基于大鼠腦缺血再灌注模型的燈盞乙素腦保護作用研究

王立斌 趙青 楊珊珊 劉亭 楊暢△

(1.貴州醫(yī)科大學/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室&貴州省藥物制劑重點實驗室,貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學/民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心,貴州 貴陽 550004;3.貴州醫(yī)科大學藥學院,貴州 貴陽 550025)

腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點，在全球每年新增患者約1 500萬，其中缺血性腦卒中占腦卒中發(fā)病率80%[1]，其特點是流向大腦的血流減少、腦組織的病理改變、局灶性精神功能缺失等，涉及一系列復雜的反應(yīng)機制，包括氧化應(yīng)激、興奮性中毒、炎癥等[2]。燈盞花屬菊科植物短葶飛蓮Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz.的干燥全草，臨床上主要用于治療心絞痛、中風、改善認知障礙等[3-4]。其燈盞花素是燈盞花中的黃酮類成分[5]，具有清除自由基、改善微循環(huán)、抑制血管平滑肌細胞增殖等作用[6]。在2015版藥典中，關(guān)于燈盞花素制劑的質(zhì)量規(guī)定，燈盞花素片劑里燈盞乙素(Scutellarin,Scu)的含量不能低于90%，燈盞花素注射液里燈盞乙素的含量不得低于98%[7]。提示燈盞乙素是制劑中發(fā)揮藥效的主要成分，且有動物實驗[8]表明燈盞乙素對腦缺血的治療效果優(yōu)于燈盞花素。因此本文以中藥有效單體燈盞乙素為研究對象，通過神經(jīng)功能缺損評分，TTC染色法測定腦梗死面積，HE染色觀察大腦海馬區(qū)的病理狀況及，TUNEL檢測測定大腦的凋亡細胞等藥理學研究方法，對燈盞乙素的腦保護作用進行研究，以期為臨床用藥和藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD成年雄性大鼠，體重(260±10)g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2014-0011，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，環(huán)境溫度在(25±3)℃，相對濕度在(50±10)%的動物房。

1.2材料與儀器 動物飼料(江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物有限責任公司)；MCAO栓線(型號：2636-A4，北京西濃科技有限公司)；燈盞乙素(純度>98 %，昆明淶醫(yī)藥科技有限公司)；TCC(Sigma-aldrich公司)；水合氯醛(天津大茂化學試劑廠)；生理鹽水(貴州科倫藥業(yè)有限公司)；10 %甲醛(重慶江川化工有限公司)；無水乙醇(成都海興化工試劑廠)；二甲苯(福晨(天津)化學試劑有限公司)；鹽酸(成都市科龍化工試劑廠)；重鉻酸鉀(天津致遠化學試劑有限公司)；濃縮型二苯基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；胰蛋白酶K(美國Merck Millipore公司)；蘇木素染液(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)；伊紅染液(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。EL240十萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；THZ-82A水浴恒溫振蕩器(上海皓莊儀器有限公司)；轉(zhuǎn)輪式切片機(徠卡-2016，德國)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(常州中威電子儀器廠)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州中威電子儀器有限公司)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)；Pannoramic 250型全景數(shù)字幻燈片掃描(3DHISTECH公司)。

1.3實驗方法

1.3.1分組 60只SD(Sprague Dawley)大鼠隨機分為正常組、MCAO模型對照組、低、中、高劑量組(2、5、10 mg·kg-1)，其中每組12只大鼠，6只作為TCC染色，6只作為HE染色和TUNEL熒光染色。(本實驗造模過程中死亡大鼠，造模后未存活到3 d的大鼠，評分為0和4的大鼠，將補充對應(yīng)數(shù)量合格模型完成實驗。)大鼠腦缺血1 h后尾靜脈注射給藥，并于24 h和48 h再次給藥，正常組和模型對照組注射為生理鹽水。

1.3.2建立動物MCAO模型 術(shù)前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射10 %水合氯醛(3.5 g·kg-1)麻醉，將麻醉好的大鼠以仰臥位固定，頸部用75%酒精消毒，沿頸部中線開口，鈍性分離筋膜，在頸部右側(cè)觀察到頸總動脈，呈“Y”字型，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈，暫時關(guān)閉頸內(nèi)動脈，在頸總動脈上剪開一個小口，將栓線插入頸內(nèi)動脈，并將栓線上黑色標記處過于頸總動脈三岔處，用縫合線固定栓線，縫合傷口。栓線插入1 h后，將栓線拔出頸內(nèi)動脈，對其進行再灌注。24 h后進行評分，評分在1～3分為MCAO模型成功，排除死亡和不符合標準的模型。

1.3.3神經(jīng)功能缺損評分 再灌注24 h后進行評分，神經(jīng)行為評分中，避免對動物不必要的干擾，所有大鼠均被溫和地對待，避免強硬動作對大鼠造成額外的創(chuàng)傷及對實驗結(jié)果的影響。 采用Zea-longa5分制法，評分標準:0分：無明顯的神經(jīng)損傷癥狀；1分：前爪不能完全伸展；2分：行走時向?qū)?cè)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，無自主意識。

1.3.4TTC染色 大鼠股動脈放血后處死后，迅速將大鼠放在冰袋上斷頭取腦，于-20℃環(huán)境條件下冷凍固定腦組織20 min，取出將全腦冠狀面切成5片；用磷酸緩沖液配制1 %TCC染料浸泡腦組織并搖床孵育、避光染色15 min，最后用10%甲醛固定后拍照。將照片導入Image J軟件計算腦梗死面積。按以下公式進行計算：腦梗死面積=白色區(qū)域面積/整個腦的總面積×100%。

1.3.5HE染色 用中性10%甲醛固定大鼠腦組織，經(jīng)脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片后，鏡檢每張切片先于40倍下觀察全部組織，了解大體病變后，選擇觀察的區(qū)域采集400倍的圖片，觀察具體病變。

1.3.6TUNEL檢測 用中性10%甲醛固定大鼠腦組織，按TUNEL試劑盒檢測說明書上操作處理，甘油封片，熒光顯微鏡檢測每張切片先于100倍下觀察全部組織，再根據(jù)組織大小采集3張200倍圖像，計算分析凋亡細胞的數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1MCAO模型24 h時Zea-longa5評分結(jié)果 正常組評分為(0±0.00)，模型組評分為(1.75±0.62)，低劑量組評分為(1.92±0.51)，中劑量組評分為(1.83±0.39)，高劑量組評分為(2.00±0.60)。模型組與給藥組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，MCAO模型組與正常組有顯著性差異(P<0.001)。見圖1。

圖1 各組大鼠24 h后的神經(jīng)功能損傷評分

2.2腦缺血再灌注第3天的TTC染色結(jié)果 經(jīng)TCC染色，正常腦組織部位染色顯紅色，腦梗死部位顯白色，通過Image J軟件測得腦梗死面積百分比，正常組為(0±0.00)%，模型對照組為(26.8±6.00)%，低劑量組為(25.81±2.80)%，中劑量為(22.90±1.84)%，高劑量組為(17.33±1.75)%。從圖2A染色結(jié)果可以觀察出，MCAO模型組與正常組有顯著性差異(P<0.001)；與對照組相比，給藥組腦切片中白色面積部分均變小，低、中、高劑量均有改善腦缺血的作用，且高劑量和中劑量組與模型對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，呈現(xiàn)高劑量梗死面積減少最大，中劑量次之，低劑量稍有減少。

注：A.大鼠的TTC染色切片；B.大鼠的腦梗死面積百分比。圖2 TTC染色結(jié)果

2.3大鼠腦缺血再灌注第3天腦部HE染色結(jié)果 正常組海馬CA1區(qū)域胞核胞質(zhì)分界不清(黑色箭頭)，未見明顯炎癥；模型對照組海馬CA1區(qū)域呈現(xiàn)錐體細胞層排列較為紊亂，細胞散在分布明顯，錐體細胞不同程度變性壞死，可見細胞腫脹，胞質(zhì)染色不均或呈空網(wǎng)狀，胞核固縮，染色加深或核溶解消失；低劑量海馬CA1區(qū)域組呈現(xiàn)錐體細胞壞死、錐體細胞周圍軸突變性，局部錐體細胞輕度變性壞死，見部分壞死細胞胞質(zhì)空泡化、胞核溶解，部分細胞胞核固縮；中劑量組海馬CA1區(qū)域呈現(xiàn)錐體細胞層數(shù)量輕微或輕度減少，見少數(shù)細胞散在分布；未見明顯膠質(zhì)細胞增生或炎細胞浸潤；高劑量組海馬CA1區(qū)域呈現(xiàn)錐體細胞層少量細胞排列較為紊亂，但可見排列趨勢。模型對照組與給藥組相比，給藥組低、中、高劑量組病變程度均有所減輕，其中中劑量組病變好轉(zhuǎn)最優(yōu)，高劑量組次之，低劑量組有輕微好轉(zhuǎn)。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)的HE染色結(jié)果(×400)

2.4再灌注第3天TUNEL腦細胞凋亡結(jié)果 經(jīng)TUNEL染色，凋亡細胞呈紅色，正常細胞呈藍色。通過全景數(shù)字幻燈片掃描軟件測得細胞凋亡結(jié)果，正常組細胞凋亡百分率為(0±0)%，模型對照組為(54±4)%，低劑量組為(31±3)%，中劑量組為(23±1)%，高劑量組為(13±3)%。正常組與模型組相比，基本無細胞凋亡，給藥組與模型對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組的細胞凋亡率有顯著性地降低(P<0.01)。見圖4。

注：A.TUNEL染色結(jié)果(×200)；B.大鼠腦組織細胞的凋亡率。圖4 TUNEL腦細胞凋亡結(jié)果

3 討 論

燈盞花素在臨床上被廣泛用于心腦血管疾病[8-9]。有研究[10]證明，燈盞乙素對腦缺血的保護作用優(yōu)于燈盞花素，且有更好的量效關(guān)系。因此本實驗建立大鼠腦缺血再灌注模型，選取神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積，腦部病理變化及神經(jīng)細胞凋亡結(jié)果作為藥效評價指標，擬從系統(tǒng)、器官、細胞水平上，綜合分析燈盞乙素對大鼠腦缺血再灌注的保護作用。

神經(jīng)功能缺損評分反映了大鼠MCAO模型在整體表觀上的受損程度。在給藥第1天時，對所有大鼠進行Zea-Longa 5分法評分，發(fā)現(xiàn)各給藥組的神經(jīng)功能均有一定程度改善，但與模型組相比沒有顯著性差異，可能是腦缺血本身產(chǎn)生的復雜損傷機制，如：自由基反應(yīng)、興奮性毒性氨基酸、PARP酶的激活等作用引起的腦損傷較大[11]，也可能是給藥劑量不足或者給藥時間過短，還未顯效造成的。TTC是一種將正常腦組織染色成紅色，腦梗死部位染色成白色或蒼白色的染料。通過Image J軟件可將腦梗死組織量化為面積，直觀地反映燈盞乙素在腦組織層面的治療作用。結(jié)果顯示，隨著燈盞乙素劑量的增加，腦梗死面積逐漸降低，且與模型對照組相比，具有顯著性差異，因此說明燈盞乙素具有一定的腦保護作用。HE染色結(jié)果同樣觀察到燈盞乙素能有效改善腦缺血對海馬的損傷，減少神經(jīng)細胞排列紊亂、數(shù)量減少和細胞腫脹的現(xiàn)象，但高劑量組的細胞腫脹程度高于中劑量組且觀察到給藥高劑量組的大鼠在藥物治療期間，出現(xiàn)過激的行為較多，猜測可能是由于高劑量的燈盞乙素誘導產(chǎn)生興奮性毒性氨基酸(谷氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸等)對大鼠行為的影響；而大鼠在過激后表現(xiàn)出的抑郁行為，可能是由于抑制性氨基酸對神經(jīng)系統(tǒng)起保護作用[12-13]。TUNEL測定腦凋亡細胞，同樣發(fā)現(xiàn)隨著燈盞乙素劑量的增加，腦凋亡細胞減少。

本實驗證實燈盞乙素具有一定的腦保護作用，且藥效呈劑量依耐性。但燈盞乙素半衰期短，體內(nèi)代謝快[14]，要在臨床上廣泛使用，還需科研工作者對其進行結(jié)構(gòu)改造、優(yōu)化或賦予其適當劑型，以提高藥物在體內(nèi)的生物利用度、延長藥物在血液里循環(huán)的時間。