采后晾曬過程中西洋參人參皂苷含量變化規(guī)律研究△

楊小彤，冉志芳，林鶯，周潔

1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355；2.濟南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟南 250022；3.濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺 264003

在采后干燥過程中，尤其是早期晾曬階段，中藥材體內(nèi)發(fā)生著復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，其有效成分含量變化較大。這一過程對藥材質(zhì)量的影響不容小覷，而這一環(huán)節(jié)往往被忽視，相關(guān)研究非常薄弱，嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量。

西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根，具有補氣養(yǎng)陰、清熱生津之功效[1]，在我國有300 余年的藥用歷史，屬名貴藥材。人參皂苷類成分具有抗腫瘤、抗心律失常及抗氧化等藥理活性[2]，是西洋參中主要活性成分，也是衡量藥材品質(zhì)的重要指標(biāo)[1,3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同干燥方法直接影響西洋參人參皂苷類成分的含量，從而影響藥材品質(zhì)[4-6]。人參皂苷作為西洋參體內(nèi)的次生代謝物，是經(jīng)過一系列限速酶和關(guān)鍵酶共同作用產(chǎn)生的[7]。西洋參離開土壤進行采后干燥的過程，尤其是早期晾曬階段，對植物體來說是一個抵御外界干旱脅迫的過程。有研究報道，適當(dāng)?shù)母珊得{迫可以增加西洋參根中人參皂苷類成分的含量[8]，說明人參皂苷在植物抵御干旱脅迫方面可能扮演著重要角色。由此推測，在采后晾曬早期過程中西洋參體內(nèi)人參皂苷參與抵御干旱脅迫，其含量可能會增加?；诖?，本研究以新鮮西洋參根為研究對象，采用“單株切分”法研究不同干燥方法（自然晾曬、鼓風(fēng)干燥和真空冷凍干燥）對同一株西洋參根的脫水速率和人參皂苷含量積累的影響，并進一步研究不同自然晾曬方式（整株晾曬和切片晾曬）對西洋參根脫水速率及人參皂苷含量積累的影響，以期為揭示西洋參采后晾曬過程中人參皂苷類成分的含量變化規(guī)律提供參考。

1 材料

1.1 試藥

新鮮西洋參根于2019 年10 月采自山東省文登市葛家鎮(zhèn)（N37°5′30.97″，E121°48′11.53″），由濟南大學(xué)周潔教授鑒定為五加科西洋參Panax quinquefoliumL.的根。采集后立即送回實驗室，進行不同干燥方法（自然晾曬、鼓風(fēng)干燥和真空冷凍干燥）和不同自然晾曬方式（整株晾曬和切片晾曬）處理。

對照品人參皂苷Rg1（批號：DST180323-009，純度≥98%）、人參皂苷Re（批號：DET180226-014，純度≥99%）、人參皂苷Rb1（批號：DST180131-006，純度≥98%）、人參皂苷Rd（批號：DST180302-015，純度≥98%）、人參皂苷Rh1（批號：DST180905-035，純度≥98%）、人參皂苷Rb2（批號：DST180426-007，純度≥98%）均購于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈（色譜純，美國TEDIA 公司）；甲醇、磷酸（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；超純水為實驗室自制。

1.2 儀器

U3000 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；SB-5200DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Hei-VAP 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德祥科技有限公司）；DLSK-10/20 型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SHK-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；FA1104型分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；DFT-250 型250 克手提式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；LYO-1型真空冷凍干燥機（上海東富龍科技有限公司）；GFL-125 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津萊玻特儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

隨機挑選6 株健康無損、大小均一的新鮮西洋參根，除去表面泥沙和須根，采用“單株切分”法進行干燥處理，即分別將每株西洋參根縱切成三等份，分別采用自然晾曬法（將西洋參根平鋪于室內(nèi)通風(fēng)處自然晾曬至質(zhì)量不再變化）、鼓風(fēng)干燥法（將西洋參根平鋪于電熱鼓風(fēng)干燥箱托盤中，40 ℃條件下烘干至質(zhì)量不再變化）及真空冷凍干燥法（將西洋參根置于真空冷凍干燥機中，-40 ℃條件下凍干至質(zhì)量不再變化）。

隨機挑選12 株健康無損、大小均一的新鮮西洋參根，除去表面泥沙和須根，隨機分為2 組，每組6 株，分別采用整株晾曬法（保持整株狀態(tài)，置于室內(nèi)通風(fēng)處自然晾曬至質(zhì)量不再變化）和切片晾曬法（將西洋參根快速切成約2 mm 薄片，平鋪于室內(nèi)通風(fēng)處自然晾曬至質(zhì)量不再變化）。上述處理中，每24 h 稱定樣品質(zhì)量，待根部完全干燥后，分別粉碎，備用。

2.2 根脫水速率的測定

采用劉勇等[9]方法按公式（1）計算西洋參根的干基含水率（Mt），采用Falade 等[10]方法按公式（2）計算西洋參根的干燥速率（DR）。

上式中：wt為t時刻西洋參根的總質(zhì)量；m干為西洋參根的干質(zhì)量；DR 為干燥過程中在時間t和t-1 之間的干燥速率；Mt、Mt-1分別為t、t-1時刻西洋參根的干基含水率；Δt為時間間隔。

2.3 人參皂苷的含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rd、Rh1對照品適量，精密稱定，置于1 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，配制為人參皂苷Rg10.21 mg·mL-1、人參皂苷Re 0.12 mg·mL-1、人參皂苷Rb10.21 mg·mL-1、人參皂苷Rb20.16 mg·mL-1、人參皂苷Rd 0.21 mg·mL-1、人參皂苷Rh10.12 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 參照于京平等[11]方法配制西洋參供試品溶液，并對其稍加修改。精密稱取藥材粉末（過三號篩）0.5 g 于25 mL 量瓶中，加甲醇定容，50 ℃超聲提取50 min，靜置過夜，補足減失的甲醇，吸取上清液20 mL 于圓底燒瓶，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃揮干甲醇，加少量甲醇溶解，定容，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3 色譜條件 使用YMC-Pack ODA-A 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），按照《中華人民共和國藥典》2020 年版一部西洋參項下流動相洗脫比例梯度洗脫[1]，流速為1.0 mg·mL-1，檢測波長為203 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為20 μL，理論板數(shù)按人參皂苷Rb1峰計算應(yīng)不低于5000。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用單因素方差分析（One-way ANOVA）計算各處理間的統(tǒng)計學(xué)差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；對實驗結(jié)果進行主成分分析；利用系統(tǒng)聚類分析進行聚類分析，距離公式為平方歐式距離。使用Microsoft Excel 2016軟件進行圖表繪制。

3 結(jié)果

3.1 不同干燥方法和晾曬方式對西洋參根脫水速率的影響

不同干燥方法對西洋參根部脫水速率的影響見圖1A～B。西洋參根的初始干基含水率為1.92～2.12 g·g-1。自然晾曬過程中，西洋參根的干基含水率在0～96 h 持續(xù)下降，96～192 h 逐漸變緩，192 h后趨于平穩(wěn)；鼓風(fēng)干燥及真空冷凍干燥過程中，其干基含水率表現(xiàn)出相似的變化趨勢。自然晾曬、鼓風(fēng)干燥、真空冷凍干燥方法根達到安全含水率（10%）[9]的時間分別為215.30、171.25、132.21 h。從干燥速率曲線來看，這3 種干燥方法主要表現(xiàn)為降速干燥期及較短的恒速干燥期，無升速干燥期，自然晾曬、鼓風(fēng)干燥、真空冷凍干燥方法平均干燥速率分別為0.007、0.009、0.013 g·g-1·h-1。

不同自然晾曬方式中西洋參根部脫水速率存在明顯區(qū)別（圖1C～D）。西洋參根的初始干基含水率為2.10～2.22 g·g-1。整株晾曬過程中，西洋參根的干基含水率在0～312 h 平緩下降，312 h 后逐漸平穩(wěn)，根達到安全含水率的時間為352.79 h；且干燥速率曲線主要表現(xiàn)為一段較長的恒速干燥期，計算可得平均干燥速率為0.006 g·g-1·h-1。在切片晾曬過程中，西洋參根的干基含水率呈大幅度快速下降趨勢，且根達到安全含水率的時間為89.37 h，比整株晾曬時間縮短了74.67%；其干燥速率曲線主要表現(xiàn)為降速干燥期，平均干燥速率為0.018 g·g-1·h-1。

圖1 不同采后干燥處理下西洋參根部的干燥曲線和干燥速率曲線

3.2 不同干燥方法和晾曬方式對西洋參根中人參皂苷含量的影響

不同干燥方法對西洋參根中人參皂苷含量產(chǎn)生不同的影響，其結(jié)果見圖2。從人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1總質(zhì)量分?jǐn)?shù)來看，自然晾曬法較高（4.07%），真空冷凍干燥法次之（3.30%），鼓風(fēng)干燥法較低（2.26%）。從單體人參皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rb2和Rd）來看，自然晾曬法中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27.52、3.10 mg·g-1，顯著高于鼓風(fēng)干燥法78.98%（P＜0.05）、85.84%（P＜0.05），且較真空冷凍干燥法中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高30.63%（P＜0.05）、140.42%（P＜0.05）；自然晾曬法中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.80、12.36、4.34 mg·g-1，與鼓風(fēng)干燥法相比提高了32.01%（P＜0.05）、86.64%（P＜0.05）、92.65%（P＜0.05）。

為進一步闡述西洋參人參皂苷在采后晾曬的早期階段參與抵御干旱脅迫，從而導(dǎo)致其含量增加的推測，本研究又比較了不同自然晾曬方式（整株晾曬和切片晾曬）對西洋參根中人參皂苷含量的影響，結(jié)果見圖2。整株晾曬法中西洋參根中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.19、12.17、1.33 mg·g-1，顯著高于切片晾曬法54.97%（P＜0.05）、17.27%（P＜0.05）、22.73%（P＜0.05）。整株晾曬法中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.05%，略高于切片晾曬（3.03%），差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？梢?，在采后晾曬過程中整株晾曬比切片晾曬方式更有利于提高人參皂苷類成分的積累。

圖2 采后干燥處理對西洋參人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響（,n=6）

3.3 聚類分析

為深入分析不同干燥方法和晾曬方式對采后西洋參根中人參皂苷含量的影響，本研究對人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd 進行主成分分析。Bartlett 球度檢驗顯示，相伴概率為0（P＜0.05），適合做因子分析。由表1可見，前3個主成分的特征值＞1，表明人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1這3 個因子在評價西洋參人參皂苷含量中累積方差貢獻率達92.630%，能夠較為客觀地評價指標(biāo)。因此，以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1這3 個主成分進行指標(biāo)評價，分析采后不同的干燥處理方式對西洋參根中人參皂苷類成分積累的影響?；谥鞒煞址治鰯?shù)據(jù)，對3 種干燥方法（鼓風(fēng)干燥、自然晾曬和真空冷凍干燥法）及2 種晾曬方式（整株晾曬及切片晾曬）進行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)歐式平方距離為20 時，這5 種干燥處理方式聚為2 類：第Ⅰ類是真空冷凍干燥、整株晾曬和自然晾曬法，第Ⅱ類是鼓風(fēng)干燥和切片晾曬法；當(dāng)歐式平方距離為7.5時，第Ⅰ類又可進一步分為2個小類：真空冷凍干燥和整株晾曬法聚為第Ⅰa類，自然晾曬法則聚為第Ⅰb類。

圖3 采后干燥處理對西洋參人參皂苷含量影響的聚類分析

表1 主成分的特征值及方差貢獻率

4 討論

藥材的采后干燥作為中藥材生產(chǎn)加工過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響藥材中活性成分的積累[12]。為消除植株個體間差異，本研究以同一株西洋參根為研究對象，采用“單株切分”法研究自然晾曬、鼓風(fēng)干燥和真空冷凍干燥不同干燥方法下西洋參脫水速率和人參皂苷類成分含量的變化，并研究整株晾曬和切片晾曬等不同自然晾曬方式下，西洋參脫水速率和人參皂苷類成分含量的變化。結(jié)果顯示，對同一株西洋參來說，采后自然晾曬法中人參皂苷類成分的含量明顯高于鼓風(fēng)干燥和真空冷凍干燥法中的含量，且西洋參整株晾曬過程中人參皂苷的含量大幅增加。目前，在西洋參生產(chǎn)上通常是將收獲的新鮮西洋參清洗干凈后，置于空曠處瀝干水分后再進行鼓風(fēng)干燥。瀝干水分的過程實際上也是一個自然晾曬的過程。結(jié)合本實驗的研究結(jié)果，建議西洋參自然晾曬時間為4 d，然后進行鼓風(fēng)干燥，這有利于西洋參中人參皂苷類成分的積累。

在自然晾曬過程中，西洋參體內(nèi)人參皂苷類成分的含量出現(xiàn)大幅度升高，這可能與植物抵御干旱脅迫有關(guān)。Lee 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在栽培過程中，適當(dāng)?shù)母珊得{迫可以提高西洋參根中人參皂苷的含量，表明人參皂苷類成分參與西洋參抗旱生理過程。對于西洋參根來說，離開土壤后的干燥過程，尤其是早期晾曬階段，是一個抵御干旱脅迫的過程，其體內(nèi)人參皂苷含量可能增加。本研究進一步研究了整株晾曬和切片晾曬對西洋參根部人參皂苷含量的影響，發(fā)現(xiàn)整株晾曬過程中西洋參根部人參皂苷類成分的含量明顯高于切片晾曬，說明整株晾曬方式更有利于激發(fā)抗旱響應(yīng)，因而更有利于促進西洋參中人參皂苷類成分的積累。本研究的結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果相吻合。例如，周銅水[13]研究發(fā)現(xiàn)，采后干燥過程中丹參根中次生代謝產(chǎn)物丹酚酸B 大量積累，黃芩根中次生代謝產(chǎn)物黃芩苷等類成分的含量明顯增加；焦廣睿等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪在采后陰干過程中黃酮類和皂苷類成分含量明顯升高。

關(guān)于采后西洋參中人參皂苷類成分積累的機制研究尚屬空白。從西洋參中人參皂苷的生物合成途徑來看，原人參二醇既可經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶催化生成原人參二醇型人參皂苷如人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd，也可被細(xì)胞色素氧化酶P450 中的原人參三醇合成酶羥基化生成原人參三醇，進而生成原人參三醇型人參皂苷如人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh1等。從本研究結(jié)果來看，采后整株晾曬與切片晾曬對不同類型的人參皂苷類成分的積累產(chǎn)生較大影響，這與相關(guān)生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的調(diào)控有關(guān)，相關(guān)機制有待深入研究。