佛坪自然保護(hù)區(qū)野生大熊貓寄生蟲風(fēng)險(xiǎn)分析

馬亦生，張振華，金藝鵬 ，陳原玉，趙凱輝，文一帆，韋思遠(yuǎn)，高宇航

(1.陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，陜西 漢中 723400；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是中國(guó)獨(dú)有的珍稀動(dòng)物資源，被列為國(guó)家I級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物和CITES附錄I級(jí)物種，主要分布于陜西、四川以及甘肅山區(qū)。近年來(lái)，我國(guó)在野生大熊貓保護(hù)及圈養(yǎng)大熊貓繁育方面均取得了顯著成效[1]。相較于圈養(yǎng)大熊貓，野生大熊貓很難得到良好的醫(yī)療管理，其平均壽命僅為18～20 a，遠(yuǎn)低于圈養(yǎng)大熊貓(30 a)。野生大熊貓死亡原因很多，其中與寄生蟲病不無(wú)關(guān)系。迄今，大熊貓疾病研究以圈養(yǎng)者為主，野生大熊貓疾病研究報(bào)道較少，且主要集中在消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、造血系統(tǒng)疾病、寄生蟲疾病等方面[2]，寄生蟲病研究雖一直進(jìn)行，但其感染情況、傳播途徑、發(fā)病機(jī)理依然不甚明確；迄今發(fā)現(xiàn)感染大熊貓的寄生蟲共計(jì)26種，晏培松等[3]、何承德等[4]在對(duì)死亡大熊貓進(jìn)行剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)了槽盤吸蟲蟲體，賴從龍等[5]檢測(cè)野外大熊貓糞便發(fā)現(xiàn)了大熊貓槽盤吸蟲卵，檢出率為0.48%(13/2680)，Liu C K等[6]在四川松潘大熊貓?bào)w內(nèi)檢出過(guò)犬鉤口線蟲雌蟲，楊光友等[7]研究發(fā)現(xiàn)野生大熊貓糞便中鉤蟲卵感染量可達(dá)93.3%(14/15)。姜泰京等[8]人在四川的大熊貓?bào)w內(nèi)采到線中殖孔絳蟲蟲體50余條。研究表明施氏貝蛔蟲是大熊貓(無(wú)論圈養(yǎng)還是野生)體內(nèi)最常見、危害最大的消化道寄生蟲，有致死危險(xiǎn)，且為大熊貓所獨(dú)有。

本研究對(duì)在陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)收集到的121份野生大熊貓糞便樣品，進(jìn)行寄生蟲形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)合糞便樣本地理位置信息，對(duì)寄生蟲在保護(hù)區(qū)內(nèi)的空間分布情況和不同寄生蟲之間的關(guān)系進(jìn)行探究，以期初步探明該保護(hù)區(qū)內(nèi)的大熊貓寄生蟲分布情況并評(píng)估其風(fēng)險(xiǎn)，為大熊貓保護(hù)和寄生蟲病防控提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 研究方法

1.1 糞便樣本的采集、保存與運(yùn)輸

1.1.1 樣本采集 2017年4月，在保護(hù)區(qū)的3個(gè)保護(hù)站(岳壩保護(hù)站、大古坪保護(hù)站、三官?gòu)R保護(hù)站)周邊，沿不同線路采集樣品。記錄每份樣品采集日期、糞便新鮮程度、采集地點(diǎn)的位置信息并編號(hào)。共在31條線路94個(gè)采樣點(diǎn)，收集野生大熊貓糞便樣本121份。

糞便新鮮程度的判定按照以下標(biāo)準(zhǔn):新鮮(1～3 d)：表面黏液完整，有光澤，觸摸光滑細(xì)膩，打開有清香竹味，表里色澤相同無(wú)霉菌;較新鮮(4～15 d)：表面無(wú)黏膜，出現(xiàn)少量霉菌，糞團(tuán)稍松散,干燥環(huán)境下表層薄紙狀略帶光澤黏膜;不新鮮(>15 d)：外形松散，有霉味，霉菌遍布表面，菌絲長(zhǎng)約1～2 cm;天氣干燥時(shí)呈干裂狀。

1.1.2 樣本保存與運(yùn)輸 將每天采集到的糞便樣本，每份分裝于5個(gè)5 ml 的離心管中，剩余部分放入塑封袋。全部樣本凍存于-20 ℃冰箱。在運(yùn)輸過(guò)程中用冰袋保持低溫。

1.2 樣本檢測(cè)

1.2.1 試劑與儀器 NaCl 固體(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),顯微鏡(DM 500，Leica), Leica Application Suite軟件。醫(yī)用紗布、糞杯、滴管、15 ml 離心管、50 ml 離心管、20 ml 試管、60目銅篩、蓋玻片、載玻片，均由北京愛(ài)普瑞晟科技有限公司提供。

1.2.2 樣本初步檢測(cè) 在管護(hù)站對(duì)每天采集到的大熊貓糞便樣品，采用直接滴片法和飽和鹽水漂浮法檢測(cè)。操作步驟如下:

(1) 糞便的外觀檢查

判斷糞便新鮮程度，記錄主要組成成分，檢查是否有肉眼可見的寄生蟲。

(2) 糞便鏡檢

取約2 g糞便(糞便中心位置)于糞杯中，加入10 ml清水 ，用滴管充分?jǐn)嚢杌靹?，?滴鏡檢，觀察并記錄糞便中是否有纖毛蟲、原蟲、線蟲幼蟲、蟲卵及其他。

(3) 分離鏡檢樣品

在(2)步驟的同時(shí)，另取2 g糞便(糞便中心位置)于糞杯中，加入10 ml飽和食鹽水，用滴管充分?jǐn)嚢杌靹?，?jīng)一層紗布過(guò)濾至15 ml離心管中，滴加飽和食鹽水至凸液面，將蓋玻片置于其上，靜置30 min后，取下蓋玻片放在載玻片上，供鏡檢。

(4)顯微鏡檢查

將蓋玻片放在載物臺(tái)中間，打開光源，先用4倍物鏡觀察，調(diào)節(jié)校準(zhǔn)焦螺旋至視野清晰，將視野放到蓋玻片左上角，按照由上到下、由左至右的方向有規(guī)律的掃查整個(gè)液面，當(dāng)看到疑似寄生蟲蟲卵或幼蟲的結(jié)構(gòu)時(shí)，將目標(biāo)放到視野中央，轉(zhuǎn)換為10倍物鏡觀察。記錄每份樣本的寄生蟲檢出情況。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查 在實(shí)驗(yàn)室，將存放在-20 ℃環(huán)境下的樣本再次進(jìn)行顯微鏡復(fù)檢，并將糞便溶液濃縮，以提高寄生蟲的檢出率。鏡檢時(shí)，及時(shí)對(duì)發(fā)現(xiàn)的寄生蟲(卵)進(jìn)行拍照記錄。操作方法如下：

(1)水洗沉淀法

取約5 g糞便于糞杯中，加入50 ml清水，充分?jǐn)嚢杌靹颍?jīng)60目銅篩過(guò)濾至50 ml離心管中，靜置30 min，棄上清45 ml。反復(fù)3次。

(2)飽和鹽水漂浮

將上步剩余的5 ml液體，用移液槍轉(zhuǎn)移到20 ml 試管中，加飽和食鹽水至凸液面，靜置30 min。用滴管蘸取試管凸液面表面液體至1.5 ml EP管中。每份樣品約收集糞便溶液100～200 ul。

1.3 寄生蟲形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)

根據(jù)顯微鏡下觀察到的形態(tài)學(xué)特征，對(duì)寄生蟲進(jìn)行分類。為保證檢出結(jié)果更為有效，將顯微鏡下觀察到的生命體分為施氏貝蛔蟲蟲卵、槽盤吸蟲蟲卵、其他蟲卵、線蟲幼蟲、原蟲、真菌、花粉、節(jié)肢動(dòng)物等8種。

施氏貝蛔蟲：屬于線蟲動(dòng)物門(Nemetoda)尾感器綱(Phasmida) 蛔目(Ascaridida)蛔科(Ascaridida)貝蛔屬(Baylisascaris)，常寄生于大熊貓小腸內(nèi)，但在口腔、氣管和胃內(nèi)都曾發(fā)現(xiàn)成蟲。貝蛔屬的蟲卵具有明顯特征:形狀為兩頭圓潤(rùn)的橢圓形，黃色或暗黃色，長(zhǎng)度約67～83 μm，寬度54～77 μm。卵殼比其他線蟲卵厚很多，有三層膜結(jié)構(gòu)。內(nèi)膜薄而透明，不易觀察到;第二層為較厚透明的幾丁質(zhì)外殼;最外層為蛋白質(zhì)外殼，其上有密集的高約為5.67～10.80 μm的棘狀突起，可根據(jù)這一特征區(qū)分施氏貝蛔蟲蟲卵與其他蟲卵。若在檢查中觀察到該形態(tài)的蟲卵，則記為施氏貝蛔蟲蟲卵陽(yáng)性。

槽盤吸蟲：屬于扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)吸蟲綱(Trematoda)復(fù)殖目(Digenea)背孔科(Notocotylidae) 槽盤屬(Ogmocotyle)，是引起大熊貓吸蟲病的主要病原，成蟲寄生于大熊貓十二指腸內(nèi)。槽盤吸蟲蟲卵呈長(zhǎng)20 μm，寬15 μm的橢圓形，蟲卵兩端各有一條卵絲，長(zhǎng)短不一。若在檢查中觀察到該形態(tài)的蟲卵，則記為槽盤吸蟲蟲卵陽(yáng)性。

其他蟲卵：若在顯微鏡中觀察到有膜結(jié)構(gòu)且內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰的蟲卵，記為其他蟲卵陽(yáng)性。

線蟲幼蟲：將在顯微鏡中觀察到的活動(dòng)性強(qiáng)、呈線條狀，能區(qū)分頭部、尾部，且蟲體內(nèi)部能看清消化道結(jié)構(gòu)的幼蟲，記為線蟲幼蟲陽(yáng)性。

原蟲：可感染野生動(dòng)物的原蟲種類眾多，形態(tài)各異[4]。僅對(duì)糞便中觀察到的滴蟲和球蟲做記錄。在直接滴片時(shí)觀察，可見游走性強(qiáng)的蟲體;在400倍鏡下，可見卵囊。

真菌：對(duì)保護(hù)區(qū)內(nèi)正常生長(zhǎng)的竹子和散落的竹葉進(jìn)行觀察，若出現(xiàn)真菌的結(jié)構(gòu)，則記為真菌陽(yáng)性。

花粉：觀察保護(hù)區(qū)環(huán)境中的花粉顆粒，若出現(xiàn)花粉的結(jié)構(gòu)，則記為花粉陽(yáng)性或真菌陽(yáng)性。

節(jié)肢動(dòng)物：將在糞便中觀察到螨蟲或螨蟲卵的記為節(jié)肢動(dòng)物陽(yáng)性。

1.4 制圖和風(fēng)險(xiǎn)分析

利用ArcToolbox進(jìn)行施氏貝蛔蟲分布制圖和風(fēng)險(xiǎn)分析。

2 研究結(jié)果

2.1 施氏貝蛔蟲檢測(cè)情況

實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)Leica Application Suite 軟件連接顯微鏡，記錄、測(cè)量了20個(gè)施氏貝蛔蟲的蟲卵。蟲卵呈黃色或棕黃色，橢圓形;卵殼表面有棘狀突起。根據(jù)鄔捷[9]等人對(duì)施氏貝蛔蟲蟲卵發(fā)育期的觀察，可知熊貓蛔蟲蟲卵的整個(gè)發(fā)育過(guò)程可分為八個(gè)時(shí)期:原胚期、二球期、四球期、八球期、桑葚期、囊胚期、蝌蚪期和幼蟲期。在本研究中，可見原胚期、二球期、四胚期和囊胚期蟲卵。此外，試驗(yàn)測(cè)量的20個(gè)蟲卵的大小，其長(zhǎng)65.1～93.6 μm(平均82.6 μm)，寬47.8～62.8 μm(平均55.5 μm)，與已有的形態(tài)學(xué)研究結(jié)果一致。

2.2 寄生蟲檢出情況

在陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)收集的121份野生大熊貓糞便樣本中，28份未檢出寄生蟲，93份檢出寄生蟲，總檢出率為76.1%。

121份樣本中，33份樣本中檢出施氏貝蛔蟲蟲卵、檢出率27.3%，5份樣本中檢出槽盤吸蟲蟲卵、檢出率4.1%，42份樣本檢出其他蟲卵、檢出率34.7%，61份樣本中檢出線蟲幼蟲、檢出率50.4%，16份樣本中檢出有原蟲、檢出率14.0%。另外，21份樣本中檢出節(jié)肢動(dòng)物，2份樣本中檢出真菌，31份樣本中檢出花粉。 說(shuō)明不同寄生蟲的檢出率差別較大，其中，線蟲幼蟲的檢出率最高，對(duì)大熊貓潛在危害最大的施氏貝蛔蟲檢出率也較高，槽盤吸蟲蟲卵檢出率最低，高于賴從龍等[5]人在20世紀(jì)九十年代得出的檢出率。整體來(lái)看，佛坪保護(hù)區(qū)大熊貓糞便寄生蟲寄生狀況好于現(xiàn)有研究報(bào)道的區(qū)域。

A 蟲卵原胚期 B 蟲卵二球期 C 蟲卵四球期 D 蟲卵囊胚期圖1 施氏貝蛔蟲(400倍)

圖2 采樣點(diǎn)分布圖

2.3 不同新鮮程度樣本寄生蟲檢出情況

從不同新鮮程度樣本的寄生蟲檢出率圖(圖3)看出，施氏貝蛔蟲蟲卵、槽盤吸蟲蟲卵和真菌的檢出率新鮮樣本最高，其他蟲卵、線蟲幼蟲和原蟲較新鮮樣本檢出率最高?？赡苁且?yàn)殡S著時(shí)間的推移，外界環(huán)境(主要是土壤和氣候)對(duì)糞便產(chǎn)生的影響。對(duì)于糞便中的微生物(如大腸桿菌)來(lái)說(shuō)，施氏貝蛔蟲、槽盤吸蟲和真菌的蛋白質(zhì)外殼是很好的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以在微生物大量增殖的過(guò)程中，出現(xiàn)了較新鮮(4～15 d)組施氏貝蛔蟲、槽盤吸蟲和真菌的檢出率低于新鮮組(1～3 d)的結(jié)果。某些腸道寄生線蟲在隨糞便排出體外后，會(huì)在適宜的溫度、濕度下，迅速發(fā)育，成長(zhǎng)為線蟲幼蟲;同時(shí)土壤中本來(lái)存在的某些線蟲，會(huì)進(jìn)入到營(yíng)養(yǎng)較為豐富的糞便中，利用所需能量后離去;而原蟲在糞便剛排出體外時(shí)活力很強(qiáng)，在短時(shí)間內(nèi)利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增殖，但其對(duì)生存的環(huán)境溫度等要求較為嚴(yán)格，因此在體外無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間生存。這可能是導(dǎo)致線蟲幼蟲、其他蟲卵和原蟲在較新鮮組的檢出率最高的原因。

圖3 不同新鮮程度分組的寄生蟲檢出率比較

新鮮組和非新鮮組(較新鮮組和不新鮮組的總和)的寄生蟲檢出率分析比較結(jié)果為，新鮮組和非新鮮組的蛔蟲蟲卵、槽盤吸蟲蟲卵、其他蟲卵、線蟲幼蟲和原蟲的P值分別為0.023(P<0.05)、0.02(P<0.05)、0.032(P<0.05)、0.004(P<0.05)和 0.703 (P>0.05)，說(shuō)明除原蟲外，野生大熊貓糞便的新鮮程度對(duì)其中寄生蟲的檢出結(jié)果會(huì)造成顯著影響。

2.4 寄生蟲風(fēng)險(xiǎn)分析

從利用 ArcToolbox制作的保護(hù)區(qū)施氏貝蛔蟲空間分布圖(圖4)可看出，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的“熱點(diǎn)”(置信度95%)集中在三官?gòu)R站區(qū)內(nèi)，而“冷點(diǎn)”集中在岳壩站區(qū)內(nèi)(置信度90%～95%)，在其他地段沒(méi)有顯著的高值或低值的空間聚類。

圖4 檢出施氏貝蛔蟲樣本的冷熱點(diǎn)

4 結(jié)論與討論

佛坪自然保護(hù)區(qū)野生大熊貓糞便中存在多種寄生蟲，其總檢出率76.1%，其中，施氏貝蛔蟲蟲卵檢出率27.3%，槽盤吸蟲蟲卵檢出率4.1%，原蟲檢出率14.0%，其他蟲卵檢出率34.7%，線蟲幼蟲檢出率35.7%。除原蟲外，糞便新鮮程度對(duì)寄生蟲的檢出結(jié)果會(huì)造成顯著影響。大熊貓獨(dú)有且體內(nèi)最常見、危害最大的消化道寄生蟲——施氏貝蛔蟲分布“熱點(diǎn)”在三官?gòu)R站區(qū)。

野生大熊貓施氏貝蛔蟲分布“熱點(diǎn)”就是具有統(tǒng)計(jì)意義的高值聚集空間，如果某處出現(xiàn)蛔蟲檢出結(jié)果呈陽(yáng)性，則周圍極也可能出現(xiàn)陽(yáng)性，也就是說(shuō)在“熱點(diǎn)”范圍內(nèi)，若有一處爆發(fā)蛔蟲病，則很可能會(huì)波及周圍地區(qū)，造成嚴(yán)重的后果。佛坪保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲分布“熱點(diǎn)”——三官?gòu)R站區(qū)域，處于核心區(qū)與緩沖區(qū)交界帶，常年有多只大熊貓活動(dòng)，應(yīng)強(qiáng)化該區(qū)域的監(jiān)測(cè)監(jiān)控措施。 本次研究將糞便的新鮮程度作為關(guān)鍵因素探究分析了不同新鮮程度下野生大熊貓糞便樣本的寄生蟲檢出情況，結(jié)論為野生大熊貓糞便新鮮(1～3 d)狀態(tài)下的檢測(cè)結(jié)果的可信度更高，忽略糞便新鮮程度的檢測(cè)結(jié)果不能準(zhǔn)確反映大熊貓寄生蟲感染情況，故野生大熊貓寄生蟲病風(fēng)險(xiǎn)分析研究，應(yīng)該采集新鮮(表面黏液完整，有光澤，觸摸光滑細(xì)膩，打開有清香竹味，表里色澤相同無(wú)霉菌)糞便。