抗核糖體P蛋白、抗Smith、抗dsDNA、抗核小體及抗組蛋白抗體對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床價值探討

王艷萍，鄒麟，郭婷，陳曦，史靜，陳瀑

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗科，重慶 400016)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus， SLE)是一種由抗自身抗體介導(dǎo)、累及全身結(jié)締組織的疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，好發(fā)于中年女性患者[1]。SLE的臨床表現(xiàn)多樣，常累及皮膚、關(guān)節(jié)、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等重要組織和器官。多數(shù)患者在疾病初期臨床癥狀較輕，僅出現(xiàn)1～2個器官受損，后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗥鞴俨∽?；也有部分患者早期便出現(xiàn)多器官損傷甚至狼瘡危象[2]。

SLE患者血清中存在多種自身抗體，這些抗體與SLE患者的疾病進(jìn)展、活動度及臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，但與SLE發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)的抗體并不多[3]。目前，抗Smith抗體(anti-Smith antibody，anti-Sm)、抗dsDNA抗體(anti-dsDNA)已被廣泛運(yùn)用于SLE的臨床診斷中。anti-Sm是SLE的標(biāo)志性抗體，其與SLE疾病活動度無明顯相關(guān)性，治療后仍持續(xù)陽性[4]；抗dsDNA抗體與狼瘡腎炎(lupus nephritis， LN)的發(fā)生密切相關(guān)，并被證實與SLE的疾病活動度也有很大相關(guān)性[5-6]。另有一些研究表明，抗核糖體P蛋白抗體(anti-ribosomal P protein antibody，anti-P)、抗核小體抗體(anti-nucleosome antibody，ANuA)和抗組蛋白抗體(anti-histone antibody， AHA)也是SLE特異性抗體，其中anti-P與神經(jīng)精神性狼瘡有關(guān)[7]，ANuA與LN有一定相關(guān)性[8]，而AHA可能與藥物性狼瘡有關(guān)。因此，本研究旨在系統(tǒng)性比較anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA對SLE的診斷價值，并進(jìn)一步探討這5種自身抗體與SLE患者的臨床表現(xiàn)及疾病活動度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究資料收集并回顧性分析2016年1月—2018年12月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的351例SLE患者，200例非SLE自身免疫性疾病患者(non-SLE)和100例健康對照者(healthy control， HC)的臨床資料，其中SLE患者納入標(biāo)準(zhǔn)符合修訂版1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會SLE分類標(biāo)準(zhǔn)，在資料的收集整理過程中篩選首次于該院治療患者的臨床數(shù)據(jù)，剔除無效和重復(fù)數(shù)據(jù)。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均了解研究內(nèi)容并簽署知情同意書。狼瘡腎炎(lupus nephritis， LN)除滿足SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，還需符合以下3項診斷標(biāo)準(zhǔn)中至少1項：(1)蛋白尿持續(xù)陽性，24小時尿蛋白定量>0.5 g，或隨機(jī)尿檢查尿蛋白呈強(qiáng)陽性(+++)，或尿蛋白/肌酐比值>500 mg/g(50 mg/mmol)；(2)尿液中檢出細(xì)胞管型，包括紅細(xì)胞管型、血紅蛋白管型、顆粒管型、管狀管型和混合管型；(3)有活動性尿沉渣[除尿路感染外，尿白細(xì)胞>5 個/高倍視野(high power field， HPF)，尿紅細(xì)胞>5 個/HPF]，或尿液中存在紅細(xì)胞、白細(xì)胞管型。腎活檢病理檢查顯示免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎則進(jìn)一步確診為LN[9]。non-SLE組包括130例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、25例干燥綜合征、5例自身免疫性肝炎、20例原發(fā)性膽汁性膽管炎、4例混合性結(jié)締組織病和16例皮肌炎患者。HC無任何疾病史，包括結(jié)締組織病。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 臨床表現(xiàn) 在患者首次入院并未接受過任何治療前統(tǒng)計其一般臨床資料如性別、年齡、有無高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病史。同時，記錄其是否有皮膚紅斑、蝶形紅斑、盤狀紅斑、皮疹或光敏感，是否出現(xiàn)脫發(fā)、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎、口腔潰瘍等臨床表現(xiàn)以及是否有眩暈、記憶力減退甚至癲癇等神經(jīng)精神性狼瘡癥狀或典型的LN表現(xiàn)。

1.2.2 實驗室檢查指標(biāo) 采用非抗凝管分別抽取患者外周靜脈血4 mL，2 775×g離心15 min后，分離血清用于anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA以及補(bǔ)體C3、C4水平的檢測，若不能及時檢測則分離血清分裝后于-20 ℃低溫冷凍備用。

1.2.3 SLE疾病活動指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)評分 用SLEDAI-2000積分評估疾病活動度，評分細(xì)則及評判標(biāo)準(zhǔn)如下(表1)。

表1 SLEDAI-2000積分類目及活動度評判標(biāo)準(zhǔn)

1.3 患者血清自身免疫性抗體水平的檢測如1.2.2所述檢測患者外周靜脈血樣本血清自身免疫性抗體及補(bǔ)體水平。其中，采用間接免疫熒光法檢測anti-dsDNA：(1)在包被有綠蠅短膜蟲的生物載片中加入25 μL 1∶11稀釋的血清，室溫孵育30 min；(2)用PBS流動沖洗生物載片并浸泡載片5～10 min；(3)于每張生物載片中加入25 μL 羊抗人IgG-FITC抗體，室溫孵育30 min；(4)重復(fù)步驟(2)；(5)于每張生物載片表面滴加1滴甘油后封片。anti-P、anti-Sm、ANuA和AHA的檢測采用EUROIMMUN全自動免疫印跡分析儀，所有自身抗體的檢測試劑均購自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國)有限公司。血清補(bǔ)體C3、C4采用貝克曼庫爾特IMMAGE 800全自動特定蛋白分析儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，定性資料以n(%)表示，使用χ2檢驗或Fisher確切概率法分析；定量資料以中位數(shù)M(P25，P75)表示，采用兩個獨立樣本的非參數(shù)檢驗Mann-WhitneyU檢驗；兩變量間的相關(guān)性檢測采用Spearman相關(guān)性分析。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA對SLE的診斷價值

2.1.1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA在不同組別中的陽性率 5種自身免疫性抗體在SLE組、non-SLE組和HC組中的陽性率如下，其中SLE組的陽性率顯著高于non-SLE和HC組(均P<0.01，表2)。

表2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA在不同組別中的陽性率

2.1.2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA對SLE的診斷價值比較 5種抗體對SLE的診斷特異度均大于95.0%，但靈敏度相對較低，5種抗體任一陽性檢測的靈敏度可達(dá)70.1%(表3)。同時，經(jīng)統(tǒng)計單一 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、 ANuA 和AHA陽性在這5種抗體總陽性SLE患者中所占的百分比分別為26.8%、31.5%、20.8%、8.6%和7.8%(數(shù)據(jù)不充分，暫不列表中)。

表3 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA對SLE的診斷價值

2.2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA與SLE臨床特征的關(guān)系anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA陽性組和陰性組在SLE發(fā)病年齡上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；anti-P陽性組皮膚紅斑發(fā)生率較高，ANuA陽性組脫發(fā)發(fā)生率較高，anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性組LN發(fā)生率更高，且與陰性組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表4)。

表4 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA與SLE臨床特征的關(guān)系

2.3 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA與SLE疾病活動度的關(guān)系除anti-Sm外， anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性組與陰性組比較有更高的SLEDAI，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05，表5，圖1)。其中anti-P和anti-dsDNA滴度在無活動，輕、中、重度活動組患者中的百分比差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01，表5，圖1)。補(bǔ)體C3、C4水平在5個抗體陽性組和陰性組之間差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01，表5)。Spearman相關(guān)性分析顯示SLEDAI與C3濃度存在顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.395，P=0.000)，與C4水平也存在顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.314，P=0.000)(圖2)。

表5 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA分組與SLEDAI及血清補(bǔ)體水平的關(guān)系

圖1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA不同分類下SLEDAI的分布

圖2 SLEDAI評分與補(bǔ)體C3、C4水平的相關(guān)性

3 討論

本研究全面地回顧性分析比較了anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA對SLE的診斷價值。通過表2和表3的數(shù)據(jù)可知，這5種抗體對SLE的診斷都具有很高的特異度，但靈敏度欠佳，與其他研究結(jié)果一致[10]。值得注意的是，這5種抗體任意一種陽性時診斷SLE的靈敏度可提高至70.1%而特異度仍然保持在92.3%，準(zhǔn)確度也可達(dá)80.3%。這說明anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA的聯(lián)合檢測與單個抗體檢測相比可明顯提高診斷的靈敏度和陰性預(yù)測值，減少漏診，同時特異度和陽性預(yù)測值也不會有明顯的降低。但是，這5種抗體整體的靈敏度較其他研究略低，可能是方法學(xué)的原因造成的，本研究中anti-P、anti-Sm、ANuA 和 AHA是采用Western blotting檢測的，而anti-dsDNA是采用間接免疫熒光法檢測的。其實，對于SLE的特異性抗體的檢測，優(yōu)先推薦ELISA、蛋白芯片或者化學(xué)發(fā)光法等重復(fù)性和穩(wěn)定性更好的檢測方法[11-12]。但是為了能夠篩查多種系統(tǒng)性結(jié)締組織病，目前中國的大型三甲醫(yī)院實驗室普遍都采用能夠一次性檢測多種自身抗體的Western blotting試劑。這種檢測方法相較于其他幾種方法的試劑靈敏度可能要差一些，并且由于多種抗體同時檢測也不能完全避免交叉反應(yīng)。但是Western blotting試劑能夠一次性同時檢測10多種自身抗體，縮短檢測時間，對于系統(tǒng)性結(jié)締組織病的篩查效率要明顯高于其他方法。本研究進(jìn)一步分別分析了這5種自身抗體單個陽性占整體陽性SLE患者的百分比，發(fā)現(xiàn)相比于ANuA和AHA，anti-P、anti-Sm和anti-dsDNA單個抗體陽性檢出率更高，單獨檢測的意義較大。

研究第二部分進(jìn)一步分析了anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA與SLE臨床特征的關(guān)系，由于每種抗體陽性組中同時也包含有其他陽性抗體，并沒有進(jìn)行兩兩抗體間臨床特征的比較，而是單純就某種抗體陽性和陰性組SLE患者的臨床表現(xiàn)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA陽性組患者發(fā)病年齡較陰性組更小(均P<0.05)，與 Olesińska等[13]的研究結(jié)果一致；而其中anti-P陽性組的發(fā)病年齡最小，中位年齡僅39歲。Reichlin等[14]的研究也顯示，anti-P在青少年期發(fā)病的SLE患者中陽性率為42%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成年期發(fā)病的SLE患者(7.7%)，進(jìn)一步證實了本研究的觀點。目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)其具體機(jī)制，僅發(fā)現(xiàn)年幼期發(fā)病的SLE患者anti-P陽性率更高并且臨床癥狀更嚴(yán)重，其具體原因還需深入探索。

本研究中，anti-P陽性和陰性組皮膚紅斑的發(fā)生率分別為31.3%和19.7%，差異顯著(P<0.05)，表明anti-P陽性與SLE患者皮膚損傷有關(guān)。國內(nèi)外也有研究發(fā)現(xiàn)，anti-P陽性的SLE患者面部紅斑和光敏感發(fā)生率更高[15]。與沒有皮膚病變的患者相比，有皮膚損傷的SLE患者自身抗體的陽性率更高，這可能與兩種特異性抗原(酸性核糖體P0蛋白和半乳凝素3)有關(guān)[16]，然而由這2種抗原介導(dǎo)的皮膚損傷的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。ANuA陽性組脫發(fā)發(fā)生率較陰性組顯著升高(P<0.05)。脫發(fā)是SLE患者常見的非特異性皮膚表現(xiàn)之一，其發(fā)生率為17.3%～54.0%，主要是非瘢痕性脫發(fā)，脫發(fā)是疾病加重的非特異性表現(xiàn)，還能預(yù)測SLE的復(fù)發(fā)[17]。目前關(guān)于自身抗體與SLE脫發(fā)這方面的研究并不多，查閱相關(guān)文獻(xiàn)后沒有發(fā)現(xiàn)ANuA與SLE脫發(fā)相關(guān)性的報道。但國內(nèi)的一項大樣本研究發(fā)現(xiàn)缺乏抗可提取核抗原抗體(包括ANuA) 的SLE患者，其脫發(fā)的患病率比其他患者低[18]。

LN是SLE患者最常見的并發(fā)癥，50%～70%的SLE患者發(fā)生臨床腎臟受累，腎功能衰竭也是重要死因。本研究結(jié)果顯示，anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性組SLE患者更容易出現(xiàn)LN，與其他研究結(jié)果一致[19]。anti-dsDNA是SLE高度特異性抗體，與dsDNA結(jié)合后形成免疫復(fù)合物沉積于腎臟，誘發(fā)免疫反應(yīng)，引起腎臟損傷。核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，組蛋白是核小體的重要組成部分，ANuA不僅能與染色質(zhì)表面暴露的組蛋白抗原表位結(jié)合，還能結(jié)合dsDNA及dsDNA與組蛋白相互作用產(chǎn)生的構(gòu)象表位，形成免疫復(fù)合物沉積于腎臟；其又在核小體的介導(dǎo)下使ANuA結(jié)合至腎小球基底膜上，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引起LN[20]。在SLE小鼠模型中，ANuA還可誘導(dǎo)AHA和anti-dsDNA的產(chǎn)生。因此，anti-dsDNA、ANuA和AHA三者相輔相成，共同導(dǎo)致LN的發(fā)生。

目前，臨床醫(yī)生主要通過SLEDAI評估SLE患者的疾病活動性。同時，在SLE患者中，自身抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后沉積在組織器官中，激活補(bǔ)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)從而降低血清補(bǔ)體水平，因此，補(bǔ)體C3、C4水平也常常用于反映SLE的活動性[21]。本研究中，除anti-Sm，anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性組的SLEDAI都顯著高于陰性組(有P<0.05)，說明這4種抗體都與SLE的疾病活動性有關(guān)。進(jìn)一步按照SLEDAI評分將5種抗體陽性組和陰性組的SLE患者再細(xì)分為無活動、輕、中、重度活動4組，發(fā)現(xiàn)anti-P和anti-dsDNA在4組患者的分布上差異顯著(均P<0.01)，ANuA在無活動和重度活動度患者中分布有顯著性差異(均P<0.01)，而AHA只在無活動患者中分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。在疾病活動度的分布上anti-P和anti-dsDNA有較好的一致性，中度和重度活動度患者在其陽性組中所占的百分比分別達(dá)72.4%和66.6%，說明anti-P可以和anti-dsDNA一樣作為反映SLE疾病活動度的指標(biāo)，并且陽性與SLE的高疾病活動度有關(guān)。C3、C4水平在5個抗體陽性組和陰性組之間都有顯著差異(均P<0.01)，并且與SLEDAI評分存在顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.01，r<-0.300)。但是C3、C4濃度在SLEDAI沒有顯著差異的anti-Sm陽性組和陰性組之間也存在統(tǒng)計學(xué)差異，并且與SLEDAI的相關(guān)性系數(shù)分別只有-0.395和-0.314，為弱負(fù)相關(guān)性。這說明補(bǔ)體C3、C4可在一定程度上反映SLE的疾病活動度，但直接作為SLE疾病活動度的判斷指標(biāo)可能還不夠理想。

綜上所述，anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA 和 AHA 對SLE的診斷具有較高的特異度，但靈敏度較差，聯(lián)合檢測可大大提高SLE的診斷準(zhǔn)確率。抗核抗體、抗磷脂抗體(包括抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白1抗體和狼瘡抗凝物)以及補(bǔ)體C3、C4對于SLE的診斷也具有重要意義，需同時檢測。相比于ANuA和AHA，anti-P、anti-Sm和anti-dsDNA單個抗體陽性率更高。anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA陽性的SLE患者發(fā)病年齡更小，anti-P陽性與SLE皮膚紅斑發(fā)生率有關(guān)，ANuA陽性與SLE脫發(fā)可能存在一定關(guān)聯(lián)，而anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性時LN的發(fā)生率更高。anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA都與SLE的疾病活動度有關(guān)，anti-P可以和anti-dsDNA一樣作為反映SLE疾病活動度的指標(biāo)，并且與SLE的高活動性有更大關(guān)聯(lián)。補(bǔ)體C3、C4可以在一定程度上反映SLE的疾病活動性，但直接作為SLE疾病活動度的判斷指標(biāo)可能還不夠理想。