小兒腸絞痛和腸道菌群組成與免疫標(biāo)志物相關(guān)分析

李佳 任文娟 高春燕 賀金娥 姜華

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，陜西 延安 716000)

嬰兒腸絞痛是功能性胃腸道疾病(FGIDs)的早期表現(xiàn)之一，也是3個(gè)月以下嬰兒的常見(jiàn)病，發(fā)病率高達(dá)20%[1]。典型的癥狀表現(xiàn)為突然發(fā)作且不易安撫的劇烈哭鬧，常伴有陣發(fā)性的肢體動(dòng)作以及大量的排氣。研究[2]表明，腸絞痛隨著嬰兒的生長(zhǎng)常常在3個(gè)月之后消失，但是其可與某些長(zhǎng)期的功能性胃腸道疾病有關(guān)。相關(guān)研究[3-4]表明，改善腸道菌群組成和服用益生菌對(duì)腸絞痛和腸易激綜合征有治療效果。益生菌治療的的作用機(jī)制包括干擾腸道菌群的生長(zhǎng)和活性以及增強(qiáng)粘膜屏障功能和粘膜免疫系統(tǒng)。本文主要探討嬰兒腸絞痛是否引起腸道菌群組成變化以及是否關(guān)聯(lián)某些免疫標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年5月至2018年5月在本院就診的96名嬰兒腸絞痛患兒作為實(shí)驗(yàn)組，采用包括鼠李糖乳酸桿菌(LGG)作為益生菌的介入治療，另選取46名健康嬰兒為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組患兒，男54例,女42例，日齡(37±9)d，順產(chǎn)75例出生體重(3 521±473)g，出生身高(49±3)cm，母乳喂養(yǎng)63例、人工喂養(yǎng)33例，新生兒評(píng)分-5分鐘(9±0.8)，家族有過(guò)敏史87例、圍產(chǎn)期抗生素暴露45例、發(fā)病日齡<14 d 18例、首次抗生素使用<28 d 12例、首次使用益生菌<28 d 12例；對(duì)照組嬰兒日齡(37±9)d，順產(chǎn)32例出生體重(3 701±592)g，出生身高(49±3)cm，母乳喂養(yǎng)16例、人工喂養(yǎng)30例，新生兒評(píng)分-5分鐘(9±0.6)，家族有過(guò)敏史28例、圍產(chǎn)期抗生素暴露10例、發(fā)病日齡<14 d 0例、首次抗生素使用<28 d 0例、首次使用益生菌<28 d 0例。納入患兒均通過(guò)電話交談或當(dāng)面問(wèn)診時(shí)，監(jiān)護(hù)人描述嬰兒哭鬧或煩躁每天持續(xù)≥3 h，每周≥3 d有癥狀發(fā)作或持續(xù)4周以上者；24 h內(nèi)哭鬧和煩躁時(shí)間≥3 h；臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性腹痛，呈突然發(fā)作狀；患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。已排除急腹癥患兒、腹痛型癲癇或其他疾病所致腹痛。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2血液樣品的采集處理 收集參與本研究嬰兒3～5周齡時(shí)的外周靜脈血樣。所有血樣均在益生菌干預(yù)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行，將全血樣品收集在EDTA管中并離心，保存血清-70℃留用。分析測(cè)定前，先解凍血清樣品，然后以3 000 g離心10 min。取上清液，使用Merck Millipore測(cè)定試劑盒檢測(cè)其細(xì)胞因子和趨化因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1、MIP-1β、TNF-α)的濃度。使用Luminex 200系統(tǒng)進(jìn)行分析，用xPONENT3.1軟件計(jì)算細(xì)胞因子和趨化因子濃度。批內(nèi)變異系數(shù)為1.8%。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(R&D Systems ELISA試劑盒)測(cè)定趨化因子CXCL16濃度，通過(guò)Zonulin ELISA試劑盒測(cè)定連蛋白(Zonulin)濃度以及通過(guò)Hycult Biotech ELISA試劑盒測(cè)定腸細(xì)胞損傷生物標(biāo)志物I-FABP的濃度。批內(nèi)變異系數(shù)均<3.4%。所有的血清樣品都進(jìn)行了三組平行測(cè)定。

1.3糞便樣品采集處理 在鼠李糖乳酸桿菌(LGG)干預(yù)之前，從腸絞痛患兒的尿布中取出糞便樣品并轉(zhuǎn)移到-20℃且在24 h內(nèi)將儲(chǔ)存在-70℃留用。對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)InviMag Stool DNA試劑盒(Stratec Molecular)和Thermo Fisher Scientific KingFisher Flex全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)提取DNA。提取的DNA樣品儲(chǔ)存在-20℃留用。將上述提取的DNA采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)來(lái)研究的腸道菌群組成與嬰兒腸絞痛的關(guān)聯(lián)。從Saureus、Ecoli、Bbifidum、Badolescentis、Bcatenulatum、Bbreve、Binfantis、Bdentium、Blactis、Bacteroidesfragilis、Blongum、Cdifficile、Ccoccoides、Cperfringens及Cleptum等菌株的菌株懸浮液中提取的DNAs作為qPCR的定量標(biāo)準(zhǔn)品，用以對(duì)糞便樣品中提取的DNAs進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別和定量。用實(shí)時(shí)Roche Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR(Roche)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和定量檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，連續(xù)變量表示為平均值，取95%置信區(qū)間或標(biāo)準(zhǔn)偏差及分類值的數(shù)量和比例。通過(guò)卡方檢驗(yàn)分類變量，正態(tài)分布連續(xù)變量的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非正態(tài)分布連續(xù)變量的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較研究組之間的差異。采用Spearman檢測(cè)其相關(guān)性，采用逐步回歸法對(duì)單因素分析中具有顯著性意義變量進(jìn)行線性回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1免疫標(biāo)記物的分析 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血清中MIP-1β、MCP-1、IL-8和I-FABP濃度差異性顯著(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組血清中的TNF-α濃度高于對(duì)照組(P<0.05)。兩組的I-FABP、IL-1β、CXCL16、IL-6、IL-10、IFN-γ和連蛋白的各濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。糞便樣品中的的Cleptum菌群水平與促炎標(biāo)志物MIP-1β、MCP-1、TNF-α呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。雙歧桿菌亞群)水平與CXCL 16呈正相關(guān)(P<0.05)，而球形梭菌群水平與MCP-1呈負(fù)相關(guān)。其他免疫生物標(biāo)志物和腸道菌群水平之間無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清中免疫腫瘤標(biāo)志物的濃度

2.2多元線性回歸分析 以腸道菌群水平作為因變量，采用多元線性回歸將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義指標(biāo)作為調(diào)整變量一起納入分析，結(jié)果顯示，MIP-1β與腸道菌群水平呈現(xiàn)正相關(guān)，TNF-α與腸道菌群水平呈正相關(guān)，而IL-8、MCP-1和I-FABP與腸道菌群水平無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 腸道菌群水平相關(guān)因素多元線性回歸分析

3 討 論

在嬰兒發(fā)育的關(guān)鍵階段，腸道菌群失衡與低度全身性炎癥將一起誘導(dǎo)免疫和代謝表型的持久改變，并且可能增加在以后生活中發(fā)展非傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。已有研究[7]證實(shí)，患有腸絞痛的嬰兒糞便中鈣防衛(wèi)蛋白濃度有所升高，表明這與小腸炎癥有關(guān)。研究[8-9]表明，腸絞痛患兒在生后早期菌群多樣性缺乏，乳酸菌水平低下，影響腸道脂肪酸合成，并且更多定植了產(chǎn)氣的艱難梭菌屬、大腸桿菌屬和克雷伯菌屬，因此，腸道菌群改變是一個(gè)潛在的重要因素，也成為益生菌治療的理由之一。早期有研究[10]表明，Cleptum和Cccocoides菌群可能在通過(guò)誘導(dǎo)、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)T細(xì)胞來(lái)維持腸道菌群平衡和促進(jìn)免疫系統(tǒng)成熟方面發(fā)揮重要作用；此外動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)了口服特定梭菌屬菌株(Clostridiumspp.)可以減輕結(jié)腸炎和過(guò)敏性腹瀉型疾病，而糞便樣本Cleptum菌群的低水平與哮喘和炎性腸病相關(guān)。

本文免疫標(biāo)記物的分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血清中MIP-1β、MCP-1、IL-8和I-FABP濃度差異性顯著；實(shí)驗(yàn)組血清中的TNF-α濃度也高于對(duì)照組。兩組的I-FABP、IL-1β、CXCL16、IL-6、IL-10、IFN-γ和連蛋白的各濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糞便樣品中的的Cleptum菌群水平與促炎標(biāo)志物MIP-1β、MCP-1、TNF-α呈負(fù)相關(guān)。雙歧桿菌亞群水平與CXCL 16呈正相關(guān)，而球形梭菌群水平與MCP-1呈負(fù)相關(guān)。其他免疫生物標(biāo)志物和腸道菌群水平之間無(wú)顯著相關(guān)性?；貧w分析顯示，MIP-1β與腸道菌群水平呈現(xiàn)正相關(guān)，TNF-α與腸道菌群水平呈正相關(guān)，而IL-8、MCP-1和I-FABP與腸道菌群水平無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。

綜上所述，本研究的結(jié)果可支撐特定的菌群在嬰兒期可能發(fā)揮著有益的免疫調(diào)節(jié)作用這一理論。本研究結(jié)果還表明，不同于常規(guī)益生菌，Cleptum和Ccoccoides可能具有抗炎特性并有助于減輕與腸絞痛相關(guān)的炎癥和癥狀，因此該菌株的開(kāi)發(fā)可以作為新型益生菌的發(fā)展方向。功能性胃腸疾病存在著腸道菌群紊亂，腸道菌群多樣性發(fā)生變化，這些變化或許是原因，或許是結(jié)果。臨床上，依據(jù)菌株特異性，及時(shí)、足量、合理補(bǔ)充益生菌制劑，有利于兒童胃腸道疾病的康復(fù)。