自然殺傷細(xì)胞的殺傷功能與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)的相關(guān)性研究

賴瀚鈴 劉 爽 黃新芳 蔣更如

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因不明的多系統(tǒng)受損的慢性自身免疫性疾病，其臨床癥狀為患者感輕度疲勞和關(guān)節(jié)痛，或嚴(yán)重威脅生命的器官損害[1]。既往研究認(rèn)為，T、B淋巴細(xì)胞異常是SLE發(fā)生、發(fā)展的核心機(jī)制。后續(xù)多項(xiàng)研究[2-3]結(jié)果表明，固有免疫細(xì)胞在驅(qū)動(dòng)SLE自身免疫應(yīng)答和組織損傷中發(fā)揮重要作用。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)是固有免疫系統(tǒng)中至關(guān)重要的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，并在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。NK細(xì)胞的殺傷功能可在維持機(jī)體有效免疫力與防止過(guò)度炎癥或保持自我耐受性之間達(dá)到關(guān)鍵平衡，在免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的保護(hù)和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮動(dòng)態(tài)作用[4-7]。NK細(xì)胞的殺傷功能主要是通過(guò)其產(chǎn)生的溶菌顆粒、TNF超家族成員[如TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)與其受體(TRAILR)結(jié)合)]誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，以及其細(xì)胞表面的CD16(FcγR ⅢA)與包被抗體的靶細(xì)胞結(jié)合后介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞調(diào)控的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)[8]。本研究旨在探討SLE患者外周血NK細(xì)胞殺傷能力變化與疾病活動(dòng)的相關(guān)性，為SLE的診療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象與觀察指標(biāo) 本研究回顧性分析上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腎臟風(fēng)濕免疫科于2019年1月—2021年1月收治的35例SLE患者的病歷資料。納入患者的臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)完整，符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)于1997年修訂的SLE診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)[9],相關(guān)患者納入SLE組。根據(jù)SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)[10]對(duì)患者疾病活動(dòng)程度進(jìn)行評(píng)分，≥5分為活動(dòng)性SLE(活動(dòng)亞組)，<5分為非活動(dòng)性SLE(非活動(dòng)亞組)；并根據(jù)患者臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，將SLE組分為感染SLE亞組和非感染SLE亞組。選擇同期排除自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、慢性基礎(chǔ)疾病，以及未接受免疫抑制治療等個(gè)人史和家族史的20名行體格檢查的健康者納入對(duì)照組。該研究符合2013年制訂的《赫爾辛基宣言》的要求。研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。收集受試者的臨床資料，觀察血常規(guī)、尿常規(guī)、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、抗雙鏈-DNA抗體、炎癥因子等指標(biāo)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離 清晨空腹時(shí)，使用EDTA-K2抗凝管采集SLE組與對(duì)照組外周血2 mL。使用淋巴細(xì)胞分離液對(duì)收集的外周血進(jìn)行密度梯度離心，分離出人PBMC。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞系(獲贈(zèng)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))是不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC Ⅰ)類分子的高度未分化人慢性髓系白血病細(xì)胞系。采用含10%胎牛血清的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培養(yǎng)基，以及37 ℃含體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)K562細(xì)胞系。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)

1.2.3.1 外周血NK細(xì)胞比例及其受體檢測(cè) 使用1×PBS重懸人PBMC，并加入小鼠抗人CD3異硫氰酸熒光素(FITC)抗體(美國(guó)賽默飛，貨號(hào)為11-0037-42)、小鼠抗人CD56藻紅蛋白(PE)-Cyanine5.5抗體(美國(guó)賽默飛，貨號(hào)為35-0567-42)、小鼠抗人CD16別藻藍(lán)蛋白(APC)抗體(美國(guó)賽默飛，貨號(hào)為17-0168-42)、小鼠抗人TRAIL PE抗體(美國(guó)賽默飛，貨號(hào)為12-9927-42)，避光置于冰上30 min后對(duì)人PBMC進(jìn)行染色，應(yīng)用流式儀檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3.2 CD107a+NK細(xì)胞比例檢測(cè) 基于流式細(xì)胞術(shù)的CD107a抗體染色法[11]，首先從外周血樣本中分離純化人PBMC，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將PBMC濃度調(diào)整為5×106/mL，并與濃度為5×104/mL的作為靶細(xì)胞的K562細(xì)胞系以效與靶標(biāo)比為10∶1的比例混合培養(yǎng)于U型底96孔板中，并按1∶50的比例加入小鼠抗人CD107a PE-Cyanine7進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為0.05，培養(yǎng)時(shí)間為1 h。隨后將含布雷菲德菌素A(BFA)和莫能菌素(GolgiStop)混合物的預(yù)混液加入U(xiǎn)型底96孔板中，在培養(yǎng)箱中孵育5 h用于檢測(cè)細(xì)胞脫顆粒情況。所有細(xì)胞使用1×PBS重懸后，與小鼠抗人CD3 FITC、小鼠抗人CD56 PE-Cyanine5.5、小鼠抗人CD16 APC抗體置于冰上共孵育30 min，以1×PBS洗滌2次后，使用1%多聚甲醛重懸，應(yīng)用流式儀檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 SLE組男4例、女31例，平均年齡為39歲(年齡范圍13～76歲)；將22例活動(dòng)性SLE患者納入活動(dòng)亞組，13例非活動(dòng)性SLE患者納入非活動(dòng)亞組，其中5例患者在治療過(guò)程中收集了2次樣本。對(duì)照組男1例、女19例，平均年齡為39歲(年齡范圍24～62歲)。對(duì)照組與SLE組性別構(gòu)成和年齡分布的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

2.2 SLE活動(dòng)與非活動(dòng)患者的一般資料比較 SLE活動(dòng)亞組患者SLEDAI評(píng)分、抗雙鏈DNA抗體水平和24 h尿蛋白定量均顯著高于非活動(dòng)亞組(P值均<0.05)。兩組間患者的性別構(gòu)成、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、血小板計(jì)數(shù)、ESR、補(bǔ)體C3和C4水平，以及不同臨床表現(xiàn)患者的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 SLE活動(dòng)亞組與非活動(dòng)亞組基本資料和臨床特征的比較

2.3 SLE患者外周血表達(dá)不同類型受體的NK細(xì)胞比例 SLE組、活動(dòng)亞組、非活動(dòng)亞組患者外周血CD3-CD56+NK細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，活動(dòng)亞組CD3-CD56+NK細(xì)胞比例顯著低于非活動(dòng)亞組(P值均<0.01)。SLE組、活動(dòng)亞組、非活動(dòng)亞組患者外周血CD16+NK細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，活動(dòng)亞組CD16+NK細(xì)胞比例顯著低于非活動(dòng)亞組(P值均<0.05)。SLE組、活動(dòng)亞組、非活動(dòng)亞組患者外周血TRAIL+NK細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，活動(dòng)亞組TRAIL+NK細(xì)胞比例顯著高于非活動(dòng)亞組(P<0.01，0.05)。PBMC經(jīng)與K562細(xì)胞系共培養(yǎng)后行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果顯示：SLE組、非活動(dòng)亞組CD107a+NK細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，活動(dòng)亞組SLE患者CD107a+NK細(xì)胞比例與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.446)，但顯著高于非活動(dòng)組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 SLE患者外周血表達(dá)不同類型受體的NK細(xì)胞比例 [M(P25,P75), %]

2.4 合并感染的SLE患者外周血表達(dá)不同類型受體的NK細(xì)胞比例 感染亞組SLE患者外周血CD3-CD56+NK、TRAIL+NK和CD107a+NK細(xì)胞比例與非感染亞組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；感染亞組外周血CD16+NK細(xì)胞比例顯著低于非感染亞組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 合并感染的SLE患者外周血表達(dá)不同類型受體的NK細(xì)胞比例 [M(P25,P75), %]

2.5 SLE患者外周血表達(dá)不同類型受體的NK細(xì)胞比例與疾病活動(dòng)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，SLE患者外周血CD3-CD56+NK細(xì)胞比例與SLEDAI評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.598 7,P<0.001)，與補(bǔ)體C4水平呈顯著正相關(guān)(r=0.391 4，P<0.05)。CD16+NK細(xì)胞比例與SLEDAI評(píng)分(r=-0.403 4)、24 h尿蛋白定量(r=-0.338 1)均呈顯著負(fù)相關(guān)(P值均<0.05)，與補(bǔ)體C3(r=0.357 7)、補(bǔ)體C4(r=0.414 7)水平均呈顯著正相關(guān)(P值均<0.05)。CD107a+NK細(xì)胞比例與補(bǔ)體C3(r=-0.485 8)、補(bǔ)體C4(r=-0.354 4)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P值均<0.001)，與SLEDAI評(píng)分(r=0.764 7)、24 h尿蛋白定量(r=0.680 2)呈顯著正相關(guān)(P值均<0.001)。TRAIL+NK細(xì)胞比例與SLEDAI評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.463 7，P<0.01)。

3 討 論

SLE是一種因免疫系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致組織和器官損害的自身免疫性疾病。NK細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)主要成員之一，無(wú)需激活即可攻擊缺少M(fèi)HC Ⅰ類“自我”標(biāo)記的細(xì)胞，亦能經(jīng)與受體結(jié)合被激活，以分泌促炎性細(xì)胞因子、顆粒酶和穿孔素等發(fā)揮細(xì)胞殺傷功能；同時(shí)，NK細(xì)胞還能夠?qū)D4+和CD8+T淋巴細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)等免疫細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[8]。在SLE患者中，活化的NK細(xì)胞亞群比例較高，抑制性NK細(xì)胞亞群比例較低。在疾病條件下，NK細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)自我更新，分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)未成熟的NK細(xì)胞從骨髓和(或)淋巴結(jié)中釋放，并表現(xiàn)為分化程度較低的表型。因此，在靶組織中潛在積累的促炎性NK細(xì)胞可能是導(dǎo)致SLE患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)因素之一[12-14]。

本研究證實(shí)，與對(duì)照組相比，SLE組患者外周血中的NK細(xì)胞比例顯著降低，非活動(dòng)亞組患者的外周血NK細(xì)胞比例顯著低于活動(dòng)亞組。這與Hudspeth等[15]和Zwirner等[16]針對(duì)SLE患者免疫細(xì)胞的研究結(jié)果相符。SLE患者NK細(xì)胞比例降低，提示NK細(xì)胞可能參與了SLE疾病的發(fā)生、發(fā)展，NK細(xì)胞比例降低可能與疾病活動(dòng)所致的NK細(xì)胞分化缺陷，細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及用藥情況顯著相關(guān)[8,16-18]。這提示SLE患者外周血NK細(xì)胞比例的變化可顯著影響其細(xì)胞功能。

ADCC途徑是NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷功能的主要機(jī)制之一[8]。CD16作為NK細(xì)胞ADCC機(jī)制中的主要表面受體，在ADCC細(xì)胞殺傷功能中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，SLE組外周血中CD16+NK細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組；活動(dòng)亞組SLE患者CD16+NK細(xì)胞比例顯著低于非活動(dòng)亞組；同時(shí)，合并細(xì)菌感染組的SLE患者CD16+NK細(xì)胞比例亦顯著低于未合并感染組。相關(guān)結(jié)果提示，SLE患者外周血中的NK細(xì)胞受到疾病活動(dòng)及感染所致的內(nèi)環(huán)境紊亂影響，細(xì)胞存在成熟障礙或死亡增多，故其殺傷功能受到顯著影響。

NK細(xì)胞還可通過(guò)表達(dá)TNF超家族成員(如TRAIL與TRAILR結(jié)合)而誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，TRAIL亦是NK細(xì)胞活化的重要標(biāo)志之一。研究[19-21]結(jié)果顯示，在SLE患者外周血PBMC中，TRAIL表達(dá)水平升高，相繼可引起易感細(xì)胞凋亡，致使凋亡小體產(chǎn)生增多，進(jìn)而激活DC和T、B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE組患者TRAIL+NK細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，活動(dòng)亞組患者TRAIL+NK細(xì)胞比例亦顯著高于非活動(dòng)亞組，這與其他相關(guān)研究[20,22]結(jié)果相符。

NK細(xì)胞的另一個(gè)殺傷機(jī)制是通過(guò)釋放穿孔素或顆粒酶促進(jìn)細(xì)胞裂解，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)NK細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞后，其細(xì)胞內(nèi)可釋放包裝有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒性顆粒至靶細(xì)胞形成的免疫突觸中。在突觸中，穿孔素介導(dǎo)將顆粒酶遞送至靶細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，并最終將其運(yùn)送至靶胞質(zhì)溶膠中以殺傷靶細(xì)胞。CD107a也稱為溶酶體相關(guān)膜糖蛋白1(LAMP-1)，主要位于溶酶體膜上，其已被證明是淋巴細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志物[23]。隨著脫顆粒反應(yīng)的發(fā)生，溶酶體被釋放，CD107a被轉(zhuǎn)運(yùn)至NK細(xì)胞表面，易與抗體結(jié)合。在本研究中，SLE患者CD107a+NK細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，提示SLE患者外周血NK細(xì)胞胞內(nèi)可能存在細(xì)胞毒顆粒含量減少的現(xiàn)象，致使細(xì)胞毒功能和殺傷功能受損，這與Cruz-González等[24]的研究結(jié)果相符，且細(xì)胞毒顆粒形成于NK細(xì)胞成熟的晚期[25]。由此推測(cè)，NK細(xì)胞細(xì)胞毒顆粒變化與SLE患者疾病活動(dòng)所致的NK細(xì)胞分化缺陷相關(guān)[8]?；顒?dòng)亞組SLE患者的CD107a+NK細(xì)胞比例顯著高于非活動(dòng)亞組，推測(cè)其可能與疾病活動(dòng)時(shí)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的增加，以及免疫復(fù)合物形成的增多相關(guān)，其可導(dǎo)致NK細(xì)胞免疫反應(yīng)和活性增強(qiáng)，從而激活多種凋亡誘導(dǎo)途徑(如穿孔素或顆粒酶)，進(jìn)一步介導(dǎo)的NK細(xì)胞毒性的改變[26]。

本課題組進(jìn)一步對(duì)SLE患者外周血NK細(xì)胞比例、CD16+NK細(xì)胞比例、CD107a+NK細(xì)胞比例和TRAIL+NK細(xì)胞比例與SLEDAI相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SLE外周血NK細(xì)胞比例、CD16+NK細(xì)胞比例和CD107a+NK細(xì)胞比例與SLEDAI評(píng)分及其相關(guān)評(píng)分指標(biāo)存在明顯相關(guān)性。筆者推測(cè)，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能變化，主要與ADCC途徑及細(xì)胞脫顆粒水平顯著相關(guān)，是影響SLE疾病活動(dòng)程度的重要機(jī)制。這也提示在對(duì)疾病活動(dòng)的評(píng)估方面，CD16、CD107a和TRAIL具有一定的參考價(jià)值，或可作為臨床觀察SLE疾病的活動(dòng)程度的參考指標(biāo)。

綜上，SLE患者外周血NK細(xì)胞比例減少，細(xì)胞毒功能受損，這與疾病活動(dòng)程度密切相關(guān)。建議在SLE患者治療過(guò)程中，監(jiān)測(cè)相關(guān)指標(biāo)，或可為評(píng)估病情活動(dòng)程度提供更具臨床價(jià)值的新的參考。但本研究樣本量較少，尚存在一定的局限性，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。