編碼序列的進(jìn)化樹, 結(jié)果顯示這四種方式的分類效果基本一致,tufA的bootstrap 支持率相對高于rbcL, 認(rèn)為單分子標(biāo)記tufA足以區(qū)分葉狀石莼屬物種。本研究為了鑒定煙臺株系CNS00533, 對其tufA進(jìn)行分析, 結(jié)果(圖1d)顯示CNS00533 與U. laetevirens和U. rigida的參考序列聚類在一個clade 中, NCBI 比對發(fā)現(xiàn)僅與U.laetevirens(MT179351)(Fortet al, 2021)的tufA序列(1 224 bp) 100%一致。另外, 根據(jù)石莼屬屬內(nèi)物種的葉綠體基因組蛋白編碼基因的進(jìn)化樹(圖4), CNS00533與U. laetevirens有更近的遺傳進(jìn)化關(guān)系。此外, 為了排除葉綠體基因組中可能的插入序列的影響, 本研究剔除了CNS00533 與U. laetevirens(MT179351)、U. rigida(MT179352)參考葉綠體基因組彼此間的長片段插入序列后發(fā)現(xiàn), CNS00533 與U. laetevirens相似度達(dá)到99.8%, 與U. rigida相似度只有93.1%。Fort等(2021)在進(jìn)行6 個石莼屬物種種間、種內(nèi)葉綠體基因組多樣性分析時, 發(fā)現(xiàn)種間蛋白編碼區(qū)單核苷酸變異(single nucleotide variant, SNV)位點至少391 個,而U. laetevirens種內(nèi)只有36 個SNV 位點。本研究比較分析了CNS00533 與愛爾蘭U. laetevirens的葉綠體基因組全序列, 發(fā)現(xiàn)僅有51 個SNV 位點, 進(jìn)一步說明二者為種內(nèi)差異。以上分子標(biāo)記、葉綠體蛋白編碼基因遺傳進(jìn)化分析和全序列比對的結(jié)果, 均表明煙臺株系CNS00533 為U. laetevirens。

3.2 U. laetevirens 煙臺株系與愛爾蘭株系間的異同

同一物種的不同株系之間可能存在遺傳變異,包括大尺度的遺傳變異。截至目前已公布的記錄中,僅有愛爾蘭海域和中國煙臺海域的U. laetevirens株系的葉綠體基因組[MT179351 (Fortet al, 2021)和MW531676]被構(gòu)建和解析。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn), 二者的葉綠體基因組的基因種類、數(shù)量和排列順序完全一致, 包括71 個蛋白編碼基因、27 個tRNA 基因和3 個rRNA基因基因(圖2, 3)。Fort 等(2021)的研究結(jié)果顯示歐洲海域U. laetevirens種內(nèi)差異極低, 主要體現(xiàn)在種內(nèi)僅0.6 SNVs/kb 編碼序列。本研究的結(jié)果顯示煙臺株系與愛爾蘭株系之間SNV 也極低。同時, 煙臺株系的葉綠體基因組比愛爾蘭株系長7 445 bp, 這個長度差異在于二者內(nèi)含子的組成差異, 前者比后者多了6 個完整的內(nèi)含子序列(表2, 3)。種內(nèi)內(nèi)含子差異顯著的現(xiàn)象并不例外, 本研究在整理NCBI 數(shù)據(jù)庫的所有石莼屬物種內(nèi)含子分布情況時發(fā)現(xiàn),U. compressa不同株系的葉綠體基因組中內(nèi)含子相差較大, MK069584[U. mutabilis更名為U. compressa(Steinhagenet al,2019a)]含有10 個內(nèi)含子, 而KX595275 只有4 個內(nèi)含子。 另外, 在已報道的兩株Metschnikowia santaceciliae線粒體中, 二者之間僅cob基因含有的內(nèi)含子個數(shù)就相差6 個(Leeet al, 2020)。對于U.laetevirens煙臺株系和愛爾蘭株系間的內(nèi)含子差異,可能是不同地理環(huán)境壓力下自然選擇的結(jié)果。

3.3 U. laetevirens 是我國新記錄石莼屬(綠潮)物種

截至2021 年1 月, 根據(jù)已有記載信息, 我國海域共記錄29 個石莼屬物種(丁蘭平等, 2015; Xieet al,2020), 其中11 個物種已在全球有引發(fā)綠潮的報道,包括U. australis、U. chaugulli、Ulva clathrata、U.compress、U. flexuosa、U. intestinalis、U. linza、U.meridionalis、U. prolifera、Ulva ridiga、U. tepida(Guidoneet al, 2013; Smetaceket al, 2013; Gaoet al,2018; Golubkovet al, 2018; Xieet al, 2020)。本研究報道的煙臺U. laetevirens是我國綠潮事件中該物種的首次記錄。該物種于1854 年在澳大利亞維多利亞的菲利普港首次采集并記錄, 現(xiàn)已在北美長島灣、加拿大、愛爾蘭、法國、荷蘭、葡萄牙、突尼斯和韓國均有采集記錄(Kirkendaleet al, 2013; Maoet al, 2014;Miladiet al, 2018; Leeet al, 2019; Fortet al, 2021)。此外, 本研究發(fā)現(xiàn)在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中U. laetevirensCNS00533 的ITS 序列與我國研究者M(jìn)iao 等提交的8個標(biāo)記“Ulvasp.”的ITS 序列(KY446828 等, 未發(fā)表)一致, 說明該物種在我國其他地區(qū)也有分布。U.laetevirens在澳洲、美洲、歐洲和亞洲海域均已有綠潮暴發(fā)記錄, 該物種快速增殖和分布廣泛的特征需要我們持續(xù)關(guān)注和監(jiān)管。

4 結(jié)論

本研究聚焦了2020 年11 月初在煙臺第一海水浴場發(fā)生的綠潮事件, 通過比較葉綠體基因組學(xué)分析證明該石莼屬綠藻為U. laetevirens, 該物種在我國海域尚屬首次記錄。本研究構(gòu)建了煙臺株系U.laetevirensCNS00533 的葉綠體基因組(MW531676),相比于愛爾蘭株系U. laetevirens(MT179351)二者之間蛋白編碼基因、tRNA 基因和rRNA 基因的種類和數(shù)目一致, 僅有51 個SNV 位點, 序列組成差異在于煙臺株系的葉綠體基因組的4 個基因psbD、psbC、psbB和atpB中共多了6 個內(nèi)含子。U. laetevirens煙臺株系與愛爾蘭株系可能存在其他潛在的差異, 包括核基因組和線粒體基因組的組成差異等, 這些需要進(jìn)一步解析以期為理解我國U. laetevirens綠潮暴發(fā)機(jī)制提供分子理論支持。對我們海域石莼屬綠潮物種(包括新記錄種)的全面調(diào)查和生物地理分布研究,將是對我國石莼綠潮實施有效監(jiān)管和可靠預(yù)測的必要工作之一。