功能菌在醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的研究

王 西，陳 波，劉 幫，張亞?wèn)|，尹杰兵，楊靖洲

（1.四川郎酒股份有限公司，四川古藺 646523；2.四川省醬香型白酒生態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川古藺 646523）

醬酒是我國(guó)三大傳統(tǒng)白酒之一，以其醬香突出，幽雅細(xì)膩，酒體醇厚，空杯留香持久的風(fēng)味特點(diǎn)為消費(fèi)者所喜愛(ài)[1]。醬酒是以糯紅高粱、小麥、水為原料，高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、陳釀、勾調(diào)，不直接或間接添加食用酒精及非白酒發(fā)酵產(chǎn)生的呈色呈香呈味物質(zhì)，具有醬香風(fēng)格的白酒[2]。醬酒采用傳統(tǒng)開(kāi)放式生產(chǎn)工藝，通過(guò)攤晾、添加曲藥、堆積糖化等工序網(wǎng)羅大量微生物，使其進(jìn)入釀造體系發(fā)揮生香發(fā)酵作用。

糖化發(fā)酵劑俗稱(chēng)酒母、曲藥，是將糧食中的淀粉經(jīng)糖化、發(fā)酵生化反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成乙醇及微量香味成分。在醬酒生產(chǎn)過(guò)程中，微生物主要來(lái)源于曲藥、空氣、原料、窖泥等，其中有益微生物的種類(lèi)與數(shù)量對(duì)釀酒發(fā)酵生香有巨大作用，本研究在醬酒第5 輪次生產(chǎn)過(guò)程中加入一定量的醬香功能菌，以探索醬香功能菌對(duì)醬酒生產(chǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：糟醅、酒樣（四川古藺郎酒廠）；醬香功能菌（復(fù)合菌）從郎酒高溫大曲中篩選而制成。

試劑：酚酞指示劑（10 g/L）；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mol/L）；20%氫氧化鈉溶液；斐林試劑；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1%）；鹽酸溶液（1+4）；乙醇溶液；乙酸丁酯內(nèi)標(biāo)溶液；M5635-02 DNA 提取試劑盒，Omega；75510-019 Agarose，Invitrogen；DL15000 或DL2000 Marker，Takara；AM9870 TAE，Invitrogen；M0491L Q5? High-Fidelity DNA Polymerase，NEB；P7589 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，Invitrogen；High Sensitivity DNA Kit，Agilent；細(xì)菌16S rRNA V3—V4 區(qū)PCR 擴(kuò)增引物（338F：5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[3]。

儀器設(shè)備：食品級(jí)不銹鋼電子測(cè)溫計(jì)；電子鼓風(fēng)干燥箱；干燥器；蒸發(fā)皿；燒杯；電爐；量筒；7890A 氣相色譜儀，Agilent；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司；高速離心機(jī)；NC2000-微量紫外分光光度計(jì)，Thermo Scientific；DYY-6C 電泳儀，北京六一；Axygen 凝膠回收試劑盒；BG-gds-AUTO(130)凝膠成像系統(tǒng)，北京百晶；2720 PCR 擴(kuò)增儀，ABI；FLX800T 酶標(biāo)儀，BioTek；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit；FLx800-Microplate reader，BioTek；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，Illumina；Bioanalyzer，Agilent；Microplate reader(BioTek,FLx800)；NovaSeqPE250，Illumina。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 醬香功能菌在醬酒生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用探究

在第4 輪次生產(chǎn)結(jié)束后，選取發(fā)酵結(jié)束的6 口窖池，分為2 組，每組3 口窖池。同時(shí)開(kāi)窖，每口窖池每排各取1 甑出池糟醅，為保證糟醅初始理化性質(zhì)基本一致，將取自于6 口窖池的糟醅拌和均勻，平均分配，同時(shí)進(jìn)行取酒、蒸糧、攤晾操作，待糟醅攤晾至32 ℃時(shí)添加曲粉，Ⅰ組（試驗(yàn)組）添加混合曲粉（高溫大曲+投糧量2‰醬香功能菌），Ⅱ組（常規(guī)組）添加等量的高溫大曲，拌和均勻后各甑糟醅單獨(dú)起堆糖化。6口試驗(yàn)窖池中剩余糟醅均按上述方法處理，直至所有糟醅完成起堆。糖化結(jié)束后同時(shí)下窖發(fā)酵（對(duì)應(yīng)編號(hào)Ⅰ組1 號(hào)窖池、Ⅰ組2 號(hào)窖池、Ⅰ組3 號(hào)窖池，Ⅱ組1 號(hào)窖池、Ⅱ組2 號(hào)窖池、Ⅱ組3 號(hào)窖池）。生產(chǎn)過(guò)程中，確保每甑底鍋水用量、上甑操作、上甑時(shí)間、蒸餾氣壓、蒸餾時(shí)間等一致。

第5 輪次發(fā)酵結(jié)束后，6 口試驗(yàn)窖池同時(shí)開(kāi)窖，按正常生產(chǎn)取酒，各窖池所取原酒單獨(dú)貯存。

1.2.2 糟醅理化指標(biāo)測(cè)定

樣品準(zhǔn)備：取6 口窖池第4 輪次第13 甑（中層）上甑前混合樣糟醅；Ⅰ、Ⅱ組第5 輪次第13 甑加曲后、入池前糟醅及出池中層糟醅混合樣。

測(cè)定方法：利用酸堿滴定法測(cè)定糟醅酸度，恒重法測(cè)定水分，斐林試劑法測(cè)定殘?zhí)呛偷矸?，試劑配制和測(cè)定方法參見(jiàn)GB/T 10345《白酒分析方法》[4]。

1.2.3 糖化及發(fā)酵溫度的測(cè)定

糖化溫度的測(cè)定：在糖化堆距離地面90 cm±4 cm，深度20 cm±3 cm 處隨機(jī)選取4 個(gè)位置（取平均值為腰部溫度）及頂部向下、底部向上20 cm±3 cm插入食品級(jí)不銹鋼測(cè)溫桿，每隔12 h測(cè)量記錄一次5個(gè)不同位置的溫度。

窖內(nèi)發(fā)酵溫度測(cè)定：每天上午同一時(shí)間段采用食品級(jí)不銹鋼電子測(cè)溫桿測(cè)定窖內(nèi)上、中、下6 個(gè)點(diǎn)位的溫度，每隔24 h測(cè)量記錄一次溫度。

1.2.4 色譜分析（毛細(xì)管）

酒樣制備：對(duì)第5 輪次的Ⅰ、Ⅱ組6 口窖池單獨(dú)分層取酒，并對(duì)同一組窖面、窖中、窖底綜合酒樣進(jìn)行香味成分的測(cè)定。

色譜柱：KB-ALCOHOL 毛細(xì)管柱，20 m×0.53 mm（內(nèi)徑）×0.6 μm（壁厚）或性能相當(dāng)色譜柱。載氣：高純氮，流速1.6 mL/min，分流比20∶1，尾吹30 mL/min。氫氣：流速40 mL/min。空氣：流速400 mL/min。檢測(cè)器溫度：260 ℃。進(jìn)樣器溫度：240 ℃。柱溫：初始溫度為50 ℃，恒溫8 min，以6 ℃/min 的速度升溫至160 ℃，繼續(xù)恒溫5 min。進(jìn)樣體積：10.0 μL。

1.2.5 糟醅微生物測(cè)定

1.2.5.1 糟醅樣品準(zhǔn)備

取第4 輪次出池中層糟混合樣（即6 口窖池第13 甑上甑前混合樣，編號(hào)A3），Ⅰ、Ⅱ組第5 輪次第13 甑加曲后、入池前糟醅及出池中層糟醅混合樣：Ⅰ組第13 甑加曲后的混合樣（編號(hào)A1），Ⅱ組第13甑加曲后的混合樣（編號(hào)B2）；Ⅰ組入池混合樣（編號(hào)A2），Ⅱ組入池混合樣（編號(hào)B1）；第5 輪次Ⅰ組窖池中層混合樣（編號(hào)A4），Ⅱ組窖池中層混合樣（編號(hào)B3）。

1.2.5.2 微生物組總DNA提取與PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)微生物組總DNA 提取按照omega M5635-02 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，抽提完成的DNA 通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分子大小判斷，再利用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA 進(jìn)行定量，測(cè)定其OD260/280值及其含量。

PCR擴(kuò)增操作：將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后，在PCR 儀上于98 ℃下預(yù)變性30 s，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于98 ℃下保持15 s 使模板變性，然后將溫度降到50 ℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72 ℃下保持30 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)25～27 次，使擴(kuò)增的DNA 片段大量累積。最后，在72 ℃下保持5 min，使產(chǎn)物延伸完整，4 ℃保存。

1.2.5.3 DNA文庫(kù)建立與測(cè)序分析

擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen 凝膠回收試劑盒回收目的片段，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 對(duì)PCR 產(chǎn)物在Microplate reader (BioTek,FLx800)上進(jìn)行定量。再利用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 進(jìn) 行DNA 建庫(kù)，文庫(kù)經(jīng)Agilent Bioanalyzer 機(jī)器用Agilent High Sensitivity DNA Kit 2100 質(zhì)檢合格后，利用Illumina公司的NovaSeqPE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.5.4 生物信息學(xué)分析

首先對(duì)高通量測(cè)序獲得的原始下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進(jìn)行初步篩查，對(duì)問(wèn)題樣本進(jìn)行重測(cè)、補(bǔ)測(cè)；通過(guò)質(zhì)量初篩的原始序列按照index 和Barcode[5]信息，進(jìn)行文庫(kù)和樣本劃分，并去除barcode[5]序列，獲得高質(zhì)量的Tags 序列。利用QIIME2 dada2[6]進(jìn)行序列去噪或OTU聚類(lèi)測(cè)定、生物學(xué)組成分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加醬香功能菌對(duì)醬酒發(fā)酵過(guò)程中溫度的影響

2.1.1 糖化堆積溫度變化

按方法1.2.3 對(duì)Ⅰ、Ⅱ組糖化堆底部、腰部、底部的溫度進(jìn)行測(cè)定，并記錄其溫度變化，不同部位平均溫度變化如圖1所示。

圖1 糖化堆積溫度圖

從圖1 可以看出：糖化過(guò)程中，Ⅰ、Ⅱ組糖化堆溫度變化均呈現(xiàn)“前期升溫慢、中期升溫快、后期穩(wěn)定”的規(guī)律；同一糖化堆不同部位糖化溫度比較，Ⅰ、Ⅱ組均表現(xiàn)為：頂部＞腰部＞底部；同點(diǎn)位不同堆糖化溫度比較，在糖化前期（前48 h）Ⅰ組（試驗(yàn)組）糖化堆平均溫度略高于Ⅱ組（常規(guī)組）糖化堆平均溫度，48 h后兩者基本持平。

糖化前期，糖化堆具有一定含氧量，Ⅰ組由于添加醬香功能菌，其中微生物數(shù)量和種類(lèi)多于Ⅱ組，糖化過(guò)程得到促進(jìn)，故其糖化溫度略高于Ⅱ組。隨著糖化時(shí)間的推移，含氧量降低，溫度升高，大多產(chǎn)酒菌生長(zhǎng)在后期受到抑制，微生物活躍度與Ⅱ組基本持平，溫度無(wú)較大差異。

2.1.2 窖內(nèi)溫度

按方法1.2.3 對(duì)Ⅰ、Ⅱ組發(fā)酵窖池內(nèi)部窖內(nèi)上、中、下6 個(gè)點(diǎn)位進(jìn)行溫度測(cè)定，并記錄其溫度變化，每組所測(cè)溫度平均值結(jié)果如圖2所示。

圖2 窖內(nèi)發(fā)酵溫度圖

從圖2 可以看出，同組窖池內(nèi)發(fā)酵溫度為窖中＞窖底＞窖面。兩組窖池在同一位置、相同發(fā)酵天數(shù)下，Ⅰ組窖池平均溫度略高于Ⅱ組窖池平均溫度；整體而言，添加醬香功能菌的窖池比常規(guī)窖的溫度略高1 ℃。

2.2 添加醬香功能菌對(duì)糟醅理化的影響

糟醅理化指標(biāo)檢測(cè)是醬酒生產(chǎn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)并判斷糟醅質(zhì)量的重要手段，是生產(chǎn)任務(wù)順利完成的保障[7]。對(duì)各樣品糟醅理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 糟醅理化指標(biāo)

從表1 可以看出，在第5 輪次生產(chǎn)中，水分增加，酸度降低，糟醅水分與酸度呈負(fù)相關(guān)。經(jīng)30 d發(fā)酵后，Ⅰ組糟醅淀粉利用率為3.34%，Ⅱ組糟醅淀粉利用率為2.52%，說(shuō)明試驗(yàn)組淀粉分解能力略高于常規(guī)組；Ⅰ組糟醅糖分利用率為1.04%，較Ⅱ組糟醅糖分利用率略高0.11%。綜上，Ⅰ組（試驗(yàn)組）的糟醅淀粉及糖分利用率略高于Ⅱ組（常規(guī)組）。

2.3 樣品微生物多樣性分析

2.3.1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)處理

采用Illumina 平臺(tái)對(duì)群落DNA 片段進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3—V4 區(qū)序列測(cè)序測(cè)定，選擇Vsearch[8]方法對(duì)樣本序列進(jìn)行分析，結(jié)果如表2 所示。7 個(gè)樣品合計(jì)測(cè)得原始序列數(shù)為559716 條，過(guò)濾后得到有效序列總量為460626 條，7 組樣品Q(chēng)20 值（質(zhì)量值大于或等于00 的堿基占總堿基數(shù)的百分比）均大于94%，說(shuō)明數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)表

2.3.2 細(xì)菌菌群Alpha多樣性分析

在97%相似度下，針對(duì)460626 條具有代表性序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，并利用QIIME 劃分OTU，同時(shí)以Alpha 多樣性指標(biāo)中的Chao1 指數(shù)、Observed species 指數(shù)、Shannon 指數(shù)等對(duì)樣品序列文庫(kù)進(jìn)行分析。以Chao1[9]和Observed species 指數(shù)表征豐富度，以Shannon[10]指數(shù)表征多樣性，結(jié)果如表3所示。

表3 樣品Alpha多樣性指數(shù)表

由表3 可看出，各樣品OTU 數(shù)量分別為1707、1516、207、856、1250、874、216，合計(jì)OTU 數(shù)量為6626個(gè)。對(duì)第4輪次出池糟和第5輪次各樣品進(jìn)行Alpha 多樣性分析，第5 輪次生產(chǎn)過(guò)程中：A1 中Chao1 與Observed species 指數(shù)最大，豐富度最高，而B(niǎo)2豐富度最低；樣品A2中Shannon指數(shù)最大，多樣性最高，A3 多樣性最低。由此可見(jiàn)，在醬酒生產(chǎn)過(guò)程中添加2‰醬香功能菌，能夠提升細(xì)菌菌落的豐富度和多樣性。

2.3.3 樣品間屬水平群落結(jié)構(gòu)組成分析

在OTU 劃分基礎(chǔ)上，選取OTU 中豐度最高的序列作為代表序列，與微生物參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)鑒定，各分類(lèi)水平所含分類(lèi)單元數(shù)量計(jì)算完成后，調(diào)用QIIME2 軟件中“qiime taxa barplot”命令，進(jìn)行樣品屬水平組成結(jié)構(gòu)繪圖，結(jié)果如圖3所示。

從圖3 可以看出，一共獲得10 個(gè)可鑒定的菌屬和一些無(wú)法歸類(lèi)的菌屬。10 個(gè)菌屬分別為L(zhǎng)actobacillus、Kroppenstedtia、Halomonas、Sphingomonas、Escherichia-Shigella、Acinetobacter、Bacillus、Thermoactinomyces、Pelagibacterium、Weissella，將相對(duì)含量≥1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。上甑前糟醅（A3）的主要優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)actobacillus（91.23%）和Escherichia-Shigella（3.1%）。

圖3 屬水平各樣本細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)組成差異

經(jīng)蒸餾取酒后Ⅰ組糟醅（加入2 ‰醬香功能菌）加曲后（A1）優(yōu)勢(shì)菌屬為：Lactobacillus（3.78%）、Kroppenstedtia（27.59%）、Halomonas（1.12%）、Sphingomonas（4.49%）、Escherichia-Shigella（2.63%）、Acinetobacter（1.75%）、Bacillus（5.13%）、Thermoactinomyces（4.85%）、Weissella（16.01%），添加醬香功能菌后優(yōu)勢(shì)菌屬增加7 個(gè)，其中，Lactobacillus和Escherichia-Shigella含量呈下降趨勢(shì)，其余細(xì)菌大幅增加。所有糟醅加曲完成后，堆積糖化96 h 后（A2），優(yōu)勢(shì)菌屬為：Kroppenstedtia（27.97%）、Halomonas（6.66%）、Sphingomonas（5.65% ）、Acinetobacter（6.69% ）、Bacillus（10.77%）、Thermoactinomyces（4.92%）、Pelagibacterium（5.69%），在糖化環(huán)節(jié)，Lactobacillus和Escherichia-Shigella生長(zhǎng)受到抑制，其余優(yōu)勢(shì)菌種均得到有效增長(zhǎng)。經(jīng)入池發(fā)酵后，優(yōu)勢(shì)菌種僅剩Lactobacillus（99.72%）。

Ⅱ組糟醅加曲后（B2）優(yōu)勢(shì)菌種為：Kroppenstedtia（23.76%）、Halomonas（5.09%）、Sphingomonas（9.44%）、Escherichia-Shigella（14.49%）、Acinetobacter（10.26%）、Bacillus（2.19%）、Thermoactinomyces（7.31%）、Pelagibacterium（4.75%）。經(jīng)堆積糖 化96 h 后（B1）優(yōu)勢(shì)菌種為：Kroppenstedtia（18.7%）、Halomonas（11.59%）、Sphingomonas（2.73%）、Bacillus（1.74%）、Thermoactinomyces（2.27%）、Pelagibacterium（7.58%），Ⅱ組在糖化過(guò)程中，Escherichia-Shigella和Acinetobacter生長(zhǎng)被抑制，Halomonas和Pelagibacterium含量增加，其余優(yōu)勢(shì)菌均呈下降趨勢(shì)。窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束后，優(yōu)勢(shì)菌種為L(zhǎng)actobacillus（94.49%）、Kroppenstedtia（1.24%）。

綜上所述，在醬酒生產(chǎn)中加入醬香功能菌能有效提升細(xì)菌屬優(yōu)勢(shì)菌種類(lèi)和相對(duì)含量，并能促進(jìn)優(yōu)勢(shì)菌種在生產(chǎn)過(guò)程中不斷繁殖生長(zhǎng)。

2.4 添加醬香功能菌對(duì)酒質(zhì)的影響

2.4.1 原酒風(fēng)味物質(zhì)分析

將兩組窖池糟醅在相同蒸汽壓力下分層取酒，對(duì)所取各組原酒酒樣進(jìn)行色譜毛細(xì)管柱分析，其結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 各組原酒主要理化指標(biāo) (mg/100 mL)

從表4 可以看出，窖池中層的原酒的吡嗪類(lèi)含量較窖面、窖底略高；其中Ⅰ組窖池窖面、窖中、窖底的總酯、四甲基吡嗪、三甲基吡嗪的平均含量分別高于Ⅱ組相同部位。從整體指標(biāo)數(shù)據(jù)看，Ⅰ組窖池（試驗(yàn)組）酒樣理化指標(biāo)略優(yōu)于Ⅱ組窖池酒樣（常規(guī)組）。

2.4.2 感官評(píng)定

將各組糟醅在相同蒸汽壓力下取酒，并送樣進(jìn)行感官嘗評(píng)，由10 名專(zhuān)業(yè)的品酒師組成暗評(píng)小組，評(píng)價(jià)方法參照中國(guó)酒業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《固態(tài)法醬香型白酒原酒》中附錄A[11]。品評(píng)結(jié)果如表5所示。

表5 各組酒樣感官品評(píng)表

從表5 可以看出，通過(guò)Ⅰ組和Ⅱ組各酒樣感官嘗評(píng)，結(jié)果表明，Ⅰ組窖池產(chǎn)酒上、下層與Ⅱ組窖池酒樣感官風(fēng)格基本一致，中層酒樣Ⅰ組窖池略優(yōu)于Ⅱ組窖池原酒。

3 結(jié)論

在第5 輪次醬酒生產(chǎn)中,選定6 口窖池開(kāi)展醬酒生產(chǎn)添加醬香功能菌試驗(yàn)，以探索功能菌對(duì)醬酒生產(chǎn)的影響，圍繞糟醅糖化溫度、發(fā)酵溫度、糟醅理化指標(biāo)、微生物菌落及多樣性、原酒理化與感官等方面分析，發(fā)現(xiàn)：加入醬香功能菌的糖化堆在堆積前期（前48 h）溫度略高于常規(guī)曲，48 h 后兩者基本持平，在窖池發(fā)酵溫度上比常規(guī)窖的溫度略高1 ℃；其糟醅淀粉利用率和糖分利用率高于常規(guī)；微生物豐度和優(yōu)勢(shì)菌群類(lèi)別和含量有所提升；風(fēng)味物質(zhì)含量表現(xiàn)略優(yōu)，中層酒感官略優(yōu)于常規(guī)。

本研究中通過(guò)在第5 輪次醬酒生產(chǎn)中添加醬香功能菌試驗(yàn)，能一定程度提高細(xì)菌屬優(yōu)勢(shì)菌種類(lèi)和含量，促進(jìn)優(yōu)勢(shì)菌群繁殖生長(zhǎng)，提升醬酒風(fēng)味指標(biāo)和原酒品質(zhì)。因本研究只是小范圍試驗(yàn)，全面性不足，該結(jié)果僅供參考，今后還需進(jìn)一步深入探索。