蒸制工藝對酒女貞子外觀性狀和主要成分的影響△

徐文娟，董海鵬，韓婷，屈文佳，李春帥，魏鋒，李向日*，林瑞超

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥炮制研究中心/北京市中藥品質評價重點實驗室，北京 102488；2.國家知識產權局 專利局復審和無效審理部，北京 100088；3.中國食品藥品檢定研究院 中藥民族藥檢定所，北京 100050

女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實，始載于《神農本草經(jīng)》，列為上品，具有滋補肝腎、明目烏發(fā)之效[1-2]。女貞子經(jīng)酒蒸或酒燉為酒女貞子后，其“形如女貞子，表面黑褐色或灰黑色，常附有白色粉霜，微有酒香氣”[1]。傳統(tǒng)認為[3]，女貞子生品性涼，可清肝明目、滋陰潤燥，用于治療肝熱目眩、陰虛腸燥便秘等癥，如菊女飲（《辨證錄》）、女貞湯（《醫(yī)醇剩義》）等。酒制后，補肝腎作用增強且其寒涼之性得以緩解，多用于腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥，如二至丸（《醫(yī)方集解》）、繆仲淳烏發(fā)明目丸（《續(xù)名醫(yī)類案》）等。酒女貞子在現(xiàn)代臨床應用廣泛，可用于治療慢性肝炎、高脂血癥、更年期綜合征、老年性便秘、不孕、心悸等，亦可作為放化療輔助藥物。

女貞子主要活性成分為萜類、苯乙醇苷類和黃酮類化合物，具有抗骨質疏松、抗腫瘤、保肝、調節(jié)免疫、降血糖、調血脂、抗炎、抗菌、抗衰老等作用[4]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，酒制對脂溶性萜類齊墩果酸、熊果酸含量無明顯影響[5]，但對環(huán)烯醚萜類與苯乙醇類等化合物含量影響顯著。酒制的24 h 內，環(huán)烯醚萜類化合物除女貞酸含量逐漸升高后趨于穩(wěn)定外，特女貞苷、女貞苷、橄欖苦苷等含量均有降低的趨勢[6-7]；除松果菊苷、毛蕊花糖苷等含量下降外，多數(shù)苯乙醇類化合物含量呈現(xiàn)上升或先升后降的趨勢[5,7-8]。女貞子酒制后，其藥理作用也發(fā)生了明顯的變化，抗骨質疏松、抗炎抑菌、升白、調節(jié)免疫等作用增強，并減緩了腸道的蠕動，可緩解生品所致滑腸瀉下的不良反應[9-10]?？梢?，女貞子與酒女貞子在化學成分和藥理作用上存在明顯差異。然而，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015年版中女貞子、酒女貞子均以特女貞苷作為含量測定的指標成分，且含量限度一致，均為“含特女貞苷（C31H42O17）不得少于0.70%”，難以體現(xiàn)女貞子酒制的炮制原理，亦難以全面評價酒女貞子的質量，無法保證臨床有效用藥。

評價中藥質量的方法主要包括傳統(tǒng)鑒別法和有效成分含量評價法，兩者各有利弊。前者主觀性強，難以統(tǒng)一標準，后者因忽略性狀，常被指責為“唯成分論”，結合兩者優(yōu)勢，才能更加全面客觀評價中藥質量。課題組前期對女貞子藥材的性狀與化學成分之間的關系進行研究，發(fā)現(xiàn)女貞子成分與其顏色、百粒質量等存在一定關系[11-12]。本研究基于前期研究，進一步探究酒女貞子在蒸制過程中，其外觀性狀（顏色、白霜）及特女貞苷、紅景天苷、酪醇、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蘆丁6 個成分含量的變化規(guī)律（圖1），并對《中國藥典》2015 年版酒女貞子含量測定的方法提出建議。

圖1 女貞子中6個成分結構

1 材料

1.1 儀器

Waters 2489 型高效液相色譜儀；Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；FW-100型高速萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）；KQ-600DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AG 型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；PANTONE 色卡C 版（深圳千通彩色彩管理有限公司）。

1.2 試藥

對照品特女貞苷（批號：111926-201404，純度：97.3%）、紅景天苷（批號：110818-201708，純度：98.8%）、蘆?。ㄅ枺?000-200702，純度：90.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品松果菊苷（批號：16102103，純度≥98.0%）、毛蕊花糖苷（批號：16102103，純度≥98.0%）均購自成都普菲德生物技術有限公司；對照品酪醇（批號：J0621RA13，純度≥98.0%）購自上海源葉生物技術有限公司；甲醇為色譜純；娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

女貞子藥材（產地：河南，批號：022170501）由河北橘井藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學李向日教授鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實。

2 方法

2.1 不同蒸制時間酒女貞子樣品的制備

參照《中國藥典》2015 年版及《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008 年版中的炮制方法對女貞子藥材進行炮制，分別蒸制2、6、12、16、20、24 h，干燥，得不同蒸制時間的酒女貞子樣品。

2.2 蒸制時間對酒女貞子外觀性狀的影響

觀察酒女貞子顏色及白霜隨蒸制時間的變化，并結合PANTONE色卡對其顏色進行評價。

2.3 蒸制時間對酒女貞子中主要成分的影響

按照課題組前期研究建立的方法，對酒女貞子中特女貞苷、紅景天苷、酪醇、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蘆丁的含量進行測定[11]。

2.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）為流動相，梯度洗脫（0～15 min，4%A；15～35 min，4%～6%A；35～60 min，6%～15%A；60～100 min，15%～20%A；100～130 min，20%～40%A）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長分別為230、350 nm；進樣量為10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別取對照品特女貞苷、紅景天苷、酪醇適量，精密稱定，加入甲醇稀釋至特女貞苷、紅景天苷、酪醇分別為0.33、0.31、0.36 mg·mL-1的混合對照品溶液（a）；分別取對照品松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷適量，精密稱定，加入甲醇稀釋至松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷分別為0.31、0.30、0.31 mg·mL-1的混合對照品溶液（b）。

2.3.3 供試品溶液的制備 取女貞子樣品中粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min。再次稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 樣品含量測定 自制酒女貞子樣品中粉按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件測定，計算樣品含量。

3 結果與分析

3.1 蒸制時間對酒女貞子外觀性狀的影響

不同蒸制時間的酒女貞子樣品見圖2，性狀結果見表1。由圖2及表1可知，在蒸制過程中，隨著蒸制時間的延長，女貞子的顏色逐漸加深，酒蒸0～6 h，其顏色由棕褐色轉變?yōu)楹诤稚?，并伴有少量白霜；酒?～12 h，顏色變?yōu)榛液谏?，白霜明顯可見；酒蒸12～24 h，酒女貞子性狀無明顯變化；自制酒女貞子均微有酒香氣。有研究表明，白霜為齊墩果酸，酒制可使女貞子質地酥脆，促進齊墩果酸的溶出，從而增強療效[13]。女貞子酒蒸過程中顏色加深可能與其發(fā)生美拉德反應有關，有研究發(fā)現(xiàn)，女貞子在酒燉24 h內，其多糖及多數(shù)環(huán)烯醚萜類化合物含量呈下降趨勢[5-7]，水溶性低分子糖含量在酒燉0～24 h內呈升高趨勢而后顯著下降[5]，5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量逐漸升高且在酒燉20 h后含量升高最為明顯[5]，表明女貞子酒制過程中多糖及環(huán)烯醚萜苷類化合物水解產生的低分子糖可能參與美拉德反應，從而導致飲片顏色加深。另外，環(huán)烯醚萜苷類化合物水解產生的苷元可進一步發(fā)生氧化、聚合等反應，亦有可能導致女貞子酒制過程中顏色發(fā)生變化[14]。綜上，女貞子酒蒸過程中顏色變化可能與其多糖及環(huán)烯醚萜類成分存在一定關系，后續(xù)可量化顏色指標，對此進一步研究[15-16]。女貞子酒蒸6～24 h 后，其外觀性狀符合《中國藥典》2015 年版酒女貞子性狀標準，表明酒女貞子的蒸制時間應不少于6 h。

表1 不同蒸制時間酒女貞子性狀

圖2 不同蒸制時間的酒女貞子樣品

3.2 蒸制時間對酒女貞子中主要成分的影響

女貞子及不同蒸制時間的酒女貞子樣品6 個成分含量測定結果見表2 及圖3。由表2 及圖3 可知，隨著蒸制時間的延長，裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分特女貞苷含量顯著下降，苯乙醇類成分紅景天苷、酪醇含量隨之升高，與文獻[5-7]報道結果一致，這與特女貞苷水解生成紅景天苷，紅景天苷進一步水解轉化為酪醇有關[6]，其轉化規(guī)律見圖4。亦有研究表明，紅景天苷、酪醇含量的升高與女貞苷G13、女貞苷、女貞次苷、oleopolynuzhenide A、oleonuezhenide 等環(huán)烯醚萜類化合物的水解有關；另外，隨著時間的延長，苯乙醇類成分松果菊苷、毛蕊花糖苷含量也呈現(xiàn)下降的趨勢；黃酮類成分蘆丁含量較少且略有下降[17]。

圖3 酒女貞子蒸制過程中6個成分的含量變化

圖4 特女貞苷的水解

表2 不同蒸制時間酒女貞子的含量測定結果（n=2） %

目前，已明確酒女貞子蒸制過程中特女貞苷、紅景天苷、酪醇三者間的轉化關系；結構上，松果菊苷僅比毛蕊花糖苷多1 分子葡萄糖，表明松果菊苷在女貞子蒸制過程中可能發(fā)生水解生成毛蕊花糖苷；松果菊苷、毛蕊花糖苷受熱水解可生成羥基酪醇、咖啡酸等化合物，蘆丁受熱水解可生成槲皮素。采用SPSS 23.0 統(tǒng)計分析軟件對酒女貞子蒸制過程中6 個成分含量的變化趨勢進行相關性分析，結果見表3。從表3 中可以發(fā)現(xiàn)，6 個成分含量變化呈強相關，表明6 個成分間在含量變化趨勢上存在相關性。目前未見女貞子產生不良反應的相關報道，其經(jīng)酒制后療效增強與有效成分含量升高關系密切。由于紅景天苷、酪醇含量變化趨勢成極顯著正相關（Y=0.1X+0.05，r=0.849）且酪醇含量較低，而紅景天苷含量較高、活性強，具有保肝、保腎、保護神經(jīng)系統(tǒng)、保護心血管、抗衰老[18]等作用，與酒女貞子的功效一致，說明紅景天苷是酒女貞子的主要藥效成分，故建議將紅景天苷作為酒女貞子含量測定的指標成分。

表3 酒女貞子蒸制過程中各成分含量變化的相關性分析

《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008 年版規(guī)定，酒女貞子蒸制時間為15～24 h[19]。本研究表明，女貞子酒蒸6～24 h 后，其外觀性狀符合《中國藥典》2015 年版酒女貞子性狀標準，同時，紅景天苷含量隨酒蒸時間的增加而不斷升高，進一步證實《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008 年版對女貞子酒蒸時間規(guī)定的科學性與合理性。

4 討論

本實驗基于前期研究基礎，研究酒女貞子在蒸制過程中外觀性狀及特女貞苷、紅景天苷、酪醇等6 個成分含量的變化規(guī)律。結果表明隨蒸制時間的增加，酒女貞子顏色逐漸加深，酒蒸6～24 h的樣品符合《中國藥典》2015 年版酒女貞子性狀標準，蒸制時間超過12 h 時，酒女貞子的性狀不再發(fā)生明顯變化。6 個成分除蘆丁含量略有下降外，紅景天苷、酪醇的含量呈升高趨勢，特女貞苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量呈現(xiàn)下降趨勢，可見，酒女貞子與女貞子間成分含量差異顯著。而《中國藥典》2015年版并未對女貞子及酒女貞子的含量測定方法及限度標準進行區(qū)分，難以體現(xiàn)女貞子酒制的炮制原理。因此，有必要重新建立酒女貞子含量測定的方法，從而規(guī)范炮制工藝、提升飲片質量。關聯(lián)各成分含量變化趨勢，發(fā)現(xiàn)每2 種成分含量變化均成強相關（P＜0.01），由于紅景天苷含量相對較高、活性強，且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，各批次女貞子及酒女貞子中特女貞苷的含量差異較大，故建議用紅景天苷替換特女貞苷作為酒女貞子含量測定的指標成分。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論以藥物的外觀性狀認知藥性，而藥物的功效則是對藥性的具體體現(xiàn)，現(xiàn)代中藥理論多以藥效物質基礎即化學成分組成與含量確定藥物的作用[20]，古今分別通過外觀性狀和化學成分說明藥物的藥性、作用，可見，藥物的外觀性狀與其內在成分存在一定相關性，通過炮制，藥物的外觀性狀達到古人要求的同時，其內在成分也會發(fā)生相應轉化，從而使得藥物發(fā)揮作用的側重有所不同。女貞子生用以“清虛熱”，酒制后則用以“補肝腎”。本研究發(fā)現(xiàn)，女貞子在酒制過程中外觀性狀、內在成分均發(fā)生了顯著變化。目前，對于女貞子炮制過程中成分轉化機制的研究較多，關于其外觀性狀變化研究及外觀性狀變化與內在成分間關聯(lián)研究的報道則相對較少。通過文獻研究發(fā)現(xiàn)，女貞子酒制過程中顏色變化可能與其受熱發(fā)生美拉德反應有關，美拉德反應廣泛存在于食品加工及中藥炮制的過程中，其反應過程主要為還原糖等羰基化合物和氨基酸等氨基化合物之間經(jīng)縮合、聚合等反應生成類黑精等褐色物質，是一種非酶褐變反應，可導致食品或中藥色澤、香味等發(fā)生變化[21]。多糖、環(huán)烯醚萜苷類化合物水解產生的小分子糖可為美拉德反應提供豐富的底物，環(huán)烯醚萜苷水解生成的酚類化合物可增強體系酸性，從而加快美拉德反應的速度[21]。此外，環(huán)烯醚萜苷類化合物水解產生的苷元可發(fā)生氧化、聚合等反應，亦有可能導致女貞子酒制過程中顏色發(fā)生變化。綜上表明，女貞子酒蒸過程中的顏色變化與其多糖、環(huán)烯醚萜苷類等成分相關，后續(xù)可將顏色指標量化，與多糖、環(huán)烯醚萜苷類等成分含量及美拉德反應理化參數(shù)進行相關性分析，進一步闡釋女貞子酒制的炮制機制。